Name: 1 F O ATPase Vesicle Voorbereiding en Techniek for Performing Patch Clamp Recordings van Submitochondrial Vesicle Membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer F1FO ATPase vesicels isoleren uit rattenhersenen voor patch clamp opnames. Deze methode maakt gedetailleerde studie van mitochondriale ATP-synthase activiteit en membraanfunctie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Brain Mitochondriale Isolatie (Bewerking van Brown MR et al.. 9) <ol><li> Offer de rat met behulp van door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) erkende methoden. </li><li> Snijd de kop van het dier door onthoofding, snijd de huid en bloot de schedel. </li><li> Open de schedel zachtjes door te snijden met een schaar of rongeur. Verwijder de hersenen. </li><li> Hak fijn de hersenen zonder cerebellum in Isolatie Buffer (zie tabel 1) en overbrengen naar een 5 ml glazen / teflon homogenisator (zie inventarislijst). </li><li> Homogeniseren tissue zachtjes 10 keer (geen luchtbellen), ongeveer 5 minuten. </li><li> Centrifugeer monster bij 1500 g gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge. </li><li> Sla het supernatant (mitochondriale en synaptosomen) en gooi de pellet (nucleair materiaal en celresten). Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge. </li><li> Afdankensupernatant en resuspendeer pellet in 500 ui buffer Isolation. Verstoren synaptosomen met een celdisruptie vat (zie inventarislijst). Breng een druk van 1200 psi gedurende 10 min, gevolgd door een snelle decompressie. </li><li> Laag van het mengsel op Ficoll gradiënten (zie tabel 2), plaats in de SW-50.1 rotor en centrifugeer bij 126.500 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een ultracentrifuge (zie inventarislijst). De pellet is het gezuiverde mitochondria, de laag tussen de verschillende dichtheid van Ficoll is ongestoord synaptosomen. </li><li> Was de pellet door centrifugeren in isolatie buffer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge. </li></ol> 2. Submitochondrial Vesicles (SMV) Isolatie (Bewerking van Chan et al.. 10) <ol><li> Resuspendeer mitochondria in 200 ul Buffer Isolatie gecombineerd met een gelijk volume van 1% digitonine en laten zitten op ijs gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg meer Isolatie Buffer en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge. Doe dit twee keer. </li><li> Resuspendeer pellet in 200 ui Isolatie buffer en voeg 2 pl van 10% Lubrol PX (C12E9). Meng en laat het zitten op ijs gedurende 15 minuten. </li><li> Layer mengsel op Isolation Buffer, in SW-50.1 rotor en centrifugeer bij 182.000 x g bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Wassen definitieve pellet door centrifugeren in een desk-top centrifuge Isolatie buffer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li></ol> 3. Elektrofysiologische opname <ol><li> Een typische elektrofysiologie rig omvat een versterker, een PC met een Digidata 1440A analoog-digitaalomzetter interface in combinatie met pClamp10.0 software, manipulatoren, een microscoop, een trillingsisolatie tafel Faraday kooi. </li><li> Borosilicaatglas capillaire buisjes worden ingebracht in een Flaming / Brown Micropipet Puller Model P-87. Pipet-puller programma geoptimaliseerdgenereren pipetten met weerstanden tussen de 80 tot 100 MQ. </li><li> SMVS worden in een fysiologische oplossing intracellulair (ATP wordt toegevoegd op het juiste moment tijdens de opname) (Tabel 3). Patch clamp pipetten zijn gevuld met dezelfde oplossing (geen ATP). Opnames gemaakt door vorming van een giga-ohm afdichting op SMVS bij kamertemperatuur. Vesicles gevisualiseerd door fase-contrast microscopie met een Nikon of Zeiss omgekeerde microscoop. </li><li> De membraanpotentiaal wordt op spanningen van -100 mV tot +100 mV gedurende 10 seconden. Opnames worden gefilterd op 5 kHz met behulp van de versterker schakeling. Niveau van strooi elektrische en niet-specifieke geluid van minder dan 1 pA zijn wenselijk voor een succesvolle opname. </li><li> Gegevens worden geanalyseerd met Clampfit 10,0 software bijvoorbeeld de frequentie en amplitude van een kanaal gebeurtenissen te bepalen. Spanningsafhankelijkheid wordt bepaald door het uitzetten van een gelijkstroomspanning relatie. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hierin beschreven werkwijzen kan de isolatie van zuivere mitochondria eind van stap 1 en submitochondrial vesicles (SMVS) na stap 2 van volledige hersenen zonder onderscheid cel phenotypes.SMVspurified met deze methode in hoofdzaak vrij is van andere subcellulaire organellen zoals in Figuur 1 en onze eerdere werk (Alavian KN et al.. 8) en voorafgaand aan het bevriezen van hun structurele en functionele integriteit te behouden. Na invriezen en ontdooien, die mitochondria of SMVS wo...

<table><tbody><tr><td>Potter-Elvehjem weefselmaler met PTFE-stamper</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>4639 celdisruptievat</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaat centrifugebuizen</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>SW-50.1 rotor </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-70M ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglas capillair</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipet-trekker Model P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</sub&gt; atpase vesicle voorbereiding en techniek for performing patch clamp recordings van submitochondrial vesicle membranen

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondriën zijn betrokken bij vele belangrijke cellulaire processen, waaronder het metabolisme, overleving 1, ontwikkeling, calcium signalering 2. Twee van de belangrijkste mitochondriale functies gerelateerd aan de efficiënte productie van ATP, de energie-eenheid van de cel, door oxidatieve fosforylering en bemiddeling van signalen voor geprogrammeerde celdood 3. Het enzym primair verantwoordelijk voor de productie van ATP is F1FO ATP-synthase, ook wel ATP synthase 4-5. De afgelopen jaren is de rol van mitochondriën in apoptotische en necrotische celdood aanzienlijke aandacht gekregen. In apoptotische celdood, BCL-2 familie eiwitten zoals Bax voer de mitochondriale buitenste membraan, oligomerize en permeabilize de buitenste membraan, het vrijgeven van pro-apoptotische factoren in het cytosol 6. In klassieke necrotische celdood, zoals die welke door ischemie of excitotoxiciteit in neuronen, eee, slecht gereguleerde toename matrix calcium bijdraagt ​​aan de opening van de binnenste membraan poriën, de mitochondriale permeabiliteittransitieporie of MPTP. Dit depolariseert de binnenste membraan en veroorzaakt osmotische verschuivingen, bij te dragen aan buitenste membraan breuk, vrijgave van pro-apoptotische factoren, en metabole stoornissen. Veel eiwitten waaronder Bcl-xL 7 interageren met F1FO ATP synthase, modulerende zijn functie. Bcl-xL interageert direct met de beta-subeenheid van F1FO ATP synthase, en deze interactie neemt een lek geleiding binnen de F1FOATPasecomplex, het verhogen van de netto transport van H + door F1FO tijdens F1FO ATPase activiteit 8 en waardoor mitochondriale efficiëntie. Om de activiteit en de modulatie van de ATP synthase bestuderen, we geïsoleerd van knaagdierhersenen submitochondrial blaasjes (SMVS) met F1FO ATPase. De SMVS behouden de structurele en functionele integriteit van de F1FO ATPase zoals in Alavian et al.. Hier beschrijven we een werkwijzedat we met succes gebruikt voor de isolatie van SMVS uit rattenhersenen en we bakenen de patch clamp techniek kanaalactiviteit analyseren (ion lekkage geleidbaarheid) van de SMVS.

De eerste stap van ons protocol maakt isolatie van gezuiverde mitochondria zoals getoond door Western blot in figuur 1. In figuur 2 wordt een voorbeeld getoond van hersenen afgeleide submitochondrial vesicle patch opname. Met behulp van de inside-out patch configuratie demonstreren we kanaal activiteit gemoduleerd door ATP. De besturing (CTL) opname (links) toont multi-geleiding channel activiteit met een piek geleidbaarheid van 600 pS gemiddeld. die onmiddellijk werd verminderd bij toe...

Werkwijze voor submitochondrial vesicles verrijkt F1FO ATP synthase complexen rattenhersenen isolaat wordt beschreven. Deze vesicles kunnen de studie van de activiteit van F1FO ATPase complex en de modulatie met de techniek van patch clamp opname.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Voorbereiding en Techniek for Performing Patch Clamp Recordings van Submitochondrial Vesicle Membranen

Mitochondriën zijn betrokken bij vele belangrijke cellulaire functies, waaronder het metabolisme, overleving1, ontwikkeling en calciumsignalering2. Twee van de meest ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van F1 F zero APA-vesikels uit de rattenhersenen voor het uitvoeren van patchclamp-metingen. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit een rat te verwijderen en deze te homogeniseren. De tweede stap is het openbreken van synaptische zones door druk uit te oefenen.Vervolgens worden de synaptosomen op de fialengradiënten gelaagd. De laatste stap is incubatie met digitonine en L om de uiteindelijke blaasjes voor patchclamp-registratie te verkrijgen. Een belangrijke functie van mitochondriën is de productie van ATP via oxidatieve fosforylering.Het enzym dat verantwoordelijk is voor de productie van ATP is de ATP-synthase, gelokaliseerd in het binnenmembraan van de mitochondriën. Om de functie van de ATP-synthase in detail te bestuderen, isoleren we speciale submitochondriale blaasjes, die we SMV's noemen. Deze bevatten het ATP-synthase-enzym in een inside-out configuratie.Vervolgens registreren we deze SMV's met een patchclamp-elektrode en bepalen we de lekstroom van hun membraan. Dit geeft ons informatie over de efficiëntie van de TP-productie door de mitochondriën. Deze procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Sylvia ti,

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Dit methodeartikel beschrijft de belangrijkste stappen in het meten van H + -lek over het binnenste mitochondriale membraan met de patch-clamp-techniek, een nieuwe benadering om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen.

Het gebruik van de patch-clamp-techniek om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Deze methode maakt gebruik van de bijdrage van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie aan protonlek met lage geleiding om de spanningsdrempel voor porieopening te bepalen bij neonatale fragiele X-syndroommuizen met een verhoogd cardiomyocyt mitochondriaal co-enzym Q-gehalte in vergelijking met wildtypecontrole.

Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie in de setting van co-enzym Q-overmaat

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Dit protocol beschrijft een methode voor het direct meten van ionkanaalactiviteit op intracellulaire blaasjes met behulp van een handmatig endolysosomaal patch-clamp-systeem. We illustreren de methode waarbij endolysosomen worden vergroot en deze blaasjes handmatig worden geïsoleerd. Deze aanpak zorgt ervoor dat onderzoekers de procedure nauwkeurig kunnen repliceren en toepassen.

Patch-clamp-technieken voor analyse van enkelvoudige endolysosomale blaasjes

Leer F1FO ATPase vesicels isoleren uit rattenhersenen voor patch clamp opnames. Deze methode maakt gedetailleerde studie van mitochondriale ATP-synthase activiteit en membraanfunctie mogelijk.

Meer video's verkennen