Onderzoeken op Wijzigingen van de hippocampus Circuit Functie Na mild traumatisch hersenletsel

Het algemene doel van het volgende experiment is het onderzoeken van veranderingen in de netwerkfunctie van de hersengebieden die zijn aangetast door een experimenteel model van licht traumatisch hersenletsel. De experimenten beginnen met het toebrengen van een laterale fluïde percussieletsel aan een muis, wat zowel de pathologie als de symptomatologie van licht traumatisch hersenletsel bij mensen nabootst. Als tweede stap wordt een hippocampus-afhankelijk gedrag, de contextueel geconditioneerde angstrespons, gebruikt om de door hersenletsel geïnduceerde cognitieve beperking te beoordelen. Vervolgens worden extracellulaire en intracellulaire registraties, samen met spanningsgevoelige kleurstoffen, gebruikt om de regio-specifieke veranderingen in de synaptische balans tussen excitatoire en inhibitoire synaptische transmissie te bepalen. In het gebied van belang, de hippocampus, tonen de resultaten subregio-specifieke veranderingen in de netto synaptische effectiviteit in de hippocampus, gebaseerd op verschillen tussen de controlemuizen en de muizen met hersenletsel over de drie beschreven registratietechnieken.

Het belangrijkste voordeel van deze benadering is de mogelijkheid om de effecten van zowel de pathologische toestand als potentiële therapeutica op meerdere fysiologische schalen te onderscheiden, waardoor een coherenter beeld van de defecten in dit circuit ontstaat. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over traumatisch hersenletsel, zoals specifiek welke neuronen het meest vatbaar zijn voor letsel en dus de grootste bijdrage leveren aan hippocampale dysfunctie na het letsel. De implicaties van onze benadering strekken zich uit tot de behandeling van traumatisch hersenletsel, omdat het ons in staat stelt om eerst de onderliggende mechanismen af te bakenen en vervolgens potentiële therapieën te ontwikkelen om een normale fysiologie te herstellen in gebieden die beschadigd zijn door hersenletsel.

Anestheseer in deze procedure de muis met een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine en xylazine. Voer vervolgens een C-craniectomie uit over het rechter pariëtaal gebied met een boor met een buitendiameter van 3 mm. Bevestig daarna de Luer-lock naaldhouder over de C-craniectomie met cyanoacrylaat en tandheelkundig acrylaat.

Anestheseer de muis 24 uur later met isofluraan via inhalatie. Zodra de normale ademhaling is hervat, maar voordat de muis gevoelig is geworden voor stimulatie, wordt via het fluid percussion injury-apparaat een puls zoutoplossing van 20 milliseconden op de schedel toegediend. Verwijder de hub onmiddellijk na het letsel. Anestheseer de muis vervolgens opnieuw met isofluraan en hecht de hoofdhuid.

Hanteer de muis op twee opeenvolgende dagen voorafgaand aan de training voor de geconditioneerde angstrespons. Plaats de muis op de trainingsdag gedurende drie minuten in de conditioneringskamer voordat een vloershock van 1,5 amp gedurende twee seconden wordt toegediend. Laat de muis vervolgens nog 30 seconden in de kamer blijven voordat deze wordt verwijderd.

Keer na een vertragingsperiode van 24 uur terug naar de conditioneringskamer voor vijf minuten, en beoordeel vervolgens de freezing met intervallen van vijf seconden zeven dagen na het letsel. Bereid één liter kunstmatig cerebrospinaal vocht en 250 milliliter sucrose-snijoplossing voor. Zorg ervoor dat alle instrumenten en oplossingen die tijdens de bereiding van de hersenplakjes worden gebruikt, ijskoud zijn bewaard in ijs.

Anestheseer de muis snel en voorzichtig met isofluraan. Verwijder de hersenen uit de muis en plaats deze in sucrose. Trim vervolgens de hersenen.

Plaats het vers gesneden coddle-oppervlak van de hersenen op een druppel secondelijm op de Vibram-tafel voor een agarblok. Snijd coronale coupes met een dikte van 350 micron. Er zouden vier of vijf coupes verkregen moeten worden met het intacte hippocampale circuit.

Incubeer de coupes daarna gedurende ten minste één uur bij 37 °C. Bereid nu enkele borosilicaatglaselektroden van twee tot vijf megaohm voor. Verplaats met de verticale puller een coupe naar de kamer en plaats vervolgens een elektrode in de elektrodehouder voor de registratie van extracellulaire veldpotentialen.

Positioneer de stimulerende elektrode boven het axonale traject op het coupesnijvlak, zoals het perindentum-pad of de collateralen van Shafer. Laat vervolgens de registreerelektrode verder in het coupesnijvlak zakken. Dien daarna een enkele elektrische puls toe om het extracellulaire veld-postsynaptisch potentiaal op te wekken.

Zet de stimulatie voort en varieer de diepte van de registratie-elektrode tussen de stimuli door totdat de maximale respons is bereikt. Dit is een indicatie dat de elektroden zich op hetzelfde niveau bevinden. De analyse bestaat doorgaans uit metingen waarbij de amplitude van de fiber volley in zowel hersengeblesseerde als sham-geopereerde muizen wordt vergeleken om de presynaptische activatie te evalueren, evenals het vergelijken van de helling van de F-E-P-S-P om de postsynaptische activatie te evalueren. Voor patchclamp-registratie wordt een slice opnieuw naar de kamer overgebracht en wordt de registratie-elektrode neergelaten.

Benader een cel met positieve druk op de elektrode om te voorkomen dat de registratie-elektrode verstopt raakt terwijl deze door het weefsel naar beneden beweegt. Wanneer de elektrode de cel voorzichtig raakt, wordt negatieve druk aangelegd om een giga seal tussen de elektrode en het plasmamembraan te creëren. Pas vervolgens korte pulsen negatieve druk toe om het plasmamembraan te ruptureren en zo de whole cell configuratie te bereiken.

Elimineer de capaciteitstransiënt met behulp van de versterker en compenseer voor de serieweerstand om nauwkeurige metingen te garanderen. Kwantificeer en vergelijk vervolgens de snelheid en grootte van spontane synaptische stromen in zowel hersenbeschadigde muizen als sham-geopereerde controles. Bereid in deze stap de kleurstofvoorraad voor door 1 mg van kleurstof drie onap DHQ te mengen in 50 µL ethanol.

Verdeel aliquots van 2 µL in met folie omwikkelde buisjes en bewaar deze bij -20 °C. Maak dagelijks de werkoplossing van de kleurstof in een verdunning van 1:200 in A CSF. Incubeer vervolgens een slice op met A CSF bevochtigd filterpapier en kleur deze gedurende 16 minuten met 90 µL kleurstof.

Spoel het daarna af en plaats het in de interface-registratiekamer. Plaats de stimulerende en registrerende elektroden zoals beschreven bij de registratie van extracellulaire veldpotentialen.

Pas de intensiteit van de lichtstimulatie aan tot de respons in het midden van de camera is gecentreerd. Range-beelden worden doorgaans vastgelegd met een snelheid van 500 tot 1000 frames per seconde. Activeer de sluiter voor de lichtstimulatie 200 milliseconden vóór de elektrische stimulatie om de initiële snelle fotobleking te laten stabiliseren.

Pauzeer 10 seconden tussen de trials. Wissel de acquisitietrials af tussen elektrische stimulatie en niet-elektrische stimulatie om later de achtergrond van de niet-elektrische stimulatie te kunnen aftrekken. Registreer vervolgens de rustlichtintensiteit voordat de sluiter wordt geopend.

Elke VSD-meting kan worden geanalyseerd als een film van fluorescentiemetingen. Dat wil zeggen dat elke meting een driedimensionale datamatrix is met waarden in de X- en Y-ruimtelijke dimensies over de tijd. Registreer 10 tot 12 VSD-metingen per testconditie en bereken de intra-pixel genormaliseerde fluorescentieverandering vóór illuminatie volgens het bijbehorende manuscript.

Deze figuur toont een voorbeeld van een F-E-P-S-P-registratie in gebied CA1. De eerste neerwaartse uitslag is het stimulusartefact, gevolgd door de presynaptische vezelvolley en vervolgens de F-E-P-S-P. Hier zijn de input-outputcurves die een afname van de netto synaptische effectiviteit in CA1 laten zien na een vloeistofpercussieletsel.

En hier zijn de input-outputcurves die een toename van de netto synaptische efficiëntie in de gyrus dentatus laten zien na FPI. Hier wordt een voorbeeld getoond van een spontane excitatoire postsynaptische stroom van een CA1-piramidale cel. Hier is een voorbeeld van de actiepotentiaalreeks van een CA1-piramidale cel en een snel vurende CA1-interneuron.

Dit is een met Lucifergeel gevulde CA1-inhibitoire interneuron zonder dendritische stekels, en hier is een met Lucifergeel gevulde CA1-pyramidale neuron met dendritische stekels. Deze figuren tonen een coronale hippocampale slice van een muis. De geel tot rode pixels representeren de excitatoire activiteit in gebied CA1 14 milliseconden na de afferente stimulatie van de schaffer-collateralen.

Rood duidt op meer depolarisatie, terwijl geel duidt op een geringere maar nog steeds significante depolarisatie. De blauwe pixels representeren de locaties van inhibitore activiteit in gebied ca 1 56 milliseconden na dezelfde afferente Schaffer-collaterale stimulatie, waarbij donkerblauw duidt op meer hyperpolarisatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u meerdere ex vivo registratietechnieken kunt combineren om een klinisch relevante pathologische aandoening met circuitdysfunctie aan te pakken.