₁ F _O ATPase Vesicle Voorbereiding en Techniek for Performing Patch Clamp Recordings van Submitochondrial Vesicle Membranen

Het algemene doel van deze procedure is om F1 F nul APA's-blaasjes te isoleren uit rattenhersenen voor het uitvoeren van patch clamp-opnames. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit een rat te verwijderen en het te homogeniseren. De tweede stap is om synaptische zones te verstoren door druk uit te oefenen.

Vervolgens worden de synaptosomen in lagen op de phial-gradiënten geplaatst. De laatste stap is om te incuberen met digitoine en L om de uiteindelijke blaasjes te verkrijgen voor patch clamp-opname. Een belangrijke functie van mitochondriën is ATP-productie door oxidatieve fosforylering.

Het enzym dat verantwoordelijk is voor ATP-productie is de ATP-synthase die zich in het mitochondriale binnenmembraan bevindt. Om de functie van ATP-synthase in detail te bestuderen, isoleren we speciale submitochondriale blaasjes die we SMV's noemen. Ze bevatten het ATP-synthase-enzym in een binnen-buiten configuratie.

Vervolgens nemen we deze SMV's op met een patch clamp-elektrode en bepalen we de lekvrijheid van hun membraan. Dat vertelt ons over de efficiëntie van ATP-productie door de mitochondriën. Het demonstreren van deze procedure zal vandaag worden gedaan door Sylvia ti, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium aan Yale University.

Bij deze procedure, na het verkrijgen van het hoofd van een rat door onthoofding, wordt de huid ingesneden om de schedel bloot te leggen, waarna de schedel voorzichtig wordt geopend door deze met een schaar of Rons te snijden. Vervolgens wordt de hersenen verwijderd, wordt de hersenen zonder de kleine hersenen gehakt en uiteindelijk in isolatie, buffer, en vervolgens overgebracht naar een vijf milliliter glazen Teflon homogenisator, waar het weefsel zachtjes 10 keer wordt gehomogeniseerd, in totaal ongeveer vijf minuten. Daarna wordt het monster gedurende 10 minuten bij 1.500 keer G bij vier graden Celsius gecentrifugeerd in een tafelcentrifuge.

Bewaar de supernatant met mitochondriën en synaptosomen en gooi de pellet weg. Centrifugeer het vervolgens opnieuw bij 16.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge. Gooi vervolgens de supernatant weg en suspendeer de palate in 500 microliters isolatiebuffer, vernietig de synaptosomen met een celvernietigingsvat door een druk van 1.200 PSI gedurende 10 minuten toe te passen, gevolgd door snelle decompressie, en leg de vernietigde synaptische zones op de centrifugeerbuizen met twee verschillende concentraties fial die twee lagen zullen vormen.

Plaats de buizen vervolgens in een SW 50.1 rotor en centrifugeer bij 126.500 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. In een ultracentrifuge is de palate de gezuiverde mitochondriën. De laag tussen de verschillende dichtheden van fial is de onvernietigde synaptosoom.

Was daarna de pellet door centrifugeren in isolatiebuffer bij 16.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge. Nu Resus, suspendeer de mitochondriën in 200 microliters isolatiebuffer, gecombineerd met een gelijk volume van 1% digitoine.

Plaats het op ijs gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens meer isolatiebuffer toe en centrifugeer bij 16.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Herhaal deze procedure twee keer, suspendeer vervolgens de palate in 200 microliters isolatiebuffer en voeg twee microliters van 10% Lu bra, PX toe, meng en plaats op ijs gedurende 15 minuten.

Leg vervolgens het mengsel in isolatiebuffer in de centrifugeerbuizen. Plaats de buizen in een SSW 50.1 rotor en centrifugeer deze bij 182.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende een uur. Na een uur.

Was de laatste palette door hem in isolatiebuffer te centrifugeren bij 16.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Een typische elektrofysiologie-inrichting omvat een versterker, een PC-computer uitgerust met een digi data 1.440, een analoog-naar-digitaal converter-interface in combinatie met P clamp, 10.0 software manipulatoren, een microscoop, een trillingsisolatietafel en een Faraday-kooi. Trek eerst een pijpje uit een Boros silicaatglas capillair buisje in een vlammende bruine micro pijpjestrekker.

De optimale weerstand van het pijpje moet tussen de 80 en 100 mega ohm liggen. Voeg de submitochondriale blaasjes toe in een fysiologische intracellulaire oplossing. Vul vervolgens een patch clamp-pijpje met dezelfde oplossing.

Visualiseer de blaasjes onder fasecontrastmicroscopie nadat de SMV's bij kamertemperatuur zijn gepatcht. Neem de activiteit op wanneer het membraanpotentiaal gedurende 10 seconden per periode wordt gehandhaafd bij een spanning variërend van negatief 100 millivolt tot positief 100 millivolt.

De opgenomen gegevens worden gefilterd op vijf kilohertz met behulp van de versterkercircuits en geanalyseerd met clamp fit 10.0 software. Deze figuur toont de blot van lysate bereid uit cytosol en mitochondriën. Het bovenste paneel toont een immunoblot met behulp van een antilichaam tegen het cytosolische eiwit GA dh.

Het onderste paneel toont een blot met behulp van een antilichaam tegen het mitochondriale binnenmembraaneiwit. Cox vier Hier zijn twee representatieve patch clamp-opnames voor en na de toevoeging van één millimolair a TP. Het holdingpotentiaal is positief 70 millivolt. De gestippelde lijn vertegenwoordigt nul picoampère.

Elk spoor wordt gedurende 10 seconden opgenomen en er zijn 10 seconden tussen de sporen en getoond. Hier zijn de voorbeeldsporen van de veranderingen in fluorescentie-intensiteit van de A CMA-indicator in de loop van de tijd in aanwezigheid van SMV's en in afwezigheid en aanwezigheid van a TP. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mitochondriën, een submitochondriaal blaasje dat F1 FO 80 TP Synthes bevat, isoleert. Bovendien zou u moeten begrijpen hoe u een weerstandsafdichting met een elektrode op het membraan van het blaasje vormt om de kanaalactiviteit van het ATP-synthase-complex te analyseren.