Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer
2 november 2012
De stappen die dagelijks tuning en optimalisatie van de prestaties van een CyTOF massa cytometer beschreven. Reacties op optimale monstervoorbereiding en debiet worden besproken
Het overzichtelijke doel van deze procedure is om de juiste dagelijkse afstemming en monsteranalyse op een CyTOF-instrument te demonstreren. Eerst wordt de machine geassembleerd en ingeschakeld. Vervolgens worden de instrumentinstellingen geoptimaliseerd voor afstemming op het maximale signaal.
De machine is dan klaar om de monsters te draaien. In de laatste stap wordt de machine schoongemaakt en uitgeschakeld. Uiteindelijk kunnen optimale celgegevens worden verkregen volgens specifieke tijdsvereisten.
Visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal. De dagelijkse instelling, afstemming en reinigingsprocedures zijn moeilijk te leren uit de handleiding. Omdat er meerdere gelijktijdige softwarestappen bij betrokken zijn.
Je moet ervaring opdoen om een gevoel te krijgen voor de juiste achtergrondniveaus en signaalintensiteiten. Ten minste 15 minuten voordat je een experiment begint. Open het CyTOF-softwareprogramma en selecteer instrumentinstellingen. Klik vervolgens in het kaartkooi-tabblad op de heater-aan-knop om de spuitkamermantel 200 graden Celsius te laten bereiken.
Vervang de spuit in de spuitpomp door een nieuwe spuit gevuld met milli cube-water. Maak vervolgens de vernevelaar schoon door twee keer achterwaarts te spoelen met 5% Citron door elke poort. Om eventuele resterende Citron te verwijderen, herhaal de achterwaartse spoeling met Milli Q-water.
Open vervolgens de argongastankklep, waardoor het Argonne-licht op de voorkant van de machine wordt ingeschakeld. Bevestig vervolgens de vernevelaar aan de aanvoergasinlaat en bevestig de vernevelaar aan de vloeistofinvoerbuis. Steek het uiteinde van de vernevelaar in de witte opening in de verwarmingsmantel op het RFG-controller-tabblad van het instrumentinstellingenvenster.
Klik op startplasma en klik vervolgens op oké. Nadat het opstarten is voltooid, klikt u opnieuw op oké in het pop-upvenster. Schakel nu de spuitpomp in.
Wanneer u de spuit bijvult, drukt u op de stopknop in plaats van de pauzeknop om de volumeteller te resetten. Zorg ervoor dat de massa cytometer 20 minuten is opgewarmd voordat u hem kalibreert. Zodra de machine is gestabiliseerd, klikt u op de acquisitie-instellingenknop om het data-acquisitie-instellingenvenster te openen. In het tabblad analyten.
Klik op de periodieke tabel om het isotoopselectiepaneel te openen. Selecteer vervolgens de isotopen in de DVS-wetenschapsafstemmingsoplossing die in de handleiding staan vermeld en klik op opslaan. Klik vervolgens op de isotopen per meting-knop om het venster met massa's per meting te openen.
Selecteer pulstelling en schaal de y-as opnieuw door een nieuw nummer in te voeren en vervolgens op enter te drukken. Vul nu een groene 1 milliliter norm injectiespuit met afstemmingsoplossing. Draai de steekproefpoortschakelaar naar laden.
Injecteer 450 microliter afstemmingsoplossing en draai vervolgens de schakelaar naar injecteren. Wacht tot de isotopen van de afstemmingsoplossing als lijnen in deze weergave beginnen te verschijnen. De signalen in het tijdsvliegterrein, 9.400 tot 9.800 regio, zijn te wijten aan xenon-isotopen in het argongas.
Keer nu terug naar het venster met massa's per meting en klik op de groene afspeelknop. Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt geselecteerde isotopen uit het tabblad analyten. Wanneer de isotoopniveaus stabiel zijn, stemt u de stroomselectie-stroom uit het vervolgkeuzemenu in het parametertabblad van het data-acquisitie-instellingenvenster.
In het startvenster voert u nul in voor afwerking, voert u 10 in. Voer voor stapwaarde 0,5 in en voor settling time 200. Klik vervolgens op opslaan.
Klik vervolgens terug op het venster met massa's per meting en klik op afspelen. Nadat u hebt opgemerkt waar de signalen van de isotopen pieken, gaat u naar het DAC-kanaalsetup-tabblad van het instrumentinstellingenvenster. Scroll naar beneden naar stroom en voer de isotooppiekwaarde in.
Klik op de werkelijke stroomwaarde instellen en sla vervolgens op. Wijzig vervolgens het vervolgkeuzemenu om op te maken gas. Voer 0,55 in in het startvenster, 0,95 in het eindvenster, 0,05 in het stapwaardevenster en 200 in het settling time-venster.
Klik op opslaan. Na terugkeer naar het venster met massa's per meting en opnieuw op afspelen, zal de x-as nu de opmaakgasstroomsnelheid weergeven. Let op de waarden waar de signalen van de isotopen pieken en observeer de snelle toename van het GD 1 55-signaal aan het einde.
Keer vervolgens terug naar het DAC-kanaalsetup-tabblad. Scroll naar beneden naar opmaak, gas en voer de nieuwe isotooppiekwaarde in. Klik op de werkelijke stroomwaarde instellen.
Klik vervolgens opnieuw op opslaan om de verhouding van gewenste isotoop versus oxide vast te leggen. Maak eerst een tweede injectie van 450 microliter afstemmingsoplossing. Selecteer vervolgens tijd uit het vervolgkeuzemenu op het parametertabblad en voer nul in het startvenster, 10 in het eindvenster, een in het stapwaardevenster en 200 in het settling-venster.
Na het afspelen in het venster met massa's per meting, gebruikt u de cursor om de hogere waarde voor TM 1 69 of TB 1 59 te lezen, en ook de GD 1 55-waarde. Injecteer nu drie milliliter Milli Q-water door de steekproeflus, gevolgd door 500 microliter DVS-wasoplossing. Klik in het massacalibratietabbed op uitvoeren om de voortgang van de reinigingswas te volgen totdat de intensiteit van de lijnen begint af te nemen.
Volg vervolgens met drie milliliter milli cube-water en controleer totdat de lijnen zijn verminderd tot achtergrondniveaus. Begin met het invoeren van de steekproefisotopen die zojuist zijn gedemonstreerd voor de afstemmingsoplossingisotopen, en klik vervolgens op opslaan. Open vervolgens het acquisitievenster en wijzig de acquisitie-instellingen indien nodig voor het steekproefvolume.
Een 450 microliter-steekproef vult bijvoor
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de dagelijkse tuning- en optimalisatieprocedures voor een CyTOF massacytometer. Er wordt nadruk gelegd op een optimale monstervoorbereiding en stroomsnelheid om de prestaties te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Massa-cytometrie
- Instrumentafstelling
- Monsteranalyse
Achtergrond
- CyTOF-instrumenten vereisen regelmatig onderhoud voor optimale prestaties.
- Correcte afstelling is essentieel voor een nauwkeurige data-acquisitie.
- De monsterpreparatie beïnvloedt de kwaliteit van de resultaten.
- Aanpassingen van de stroomsnelheid kunnen de signaalsterkte beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om het dagelijkse afstemmingsproces van een CyTOF-instrument te demonstreren.
- Om maximale signaalacquisitie tijdens de monsteranalyse te garanderen.
- Om richtlijnen te bieden voor het reinigen en uitschakelen van het instrument.
Gebruikte methoden
- Assemblage en inschakelen van het CyTOF-instrument.
- Optimalisatie van de instrumentinstellingen voor de tuning.
- Het analyseren van monsters na de tuning.
- Reinigen en uitschakelen van het apparaat na de analyse.
Belangrijkste resultaten
- Een succesvolle tuning leidt tot optimale acquisitie van celgegevens.
- Een correcte monstervoorbereiding verbetert de analyseresultaten.
- Aanpassingen van de stroomsnelheid zijn cruciaal voor het maximaliseren van het signaal.
- Regelmatig onderhoud garandeert de betrouwbaarheid van het instrument.
Conclusies
- Dagelijkse tuning is essentieel voor de prestaties van de CyTOF.
- Het naleven van optimale procedures verbetert de datakwaliteit.
- Routineuze reiniging is noodzakelijk voor de levensduur van het instrument.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Massacytometrie maakt hoogdimensionale analyse van individuele cellen mogelijk zonder spectrale overlap, wat diepgaande immuunprofilering en de ontdekking van biomarkers bij de ontwikkeling van geneesmiddelen ondersteunt. Dagelijkse tuning en optimalisatie van het CyTOF-instrument waarborgen een reproduceerbare acquisitie van data met een hoog signaal, wat cruciaal is voor targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in preklinisch onderzoek. Correct instrumentonderhoud vermindert technische variabiliteit, waardoor de betrouwbaarheid van data in discovery- en translationele workflows wordt vergroot.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gelijktijdige detectie van meer dan 35 parameters mogelijk voor uitgebreide immuuncelfenotypering en onderzoek naar signaalpaden.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, compensatievrije resultaten die de complexiteit van de assay verminderen en de toetsing van hypothesen over doelen verbeteren.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde single-cell data met een hoge resolutie, geschikt voor assay-validatie en reagentia-titratie.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare monsterverwerking met gedefinieerde cel-eventrates (300-500 cellen/sec) om de singlet-resolutie te maximaliseren en doubletten te minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert longitudinale immuunmonitoring in ziekterelevante systemen door het achtergrondsignaal te minimaliseren via strikte reinigingsprotocollen.
- Operationele waarde: Garandeert instrumentstabiliteit over verschillende runs, waardoor technische ruis in preklinische effectiviteits- en veiligheidsstudies wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De CyTOF-workflow past binnen de vroege ontdekkingsfase tot en met de preklinische fasen, waarbij hoogdimensionale immuunprofilering input biedt voor doelwitselectie en studies naar het werkingsmechanisme.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde immunofenotypering en functionele validatie van therapeutische targets in complexe biologische systemen.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde immuunmonitoring mogelijk over verschillende behandelcondities met aanpasbare acquisitie-instellingen voor een consistente gegevensvergelijking.
- Analytics: Levert multiparametrische, kwantitatieve single-cell read-outs die clustering, dimensionaliteitsreductie en biomarker-identificatie faciliteren.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt immuunsignaturen uit de ontdekkingsfase met preklinische modellen via reproduceerbare monstervoorbereiding en datanormalisatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd, onderhoudbaar platform voor immuunmonitoring over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de doelbiologie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via hoogdimensionale resolutie op enkelcelniveau.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via dagelijkse afstelling, reiniging en gestandaardiseerde protocollen voor monstervoorbereiding.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door betrouwbare immuunprofileringsgegevens te leveren die de risico's bij de verdere ontwikkeling van het doelwit verkleinen.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van uitgebreide, reproduceerbare immuunmonitoring.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het bedienen van massacytometrie, inclusief plasmatuning, optimalisatie van de gasstroom en signaalstabilisatie.
- Afhankelijk van consistente toegang tot argongas, tuningsoplossingen, wasreagentia en correct onderhoud van de spuiten.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de monstervoorbereiding, acquisitie-instellingen en reinigingsprocedures om inter-run variabiliteit te minimaliseren.
- Omvat overwegingen voor aanpassing van monsterconcentratie, levensvatbaarheid en debrisniveaus om de celgebeurtenissnelheden en het herstel van singlets te optimaliseren.
- Beperkt door het destructieve karakter van de analyse en een celtransmissiesnelheid van ~25%, waardoor hogere inputcellen zijn vereist en celherstel voor downstream-assays is uitgesloten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Start-up of the Mass Cytometer
1:59
Daily Calibration of the Mass Cytometer
5:21
Running Samples
6:54
Cleaning and Shutting Down the Machine After Use
7:58
Results: The Effect of Proper Tuning on the Desired Signal and the Difference in Oxide Formation Between Various Lanthanide Metals
10:39
Conclusion
