Name: Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer de dagelijkse afstemming en optimalisatie van een CyTOF massa-cytometer voor nauwkeurige enkelvoudige celanalyse. Dit protocol verbetert signaalacquisitie en datakwaliteit door juiste instellingen en onderhoud.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Dr Evan Newell en Dr Sean Bendall bedanken voor feedback. We willen ook graag DVS Sciences en Dr Sean Bendall bedanken voor een monster van het Multi-lanthanide-bevattende polystyreen parels. We zijn dankbaar voor de financiering van NIH subsidie ​​2 U19 AI057229.

Alle celmonsters de CyTOF moet worden vastgesteld en gepermeabiliseerd. Dit maakt een grotere invoer van het iridium-bevattende DNA intercalator, en voorkomt ook cellyse tijdens de MilliQ water wassen en resuspensie stappen vlak voor het injecteren in de massa cytometer. 1. Start-up van de Mis Cytometer <ol><li> Open het CyTOF softwareprogramma. Selecteer Instrument-setup. Op de kaart Cage tabblad, ga naar de rechter benedenhoek en klik Heater &quot;ON&quot; knop te drukken. Zet de verwarming minstens 15 min. voor gewenste tijd voldoende tijd voor de sproeikamer laat mantel 200 ° C. bereikt </li><li> Vervang de witte Norm-Ject 3 ml spuit in de spuit pomp met een frisse injectiespuit gevuld met MilliQ water. </li><li> Reinigen verstuiver. Backflush de vernevelaar met behulp van de spuit en slang aan 5% citranox 2-3 keer trekken door zowel de kleinere vloeibare introductie haven en de grotere inbrengen van gas-poort. Herhaal terugspoelen met MilliQ water to verwijderen resterende citranox. </li><li> Controleer bevestigen dat de lampjes op het voorpaneel van de CyTOF branden als in figuur 1. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figuur 1. CyTOF lampjes vóór de inbedrijfstelling. <ol start="5"><li> Open argon gas tank klep. Dit moet ertoe leiden dat de &quot;argon&quot; lampje op de voorkant in te schakelen. </li><li> Bevestig de vernevelaar om make-up gasinlaat. Schroef de make-up gas slang connector en verwijder de zwarte rubberen o-ring en de witte conische plastic stuk. Let op het bredere &quot;knokkel&quot; op het gas inlaatpoort steel van de vernevelaar. Plaats de connector op het gas introductie poort. Plaats de zwarte o-ring over het uiteinde van de gaspoort en dwingen de o-ring langs het brede deel van de haven stam. Plaats de witte conische plastic stuk op de top met de smalle kant op gewezen, en schroef op de make-up gas buizen. </li><li&gt; Bevestig de vernevelaar om de vloeistof introductie slang. Steek de kleine buis in de opening aan het einde van de vernevelaar. Er zullen twee haltes, gelijk in het gevoel van de stops op een micropipettor. Druk eerst op tot je aan lichte weerstand, het einde van de kleine buis moet aan het eind van het rechte gedeelte van glas. Ten tweede, druk harder aan het einde van het rechte gedeelte van het glas te dwingen verder in de fitting en draai de wartel te verzegelen. Steek het uiteinde van de vernevelaar in de witte opening in de verwarmingsmantel. </li><li> Op het RFG Controller tab van het Instrument-setup venster, drukt u op &quot;Start Plasma&quot;. Omdat de vernevelaar al is geplaatst, drukt u op &quot;OK&quot;. De software zal draaien op de koelmachine, start de gasstroom, en ontsteken een plasma. De detector spanning zal opvoeren. Er zal een pop-up venster te zeggen &quot;Plasma opstartprocedure met succes is voltooid&quot; als u klaar zijn, druk op &quot;OK&quot;. Nieuwe lampen moeten op in het voorpaneel (figuur 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figuur 2. CyTOF lampjes na plasma ontstoken en start-up met succes afgerond. <ol start="9"><li> Het inschakelen van injectiepomp. In de rechter bovenhoek, druk op de groene &quot;play&quot;-knop om de spuit pomp te starten en stromende vloeistof door de slang en spuiten van de vernevelaar te beginnen. De standaard spuit instellingen zijn voor 3 ml water. Om monster dat stroomt door de sample loop, moet de injectiespuit pomp regelmatig worden vervangen wanneer het water opraakt. Bovenaan het scherm, er een teller aangeeft hoeveel vloeistof stroomde uit de spuitpomp. De spuitpomp stopt wanneer de teller &quot;3,000&quot; of de zuiger bereikt raakt het uiteinde van de spuit. Wanneer opnieuw vullen van de spuit, moet je raken &quot;stop&quot; in plaats van de blauwe &quot;pauze&quot; knop om de teller te resetten. </li></ol>e &quot;&gt; 2. Dagelijkse kalibratie van de Mis Cytometer <ol><li> De massa cytometer heeft ongeveer 20 minuten een warme, stabiele plasma bereiken voor kalibratie. Het doel van de tuning stappen is om het gewenste signaal van Tm169 of Tb159 maximaliseren terwijl &quot;Gd155&quot; (oxide; La139 + O16) signaal onder de 3% van de hogere waarde. Klik op de Overname knop Instellingen om de data-acquisitie venster Instellingen te openen. In de analyten tabblad, klik op de periodieke tabel van de isotoop jury te openen. Selecteer de isotopen in de DVS Sciences tuning oplossing vermeld in de handleiding en klik vervolgens op &quot;opslaan&quot;. </li><li> Klik op de Isotopen Per Lezen toets om de Massa (&#39;s) te openen Per Reading venster. Selecteer &quot;Peulvruchten Count&quot;, en herschalen de y-as door het invoeren van een nieuw nummer en druk op &quot;enter&quot;. </li><li> Vul een groen 1 ml Norm-Ject spuit met tuning oplossing. Draai het monster poort keuzeschakelaar op &quot;LOAD&quot;, 450 ul van tuning oplossing te injecteren, zet de schakelaar op &#39;injecteren&#39;. In de Mis Kalibratie tabblad van het Data Acquisit<html> ion venster Instellingen, druk op &quot;Run&quot; om te controleren welke massa&#39;s stromen door. De linkerkant van het venster is lager massa, terwijl de rechterkant is een hogere massa. Opmerking: er al signalen in de TOF 9400-9800 regio door xenon isotopen in het argongas (figuur 3). Wacht tot tuning oplossing isotopen start verschijnen als strepen in deze display (Figuur 4). </li></ol><img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figuur 3. Mass kalibratie tabblad venster, met achtergrondniveaus voor verschillende isotopen na het wassen oplossing en water afspoelen. De regio rond TOF 9400-9800 komt overeen met xenon isotopen in de argon gas, en moet altijd aanwezig zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Mass kalibratie tab-venster, met verticale strepen van verschillende isotopen in DVS tuning oplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <ol start="4"><li> Ga terug naar de Massa (&#39;s) per Lezen venster en druk op de groene &quot;Play&quot; knop in de linker bovenhoek. Elke isotoop geselecteerd in stap 2.1 wordt vertegenwoordigd door een verschillend gekleurde lijn. De standaard x-as is &quot;Time&quot; in sec. Bewaken van de niveaus van de verschillende isotopen tot ze stabiel. </li><li> Afstemmen van de stroom. Op het tabblad Parameter van de Data Acquisition venster Instellingen, selecteer &quot;Current&quot; in het drop-down menu. Laten start = 0, afwerking = 10, stap value = 0,5, de afwikkeling van de tijd = 200, en druk op &quot;opslaan&quot;. Klik weer op de Massa (&#39;s) per Reading venster en druk op spelen. De x-as is nu &quot;Current&quot;. Opmerking waar de signalen van de isotopen piek (figuur 5), en r<html> ECORD. Onder de DAC-kanalen tab Setup van het Instrument-setup venster, scroll naar beneden naar &quot;Huidige&quot; en voer deze nieuwe waarde. Druk op de &quot;werkelijke huidige waarde Set&quot; en vervolgens op &quot;opslaan&quot;. </li></ol><img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figuur 5. Huidige tuning profiel. <ol start="6"><li> Afstemmen van de make-up gas. Wijzig drop-down menu op &quot;Make-up gas.&quot; Laten start = 0,55, einde = 0,95, stap value = 0,05, de afwikkeling van tijd = 200. Druk op op te slaan. Terug naar de Massa (&#39;s) per Reading venster en druk op spelen. De x-as is nu &quot;Make-up gas&quot; debiet. Noteer waar de signalen van de isotopen piek. Let op de snelle toename van de &quot;Gd155&quot; signaal aan het einde (figuur 6). Keer terug naar de DAC-kanalen tabblad, scroll naar beneden naar &quot;Make-up gas&quot;, en voer deze nieuwe waarde. Druk op de &quot;werkelijke huidige waarde Set&quot; en vervolgens op &quot;opslaan&quot;. </li></ol>igure 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Figuur 6. Make-up gas tuning profiel. <ol start="7"><li> Opnemen verhouding gewenste isotoop vs oxide. Maak een tweede 450 ul injectie van tuning oplossing. Op het tabblad Parameter, &quot;tijd&quot; te selecteren uit het drop-down menu, laat start = 0, einde = 10, stap value = 1, de afwikkeling van tijd = 200. Druk op &quot;redden.&quot; Hit &quot;play&quot; in Massa (&#39;s) per Lezen venster. Nadat de lijnen zijn gestabiliseerd (Figuur 7), gebruikt u de cursor naar de waarde te lezen in de linkerbovenhoek dozen voor Tm169 of Tb159 (hogere waarde) en ook de &quot;Gd155&quot; waarde (&lt;3% van de hoogste waarde). Deze waarden kunnen ook worden opgeslagen in een tuning-bestand voor toekomstige referentie. </li></ol><img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figuur 7. Meting van tuning oplossing signaalintensiteiten na het optimaliseren van huidige en Make-up gas. <ol start="8"><li> Reiniging van samPLE lus. Injecteer 3 ml MilliQ water door de sample loop, gevolgd door 500 pi wasoplossing DVS. Bewaken van de voortgang van de reiniging door het indrukken van &quot;run&quot; in de Mis Calibration tabblad. Wassen tot de intensiteit van de strepen (Afbeelding 4) begint dan af door 3 ml MilliQ water en monitor volgt tot tot achtergrondniveaus (figuur 3). </li></ol> 3. Running Monsters <ol><li> Open het Acquisitie venster. Standaardinstellingen: Doe Analyse = On-The-Fly, Signaal = Dual, Dual Count Calibration = gegevens te analyseren. Ruisonderdrukking is geselecteerd. Elk van deze kan indien gewenst gewijzigd worden. Voer de bestandsnaam in. Alle bestanden moeten worden opgeslagen op de E :/ / drive. </li><li> Instellen van overname vertragingen. Er zal een kleine vertraging in registratie cel gebeurtenissen van ongeveer 30 sec door de lengte van de buis tussen de sample loop en de vernevelaar zijn. Daarom is de som van &quot;Verwerving vertraging&quot; en &quot;Detector stvermogen vertraging &quot;moet ten minste 30 sec. Detector stabiliteit vertraging moet ten minste 20 sec. </li><li> Het instellen van het verzamelen van gegevens tijd. &quot;Acquisitie tijd&quot; is het aantal seconden dat u wilt uw monster uit te voeren. Het vullen van de hele 450 ul sample loop zou 600 sec in beslag. Voorgesteld wordt 50-100 sec worden toegevoegd aan het einde van de run tijd sample minimaliseren overdracht. </li><li> Resuspensie van het monster. Om opbouw minimaliseren van zouten in de machine wordt gesuggereerd dat minstens twee wasbeurten in MilliQ water worden gedaan bij het einde van de cel kleuring, gevolgd door een laatste resuspensie in MilliQ water. De hoeveelheid MilliQ water gebruikt om het cel pellet is afhankelijk van het aantal cellen te beginnen met de celopbrengst na de gehele kleuringsprocedure mengen. Een goed startpunt is 10 6 (startende) cellen / ml. Na resuspensie, filtreer door een cel zeef om aggregaten te verwijderen. </li><li> Vanaf steekproef uit te voeren. Geef een nieuwe bestandsnaam voor de huidige steekproef.<html> Zet de sample loop ventiel op &quot;LOAD&quot;, het monster te injecteren, terug te schakelen naar &#39;injecteren&#39;, druk dan op &quot;Openen&quot; in het Acquisition venster. </li><li> Het registreren van cel evenementen. Cellen zullen worden vertegenwoordigd in de snapshot-venster als horizontale collecties van merken in elke verticale isotoop / marker kanaal (figuur 8). Terwijl de massa cytometer kunnen zich aanmelden 1.000 cellen / sec, wordt een betere resolutie tussen cel gebeurtenissen gewoonlijk verkregen bij 300-500 cellen / sec. Dit komt overeen met een gemiddelde van ~ 1 cel / scherm refresh. Het kan tot 30 seconden voordat de cel event-teller begint te klimmen. Dit komt door &quot;On-the-fly&quot; gegevensverwerking; geen cel event informatie verloren. </li></ol><img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Figuur 8. Acquisition venster monsters tijdens lopen, met horizontale rijen punten overeenkomen met de elementen gekoppeld aan drie afzonderlijke cel events.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. <ol start="7"><li> Kwaliteit van cel gebeurtenissen. Constateert achtergrond strepen in elk isotoop kanaal en de cel incidentie. De massa cytometer herkent een &quot;cel event&quot; als een zekere verhoging van signaal boven de achtergrond, dus achtergrondsignaal van gratis metaal of ongebonden antilichaam kan de &quot;cel gebeurtenis&quot; telling veranderen. Bovendien kan draaien cellen te hoge concentratie tot een verhoogd aantal events doublet. Achtergrond kan worden verminderd door extra spoelingen of meer celverdunning. Doubletten kan worden geminimaliseerd door grotere cel verdunning, ten koste van een verhoogde uitvoering. </li><li> Afwerking sample data-acquisitie. Wanneer de Verwerving is bereikt, wordt de gegevensverzameling voltooien. Er zal een beetje vertraging voordat een pop-up venster met zijn een &quot;OK&quot; knop verschijnt, nogmaals, dit is te wijten aan &#39;On-the-Fly &quot;verwerking van gegevens. Afnemen van het monster kan ook worden gestopt Prematurely door op de &quot;Stop&quot; knop. In dit geval zal de cel reeds geregistreerde gebeurtenissen worden geteld en verwerkt tot uitvoerbestanden. </li><li> Injectie van ten minste 500 pi MilliQ water elk monster helpt minimaliseren monster overdracht. </li></ol> 4. Het apparaat reinigen na gebruik <ol><li> Wasoplossing. Na de laatste steekproef wordt uitgevoerd en de sample loop gespoeld met water, 450 ul van wasoplossing te injecteren in de sample loop. Toezicht houden op de afgifte van vrije metaal in de Mis Kalibratie tab van het data-acquisitie venster Instellingen als in stap 2.8 (Figuur 9). Wanneer het vrije metaal signaal begint af te spoelen met 3 ml MilliQ water en controleren totdat achtergrondniveaus worden bereikt. </li></ol><img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figuur 9. Mass kalibratie tabblad venster, tijdens de post-run reinigen met DVS Wash-oplossing. De verticale strepen in TOF regio 9800 tot 11.000 zijn antilichaam-label isotopen worden gereinigd uit de machine. De verticale strepen rond TOF 11500 overeen met de twee Ir intercalator isotopen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . 5. Uitschakelen van de machine <ol><li> In de RFG Controller tab van het Instrument-setup-venster, selecteer &quot;Stop Plasma&quot;. Wanneer de procedure is voltooid, zal er een pop-up venster waarin u wordt gevraagd om de vernevelaar te verwijderen. Druk op &quot;OK&quot;. In de Card Cage tabblad, zet de verwarming. Sluit de klep op de argon aanbod. </li><li> Verwijdering van vernevelaar. Verwijder de verstuiver uit de sproeikamer door voorzichtig naar achteren te trekken. Schroef het monster introductie slang van stap 1,6 en leg opzij. Schroef de make-up het inbrengen van gas aansluiting op iets los en trek de vernevelaar uit. Het verlaten van de fitting in elkaar geschroefd zal verminderen de kans op lOsing de zwarte rubberen o-ring en witte conische plastic stuk. </li><li> Reinigen verstuiver. Backflush beide poorten van de vernevelaar met 5% citranox met behulp van de spuit en de slang als in stap 1.3. Store, bedekt, in 5% citranox tot het volgende gebruik. </li></ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

De auteurs werken beiden in het menselijk immuunsysteem Monitoring Center, een service center aan de Stanford University, die gebruikers kosten in rekening brengt alleen om te herstellen van de kosten van tests, met inbegrip van de massa cytometrie.

De laatste decennia is fluorescentie flow cytometrie is een werkpaard methode voor het analyseren enkelvoudige cellen, zowel oppervlakte-expressie en functionele bepalingen. Echter de problemen van spectrale overlap van de fluorescente kleurstoffen beperkt het aantal gelijktijdige markers. Terwijl experimenten met meer dan 12 gelijktijdige markers zijn gemeld, het bedrag van de schadevergoeding die nodig maakt dit technisch moeilijk. In plaats van fluoroforen, massa cytometrie ontwikkeld doo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> CyTOF TM massa cytometer </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wasoplossing </td><td> DVS Sciences </td><td> 201071 </td><td> 0,05% fluorwaterstofzuur in water </td></tr><tr><td> Afstemmen oplossing </td><td> DVS Sciences </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, spoor salpeterzuur </td></tr><tr><td> Eu bevattende polystyreenparels </td><td> DVS Sciences </td><td> 201073 </td><td> Bevat natuurlijke overvloed Eu isotopen; kralen geleverd op circa 1 miljoen / ml </td></tr><tr><td> Multi-lanthanide-bevattende (La / Pr / Tb / TM / Lu) - polystyreen kralen </td><td> DVS Sciences </td><td> Nog niet in de handel verkrijgbare </td><td> Bevat natuurlijke overvloed isotopen van beursgenoteerde lanthaniden </td></tr><tr><td> Salpeterzuur (geconcentreerd) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima spoor-metaal pure ICP-MS graad </td></tr><tr><td> Polystyreen ronde bodem buis met cel-zeef cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> gebruikt celmonsters filter voor injectie </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin spuit-1mL </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010-200V0 </td><td> siliconen-vrij, latexvrij </td></tr><tr><td> Norm-Ject spuit-3 mL </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010.000V0 </td><td> siliconen-vrij, latexvrij </td></tr><tr><td> MilliQ water </td><td></td><td></td><td> 18 MQ zuiver water, mogen niet worden opgeslagen in glazen of plastic flessen die zijn gewassen met commercieel detergens (vanwege hun hoge barium aanwezig). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> zuur reinigingsmiddel </td></tr><tr><td> Argon gas </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% Ultra-hoge zuiverheid </td></tr></tbody></table>

massa cytometry: protocol voor dagelijks tuning en running cell samples op een cytof mass cytometer

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

De laatste jaren heeft een snelle analyse van afzonderlijke cellen die zijn uitgevoerd met behulp van flowcytometrie en fluorescent-gemerkte antilichamen. Echter, het probleem van de spectrale overlap van fluorofoor-uitstoot beperkt het aantal gelijktijdige sondes. In tegenstelling tot de nieuwe CyTOF massa cytometer door DVS Sciences paren een vloeistof eencellige invoersysteem een ICP-MS. Een plaats fluoroforen zijn chelaatvormende polymeren die hoogverrijkt metaalisotopen gekoppeld aan antilichamen of andere specifieke probes. 2-5 Door de metalen zuiverheid en massa resolutie van de massa cytometer, er is geen &quot;spectrale overlap&quot; van naburige isotopen, en daarom geen noodzaak voor compensatie matrices. Bovendien, door het gebruik van lanthanide metalen er geen biologische achtergrond en dus geen equivalent van autofluorescentie. Met een massa venster verspreid over atoommassa 103 tot 203, in theorie tot 100 etiketten kunnen tegelijkertijd worden onderscheiden. Tegenwoordig, Meer dan 35 kanalen beschikbaar via de chelerende reagentia die beschikbaar zijn vanaf DVS Sciences, die een ongekend dissectie van de immunologische profiel van monsters. Zes-zeven Nadelen massa cytometrie onder de strenge eis van een afzonderlijke metalen isotoop per probe (geen equivalent van voorwaartse of zijwaartse verstrooiing), en het feit dat het een destructieve techniek (geen mogelijkheid sorteren recovery). De huidige configuratie van de massa cytometer heeft ook een cel overdrachtssnelheid van slechts ~ 25%, waardoor het noodzakelijk wordt een hogere input aantal cellen. Optimale dagelijkse prestaties van de massa cytometer vereist een aantal stappen. Het hoofddoel van de optimalisatie is aan de gemeten signaalsterkte van het gewenste metaal isotopen (M) te maximaliseren, terwijl het minimaliseren van de vorming van oxyden (M +16) die de M signaalintensiteit verlagen en interfereren met elke gewenste signaal M +16. De eerste stap is om op te warmen de machine, zodat een warme, stabiele ICP plasma is vastgesteld. Ten tweede moet de voor huidige en make-up gasstroom worden geoptimaliseerd op een dagelijkse basis. Tijdens het verzamelen, wordt het maximale cell incidentie beperkt door detector efficiency en verwerkingssnelheid tot 1000 cellen / seconde. Afhankelijk van het monster kwaliteit, een lagere cel incidentie (300-500 cellen / seconde) is gewoonlijk wenselijk om een ​​betere resolutie tussen cellen gebeurtenissen en dus intact singlets maximaliseren over wambuizen en vuil. Tenslotte adequate reiniging van de machine aan het eind van de dag minimaliseert achtergrondsignaal door vrij metaal.

Naar aanleiding van het bovenstaande protocol moet volbrengen vier dingen. Ten eerste zal dat op adequate wijze opwarmtijd voor de massa cytometer produceren een warme, stabiele plasma noodzakelijk voor een optimale signaal-en minimale oxidevorming. Anderzijds voldoende was de massa cytometer met MilliQ water en DVS wasoplossing (figuur 9) zal helpen de niveaus van metaal adsorptie aan de buis en andere delen van de machine, waardoor achtergrond te verlagen monsters tijdens acquisitie (figuur 8)...

De stappen die dagelijks tuning en optimalisatie van de prestaties van een CyTOF massa cytometer beschreven. Reacties op optimale monstervoorbereiding en debiet worden besproken

Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

In recente jaren is de snelle analyse van individuele cellen gewoonlijk uitgevoerd met behulp van flowcytometrie en fluorescentielabel-antilichamen. Echter, de ...

Het hoofddoel van deze procedure is het demonstreren van de juiste dagelijkse afstelling en monsteranalyse op een CyTOF-instrument. Eerst wordt het apparaat geassembleerd en ingeschakeld. Vervolgens worden de instrumentinstellingen geoptimaliseerd voor afstelling op het maximale signaal.De machine is vervolgens klaar om de monsters te analyseren. In de laatste stap wordt de machine gereinigd en uitgeschakeld. Uiteindelijk kunnen optimale celgegevens worden verkregen op basis van specifieke tijdvereisten.Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel. De dagelijkse procedures voor de opstelling, afstemming en reiniging zijn lastig aan de hand van de handleiding te leren, aangezien er meerdere gelijktijdige softwarestappen aan te pas komen.U moet ervaring opdoen om een gevoel te krijgen voor de juiste achtergrondniveaus en signaalintensiteiten. Open ten minste 15 minuten voordat u met een experiment begint het CyTOF-softwareprogramma en selecteer instrument setup. Klik vervolgens in het tabblad card cage op de knop heater on om de mantel van de spuitkamer op 200 °C te laten komen.Vervang de spuit in de spuitpomp door een nieuwe spuit gevuld met milli cube water. Reinig vervolgens de vernevelaar door tweemaal per poort terug te spoelen met 5% Citron. Om eventuele Citron-resten te verwijderen, wordt het terugspoelen herhaald met Milli Q water.Open vervolgens het ventiel van de argongastank, waardoor het argonlampje aan de voorzijde van het apparaat gaat branden. Bevestig daarna de nebulisator aan de inlaat voor het makeup-gas en verbind de nebulisator met de slang voor de vloeistofintroductie. Plaats het uiteinde van de nebulisator in de witte opening van de verwarmingsmantel op het tabblad RFG-controller in het venster voor de instrumentinstellingen.Klik op start plasma en klik vervolgens op oké. Nadat de opstartprocedure is voltooid, klikt u nogmaals op oké in het pop-upvenster. Zet nu de spuitpomp aan.Druk bij het bijvullen van de spuit op de stopknop in plaats van de pauzeknop om de volumeteller te resetten. Zorg ervoor dat de massacytometer 20 minuten is opgewarmd voordat u deze kalibreert. Zodra de machine is gestabiliseerd, klikt u op de knop voor acquisitie-instellingen om het venster met de instellingen voor data-acquisitie te openen. In het tabblad analyten.Klik op het periodiek systeem om het paneel voor de selectie van isotopen te openen. Selecteer vervolgens de isotopen in de DVS sciences tuning-oplossing zoals vermeld in de handleiding en klik op opslaan. Klik daarna op de knop 'isotopen per meting' om het venster voor de massa's per meting te openen.Selecteer het aantal pulsen en schaal de y-as opnieuw door een nieuw getal in te voeren en vervolgens op enter te drukken. Vul nu een groene norm-injectiespuit van één milliliter met tuning-oplossing. Draai de monsterpoortselector naar de stand load.Injecteer 450 µL van de tuning-oplossing en draai vervolgens aan de selector om te injecteren. Wacht tot de isotopen van de tuning-oplossing als strepen in dit display verschijnen. De signalen in de time-of-flight regio van 9.400 tot 9.800 zijn te wijten aan xenon-isotopen in het argongas.Ga nu terug naar de massa's per leesvenster en klik op de groene afspeelknop. Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt geselecteerde isotopen uit het tabblad analyten. Wanneer de isotoopniveaus stabiel zijn, stemt u de huidige selectiestroom af via het vervolgkeuzemenu in het tabblad parameters van het venster met instellingen voor gegevensverwerving.Voer in het startvenster nul in voor start, en 10 voor finish. Voer 0,5 in voor de stapwaarde en 200 voor de insteltijd. Klik vervolgens op opslaan.Klik vervolgens terug op het venster voor de massa's per meting en klik op afspelen. Nadat is genoteerd waar de signalen van de isotopen pieken, gaat u naar het tabblad DAC-kanaalconfiguratie van het venster voor de instrumentinstellingen. Scroll naar beneden naar stroom en voer de isotopenpiekwaarde in.Klik op 'set actual current value' en sla dit vervolgens op. Wijzig daarna het vervolgkeuzemenu naar 'make up gas'. Voer 0,55 in het startvenster, 0,95 in het eindvenster, 0,05 in het venster voor de stapwaarde en 200 in het venster voor de stabilisatietijd in.Klik op opslaan. Na terugkeer naar het venster voor massa's per meting en het opnieuw klikken op afspelen, zal de x-as nu het debiet van het make-upgas weergeven. Noteer de waarden waar de signalen van de isotopen pieken en observeer de snelle toename van het GD 1 55-signaal aan het einde.Keer vervolgens terug naar het tabblad voor de instellingen van het DAC-kanaal. Scrol omlaag naar makeup, gas, en voer de nieuwe waarde voor de isotooppiek in. Klik op set actual current value.Klik vervolgens opnieuw op opslaan om de verhouding tussen het gewenste isotoop en het oxide te registreren. Voer eerst een tweede injectie van 450 µL afstemsoplossing uit. Selecteer daarna op het tabblad parameters 'tijd' uit het vervolgkeuzemenu en voer nul in het venster voor de starttijd, 10 in het venster voor de eindtijd, één in het venster voor de stapwaarde en 200 in het venster voor de stabilisatietijd in.Nadat u op afspelen heeft geklikt in het venster voor massa's per lezing, gebruikt u de cursor om de hogere waarde voor TM 1 69 of TB 1 59 te lezen, en ook de GD 1 55 waarde. Injecteer nu drie milliliter Milli Q water via de sample loop, gevolgd door 500 microliters DVS wasoplossing. Klik in het tabblad voor massakalibratie op uitvoeren om de voortgang van de reinigingswas te bewaken totdat de intensiteit van de strepen begint af te nemen.Volg dit vervolgens met drie milliliters milli cube water en monitor tot de strepen zijn gedaald tot achtergrondniveaus. Begin met het invoeren van de zojuist gedemonstreerde monsterisotopen voor de isotopen van de tuning-oplossing en klik vervolgens op opslaan. Open daarna het acquisitievenster en pas de acquisie-instellingen aan naar behoefte voor het monstervolume.Een monster van 450 µL vult bijvoorbeeld de monsterlus en heeft een looptijd van 600 seconden om vertragingen bij de acquisitie van de celgegevens op te vangen. Stel de acquisitievertraging in op minimaal 30 seconden en de detectorstabiliteitsvertraging op minimaal 20 seconden vóór de run. Was de celmonsters minstens twee keer met milli-Q-water, resuspendeer het monster vervolgens tot een maximale concentratie van 10⁶ cellen per mL en filtreer de resulterende celoplossing door een celzeef van 35 µm.Om eventuele aggregaten te verwijderen. Voer nu een nieuwe bestandsnaam in voor het huidige monster. Let op dat alle bestanden op de E-schijf moeten worden opgeslagen.Zet vervolgens de monsterlusventiel in de stand 'laden', injecteer het monster, zet het monsterlusventiel terug in de stand 'injecteren' en klik daarna op run. In het acquisitievenster worden de cellen in het snapshotvenster weergegeven als horizontale verzamelingen markeringen in elk verticaal isotoopkanaal; zij vertonen de beste resolutie bij ongeveer 300 tot 500 cellen per seconde, zoals hier wordt gedemonstreerd.Wanneer de gegevensverwerving van het monster is voltooid, verschijnt er een pop-upvenster. Klik op oké om de voltooiing van de monstermeting te bevestigen en injecteer vervolgens tussen elk monster ten minste 500 µL MQ-water om eventuele monsteroverdracht te minimaliseren en de machine te reinigen. Injecteer na gebruik 450 µL wasoplossing in de monsterlus. Monitor de afgifte van vrij metaal en spoel de monsterlus vervolgens met drie mL milli Q-water, waarbij de spoeling wordt gemonitord totdat de achtergrondniveaus van de strepen zijn bereikt.Om het apparaat uit te schakelen, selecteert u het RFG-controller-tabblad van het venster voor de instrumentinstellingen en klikt u op 'stop plasma'. Wanneer de procedure is voltooid, klikt u op 'ok' in het pop-upvenster, waarin wordt aanbevolen om de nebulisator te verwijderen via het tabblad 'card cage'. Schakel de verwarmer uit, sluit het ventiel van de argonvoorziening en trek vervolgens voorzichtig de nebulisator naar achteren om deze uit de spuitkamer te verwijderen.Draai vervolgens de slang voor monsterintroductie los en leg deze opzij. Draai de aansluiting voor de make-up gasintroductie los tot deze licht beweegt en trek daarna de nebulizer eraf. Reinig tot slot beide poorten van de nebulizer met 5%Citron met behulp van dezelfde spuit en slang als eerder gedemonstreerd, en bewaar de nebulizer afgedekt in 5%Citron tot het volgende gebruik.Het adequaat spoelen van de massacytometer met UE-water en DVS-wasoplossing vermindert de metaalabsorptie in de slang en andere onderdelen van het apparaat, wat helpt om de achtergrondruis, zoals te zien in deze grafieken, te verlagen. Onjuiste tuning, weergegeven door de magenta lijn, leidde tot een significante toename van de oxidevorming bij m plus 16 in vergelijking met het correct getunede monster, zoals aangetoond door de donkerblauwe lijn. Dit heeft tot gevolg dat de gewenste signalen bij m licht afnemen en de ongewenste achtergrondinterferentie bij m plus 16 significant toeneemt.Correct wassen en juiste verdunning van de monsters in Milli Q water zorgen voor een minimale achtergrond en de hoogste resolutie van cellen, terwijl de noodzaak voor snelheid in balans wordt gehouden. Vergelijkbaar met de gegevens van een representatief experiment zoals hier getoond, werden polystyreen beads die natuurlijke abundanties van lanthanum 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 en LUTETIUM 1 75 bevatten, geanalyseerd in de celacquisitiemodus. De gegevens werden geanalyseerd met FlowJo en debris van gebroken beads werd via gating verwijderd.Het correct afgestelde monster werd bepaald bij een debiet van 0,74 liters per minuut, weergegeven door de donkerblauwe lijn. Bij dit debiet werden hogere signaalintensiteiten waargenomen dan bij de lagere debieten, en dit correct afgestelde monster vertoonde een hoger signaal bij de M-metaalmassa's en minder signaal bij de m plus 16-oxidemassa's dan de onjuist afgestelde signalen. Een detailopname van het signaal bij M-massa LANTHANUM 1 39 en THULIUM 1 69 wordt hier getoond.Let op dat het debiet van het make-upgas de signaalintensiteit van LANTHANUM 1 39 sterker beïnvloedt dan die van thulium 1 69. Deze grafieken tonen het signaal bij m plus 16 oxidemassa's 1 55 en 180 5, die respectievelijk overeenkomen met de LANTHANUM 1 39 plus oh 16 en thulium 1 69 plus oh 16 oxiden. Let op dat het debiet van het make-upgas het signaal van massa 1 55 veel sterker verhoogt dan het signaal van massa 180 5, aangezien lanthanum 1 39 gemakkelijker oxideert dan thulium 1 69.De signaalintensiteiten van m en m plus 16 als functie van de flowrate van het makeupgas zijn hier afgebeeld. De ingevulde iconen representeren de massa M, terwijl de open iconen de massa M plus 16 representeren; de kleuren van de lijnen komen overeen met de respectievelijke massa M. Let op dat de signaalintensiteiten van LANTHANUM 1 39 en price ODIUM 1 41 sterk worden beïnvloed door de flowrate van het makeupgas, waarbij zelfs een punt wordt bereikt waarop er meer oxide van massa m plus 16 aanwezig is dan massa M. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de CyTOF correct opstart, afstelt, vervolgens uw monsters analyseert en aan het einde van uw dagelijkse runs de machine correct reinigt en uitschakelt.

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video highlights a single-cell proteomic method that employs heavy-metal-conjugated antibodies for distinct cell barcoding. Subsequently, immunostaining and mass cytometry are applied to evaluate immune phenotypic and functional alterations in human whole blood-derived immune cells.

A Barcoding Assay for Phenotypic and Functional Characterization of Immune Cells

This video illustrates a flow cytometry-based assay for quantifying therapy-induced senescent cancer cells with dual senescence markers. The detection and quantification of senescent cells involve using a β-galactosidase substrate. The substrate is cleaved by active lysosomal β-galactosidase within the senescent cells, producing a fluorescent product that, in conjunction with autofluorescent lipofuscin granules, marks the senescent cancer cells.

Flow Cytometry-Based Quantification of Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Dit artikel beschrijft de verzameling en verwerking van monsters voor massa-cytometrie-analyse.

Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Flow cytometrische analyse heeft waardevol voor het onderzoeken van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek bewezen. Wij presenteren drie uitgebreide werkstromen, van monsterneming tot data-analyse, voor zuivere culturen en complexe gemeenschappen in duidelijke medium zoals in uitdagende matrices, respectievelijk.

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

Dit protocol past celcyclusmetingen aan voor gebruik in een massacytometrieplatform. Met de multiparametermogelijkheden van massacytometrie maakt directe meting van jodiumopname identificatie van cellen in S-fase mogelijk, terwijl intracellulaire cyclusmarkers karakterisering van elke celcyclustoestand in een reeks experimentele omstandigheden mogelijk maken.

Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform

Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.

Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Leer de dagelijkse afstemming en optimalisatie van een CyTOF massa-cytometer voor nauwkeurige enkelvoudige celanalyse. Dit protocol verbetert signaalacquisitie en datakwaliteit door juiste instellingen en onderhoud.

Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

Meer video's verkennen