Name: In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Leer in ovo-elektroporatie van miRNA-plasmiden in de neurale buis van kippenembryo's om genexpressie gericht te onderdrukken en axonale geleiding te bestuderen. Deze methode maakt celtypespecifieke genfunctie-analyse mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werken in het lab van ES wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation. We willen graag Dr Beat Kunz bedanken voor hulp bij het filmen.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
<li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21(2009).</li>
<li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific%2C+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133(2011).</li>
<li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li>
<li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze eenvoudige vector-gebaseerde kunstmatige miRNA expressie strategie kan worden gebruikt om knockdown endogene genexpressie in de kip neurale buis. Deze functionele tools bieden meerdere gene silencing, tijdelijke controle en cel-type specificiteit, de interpretatie van complexe ontwikkelingstrajecten te vergemakkelijken. In het bijzonder hebben we aangetoond dat de bruikbaarheid van deze plasmiden in commissurale axon leiding, aangezien de plasmiden kunnen worden gebruikt om verschillende genen knockdown in commissu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> 0,5 mm glazen capillairen </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Glas naald trekker </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Elektroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard siliconenelastomeer </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Wolfraamdraad, 0,075 mm </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Insect pennen, 0,20 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-20 </td></tr><tr><td> Insect pennen, 0,10 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-10 </td></tr><tr><td> Lente schaar </td><td> Fine Science Omolen </td><td> 15.003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.255-20 </td></tr><tr><td> Snel Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> TL-microscopen </td><td> Olympus </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo elektroporatie van mirna gebaseerde plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en beoordeling van de fenotypes van dil injectie in de open-boek voorbereidingen

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissurale DI1 neuronen zijn uitgebreid bestudeerd om de mechanismen axon begeleiding bij ontwikkeling 1,2 helderen. Deze neuronen in de dorsale ruggenmerg en sturen hun axonen langs stereotype trajecten. Commissurale axonen in eerste instantie ventraal projecteren richting en dan over de vloerplaat. Na het oversteken van de middellijn, deze axonen maken een scherpe bocht rostrale en project lengterichting naar de hersenen. Elk van deze stappen wordt geregeld door de gecoördineerde activiteiten van aantrekkende en afstotende begeleiding cues. De juiste interpretatie van deze signalen is cruciaal voor de begeleiding van axonen langs hun afgebakende pad. Aldus wordt de fysiologische bijdrage van een bepaalde molecule te commissurale axon begeleiding voorkeur onderzocht in de context van de levende embryo. Bijgevolg moet gen knockdown in vivo nauwkeurig worden gecontroleerd om zorgvuldig onderscheid te maken axon begeleiding activiteiten van genen die kunnen spelen meerdererollen tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een methode om knockdown genexpressie in de kip neurale buis op een celtype-specifieke, traceerbare wijze. We gebruiken novel plasmidevectoren 3 herbergen celtype-specifieke promoters / enhancers die de expressie van een fluorescerend eiwit marker rijden, direct gevolgd door een miR30-RNAi transcript 4 (binnen de 3&#39;-UTR van het cDNA dat codeert voor het fluorescent protein) ( figuur 1). Wanneer geëlektroporeerd in het ontwikkelende neurale buis, deze vectoren efficiënt opwekken downregulatie van genexpressie en expressie helder fluorescente merker eiwitten kunnen direct traceren van de cellen ervaren knockdown 3. Het mengen van verschillende RNAi vectoren voor elektroporatie kan gelijktijdig knockdown van twee of meer genen in onafhankelijke delen van het ruggenmerg. Dit maakt complexe cellulaire en moleculaire interacties worden onderzocht tijdens de ontwikkeling, op een manier die snel, suitvoering, nauwkeurig en goedkoop. In combinatie met Dil tracing van commissurale axon trajecten in open-boek voorbereidingen 5, deze methode is een handig hulpmiddel voor in vivo studies van de cellulaire en moleculaire mechanismen van commissurale axongroei en begeleiding. In principe kan elke promoter / enhancer worden gebruikt, mogelijk waardoor de techniek breder toepasbaar voor in vivo studies van genfunctie tijdens de ontwikkeling 6. Deze video toont eerst hoe naar en venster eieren, de injectie van DNA plasmiden in de neurale buis en de elektroporatie procedure. Om commissurale axon begeleiding te onderzoeken, wordt het ruggenmerg verwijderd van het embryo als een open boek voorbereiding, vast, en geïnjecteerd met Dil zodat axon paden te traceren. Het ruggenmerg wordt tussen dekglaasjes en gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie.

Een methode waarmee genexpressie in de neurale buis downgereguleerd in een celtype-specifieke, traceerbare wijze beschreven. We laten zien hoe<em&gt; In-ovo</em&gt; Elektroporatie van microRNA gebaseerde plasmiden spatiotemporeel gecontroleerde RNA interferentie opwekken kan worden gebruikt om commissurale axon begeleiding onderzoeken in ontwikkelingslanden neurale buis.

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

Commissurale dI1-neuronen zijn uitgebreid bestudeerd om de mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan axongeleiding tijdens de ontwikkeling1,2. Deze neuronen zijn ...

Het doel van deze procedure is om defecten in de axonale geleiding in de neurale buis van de kip te beoordelen, nadat de genexpressie op een celtype-specifieke en traceerbare manier is gedownreguleerd. Dit wordt bereikt door bevruchte kippeneieren voor in ovo elektroporatie voor te bereiden door een venster in de eischaal te snijden. De tweede stap bestaat uit het injecteren en elektroporeren van DNA-constructen die microRNA's coderen in de neurale buis.Vervolgens worden de spinal cords van de embryo's gedisseceerd en gefixeerd in flat mount open book-preparaten. De laatste stap is het injecteren van een fluorescerende kleurstof om de axonale projecties te visualiseren. Ten slotte wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om zowel de cellen te tonen waarin gene silencing plaatsvindt als om de daaropvolgende effecten op de commissurale axonbegeleiding te beoordelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de celtype-specifieke silencing van genen. Raadpleeg voor instructies over het maken van de plasmiden het geschreven protocol. Incubeer de eieren bij 38,5 °C en een luchtvochtigheid van rond de 45% tot het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Om de axonale geleiding van commissurale neuronen te bestuderen, worden de embryo's ongeveer drie dagen geïncubeerd tot zij het Hamburger-Hamilton stadium 17 tot 18 bereiken.Zodra het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt en voordat het eiwit van belang zich in het embryo ophoopt, worden de eieren uit de incubator gehaald en 20 minuten in een stabiele horizontale positie geplaatst om het embryo bovenop de dooier aan de bovenzijde van het ei te positioneren. Nadat de embryo's zich bovenop de dooier hebben gepositioneerd, worden de eieren uit de incubator gehaald en afgeveegd met 70%ethanol. Plaats vervolgens een strook tape langs de lange as van het ei en gebruik een scalpel om een klein gaatje te maken in het stompe uiteinde van het ei en een ander gaatje in de hoek van het gebied dat ge windowd moet worden.Steek vervolgens een spuit met een naald van 18 gauge onder een hoek van 45 graden in het gat aan het stompe uiteinde van het ei en aspireer ongeveer drie milliliters albumine, waarbij u er voorzichtig op let de dooier niet te beschadigen. Gebruik een kleine schaar die horizontaal wordt vastgehouden om het venster in het ei uit te snijden zonder het embryo te beschadigen. Sluit het venster vervolgens af met de tape.Gebruik tot slot een penseel om gesmolten paraffinewas aan te brengen om het gat aan de stompe zijde van het ei af te dichten en dicht eventuele barsten in het ei op dezelfde manier af. Plaats het ei vervolgens terug in de incubator. Herhaal dit proces bij alle eieren die ge-elektroporeerd moeten worden.Verwijder de tape van een van de eieren met venster en bepaal het stadium van het embryo volgens hamburger en Hamilton. Gebruik vervolgens een pincet om de extra-embryonale membranen op te tillen van de dorsale helft van het embryo in de regio waar de belangrijkste linker- en rechtervitellijnaderen lopen. Ga voorzichtig naar de romp, scheur of knip de membranen door met veerschaar en duw ze richting de staart.Gebruik nu een zachte zuigkracht om het te elektroporeren DNA-mengsel in een glazen microcapillair met bevestigde slang te laden. Voer het microcapillair in het centrale kanaal van de neurale buis vlak boven de achterpoten in en injecteer de DNA-oplossing, waarbij het injectievolume mondmatig wordt geregeld. De blauwe kleurstof moet zich verspreiden vanaf de punt van de staart tot aan de ventrikel van de ontwikkelende hersenen.Voeg een paar druppels steriele PBS toe bovenop het embryo en plaats de elektroden parallel aan de anteroposterieure as van het embryo zonder het embryo of bloedvaten aan te raken. Houd vervolgens de elektroden stil en voer de elektroporatie uit. Verwijder na de elektroporatie de elektroden en spoel snel met steriel water om gedenatureerde eiwitten uit het eiwit te verwijderen.Druppel tot slot nog wat steriele PBS op het embryo en sluit het ei vervolgens weer af met plakband. Zoals eerder vermeld, is een goede afdichting cruciaal om uitdroging van het embryo te voorkomen. Plaats het embryo daarna terug in de incubator totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt.Zodra het embryo Hamburger Hamilton-stadium 25 tot 26 heeft bereikt, gebruikt u een pincet om het embryo uit het ei te verwijderen en in een petrischaal te plaatsen die is gecoat met sil guard-elastomeer. Gebruik het pincet om de extra-embryonale membranen te verwijderen en leg het embryo met de dorsale zijde naar beneden. Gebruik nu insectenspeldjes van 0,2 millimeter om het embryo voorzichtig uit te strekken en vast te pinnen door de nek en staart.Zet vervolgens de ledematen van het embryo vast door de spelden onder een hoek in te brengen, zodat ze de daaropvolgende dissectie niet belemmeren. Verlicht de schaal met het embryo van onderaf, zodat de weefseldichtheid waarneembaar is. Gebruik veerschaartjes om de buikholte te openen en verwijder het hart en de inwendige organen door voorzichtig met een pincet te schrapen.Wanneer alle organen volledig zijn verwijderd, zullen de gesegmenteerde wervels en het ruggenmerg zichtbaar zijn. Draai het embryo vervolgens 180 graden en gebruik veerscharen om een ondiepe snee te maken door de wervels die over het ruggenmerg liggen bij de nek. Maak daarna twee korte longitudinale sneden door de wervels aan weerszijden van het ruggenmerg, van de nek tot de staart.Gebruik een pincet om de flapper-wervels van het ruggenmerg te tillen en pel vervolgens de wervels in één strook richting de staart af. Rek het embryo daarna voorzichtig uit en zet het opnieuw vast met spelden via de staart en de ledematen. Identificeer nu de hersenvliezen (meninges) van het ruggenmerg, die zichtbaar moeten zijn als een donkere, dichte lijn weefsel tussen de neurale buis en de dorsale wortelganglia, en gebruik vervolgens een ster-naald of een fijn microschirurgisch scalpel om de meninges longitudinaal langs beide zijden van het ruggenmerg door te snijden, van de nek tot de staart.De meninges zouden gemakkelijk van het ruggenmerg moeten scheiden door de rek van het vastgepinde embryo. Snijd tenslotte het ruggenmerg door op het niveau van de vleugelknop en caudaal ten opzichte van de ledemaatknop. Gebruik vervolgens een pincet om het ruggenmerg in een rostrale-caudale beweging op te tillen, terwijl u ervoor zorgt dat het merg gedurende de gehele procedure ondergedompeld blijft in de PBS.Spreid het geïsoleerde ruggenmerg uit op een spatel en breng het over naar een schaal gecoat met syl guard die 4% paraformaldehyde in PBS bevat. Zet het ruggenmerg vervolgens voorzichtig vast door het mediaal en kwartierwijs te pinnen met 0,1 millimeter insectenspeldjes om een flat mount preparaat te maken, waarbij het ruggenmerg 30 minuten tot één uur in het paraformaldehyde wordt geïncubeerd. Let erop dat er geen overfixatie optreedt.Aangezien dit de achtergrond zal verhogen en de efficiëntie van diode-diffusie zal verminderen. Giet vervolgens het paraldehyde voorzichtig af en vervang dit door PBS. Bereid vijf milligram per milliliter fast di in ethanol, breek de punt af van een glazen micropipet met een kleine diameter die is verbonden met een plastic slangetje en zuig de oplossing in de pipet.Plaats de gevulde naald in een schaal met PBS en controleer of de kleurstof niet uit de naald lekt. Als dit wel gebeurt, is de diameter te groot en moet er een nieuwe naald worden voorbereid. Zorg ervoor dat de open-book preparatie van onderen wordt verlicht en dat de dichtere longitudinale weefselstreep, die zich ongeveer op één vijfde van de breedte van het hemi-book vanaf de laterale rand bevindt, gelokaliseerd is. De cellichamen van de commissurale neuronen bevinden zich net dorsaal van deze donkere lijn.Voer de punt van de glazen micropipet in het weefsel in en blaas, terwijl de naald wordt teruggetrokken, een kleine hoeveelheid D eye in met behulp van een mondpipet. Herhaal deze procedure snel om de 0,5 millimeter langs de lengte van het open book. Gebruik na voltooiing van de injecties een transferpipet om elk overschot aan di te aspireren en weg te gooien; als dit niet gebeurt, zal dit leiden tot een hoge achtergrond.Herhaal de procedure voor alle open-book-preparaten. Plaats vervolgens de schaal met de geïnjecteerde preparaten gedurende ongeveer drie dagen bij vier graden Celsius om de kleurstof langs de axonen te laten verspreiden. Monteer de preparaten na deze periode volgens de instructies in het geschreven protocol.Dwarsdoorsneden en open boeken zijn verkregen uit Hamburger-Hamilton stadium 25 tot 26 kiजembryo's die bij Hamburger-Hamilton stadium 18 waren geëlektroporeerd. Zoals hier in dwarsdoorsnede te zien is, drijft de beta-actinepromotor ubiquitaire expressie aan. De pijl geeft de dorsoventrale richting aan.Deze afbeelding toont een voorbeeld van expressiepatronen van fluorescerende eiwitten die zijn verkregen na elektroporatie van de plasmidvectoren. Hier is ubiquitaire expressie vanuit de bèta-actinepromotor zichtbaar in een open-book preparaat. De pijl geeft de rostrale cordale richting aan.Deze afbeelding toont een dwarsdoorsnede na elektroporatie met een construct dat een math1-enhancer bevat. Dit drijft expressie aan in di1-neuronen. Hier is de expressie vanuit het math1-enhancer-construct zichtbaar in een open-boek-preparaat.Deze dwarsdoorsneede toont de expressie van de hawk A one-enhancer na bilaterale electroporatie van het construct. De hawk A one-enhancer stuurt de expressie specifiek aan in de vloerplaat. Deze open-boek preparatie toont het expressiepatroon van het hawk a one-construct in de vloerplaat.Deze afbeelding toont een bright-field opname van de injectieplaatsen van Dai. Bij een open-book preparaat werd Dai in een punctaat patroon geïnjecteerd nabij de laterale rand van het open boek. Op de geëlektroporeerde zijde toont deze afbeelding de visualisatie van GFP-expressie in hetzelfde preparaat, waarbij Dai hier gevisualiseerd is.Na drie dagen diffusie zouden commissuur-relax op trajecten gevisualiseerd kunnen worden onder fluorescentiemicroscopie. Normale axon-trajecten zullen groeien richting de vloerplaat, de vloerplaat kruisen en vervolgens draaien en verder groeien. Zoals hier te zien is.Abnormale fenotypes die voortvloeien uit gene knockdown, zoals hier getoond, kunnen worden vergeleken met de archetypische trajectorie. In dit voorbeeld blijven sommige axonen steken bij de vloerplaat of maken ze foutieve draaibeslissingen aan de contralaterale zijde. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig en geduldig te zijn tijdens de fijne injectie- en dissectiestappen.Deze technieken vereisen enige oefening. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u RNAI-plasmiden kunt injecteren en toedienen om de genfunctie tijdens de ontwikkeling van de neurale buis op een celtype-specifieke manier te onderzoeken.

in-ovo-electroporation-mirna-based-plasmids-developing-neural-tube

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken...

Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van...

In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo&#39;s

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt...

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Ectopische expressie is een techniek om de microRNA's rol in de ontwikkeling van de hersenen toe te lichten. Echter, gericht op specifieke gebieden met behulp van in-ovo elektroporatie is een uitdaging. Hier tonen we een efficiënte manier om selectief electroporate ventrale en dorsale middenhersenen regio.

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

We presenteren voorbijgaande transgenese en gen knock-down in doorschijnende zakpijp, een chordate zus groep gewervelde dieren, met behulp van micro-injectie en elektroporatie technieken. Dergelijke methoden vergemakkelijken functionele genomica in dit eenvoudige ongewervelde dat rudimentaire kenmerken van gewervelde dieren, met inbegrip van notochord en hoofd sensorische epitheel, en vele orthologen van de ziekte bij de mens geassocieerde genen beschikt.

Embryo micro-injectie en elektroporatie in de chordate<em&gt; Doorschijnende zakpijp</em

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Leer in ovo-elektroporatie van miRNA-plasmiden in de neurale buis van kippenembryo's om genexpressie gericht te onderdrukken en axonale geleiding te bestuderen. Deze methode maakt celtypespecifieke genfunctie-analyse mogelijk.

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen (Video) | JoVE Journal

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

Meer video's verkennen