Kwantitatieve Locomotion Studie van Vrij Zwemmen micro-organismen met behulp van laser diffractie
25 oktober 2012
Microscopische organismen zoals de vrij-zwemmen nematode C. elegans, Leven en zich gedragen in een complexe drie-dimensionale omgeving. We brengen verslag uit op een nieuwe benadering die analyse biedt van C. elegans Met behulp van diffractie patronen. Deze aanpak bestaat uit het bijhouden van de tijd periodiciteit van de diffractie patronen gegenereerd door het richten van laserlicht door een cuvet.
Het algemene doel van deze procedure is om de slingerfrequenties van vrij zwemmende microscopische organismen te meten. Dit wordt bereikt door eerst een monster van microscopische wormen te bereiden. Vervolgens wordt de optische opstelling voorbereid.
Vervolgens wordt het diffractiepatroon geïntroduceerd door de levende organismen opgenomen. Ten slotte wordt de opgenomen gegevens geanalyseerd om de zwemfrequenties te bepalen. Uiteindelijk wordt diffractieanalyse gebruikt om veranderingen in bewegingspatronen van onbeperkte wormen te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals traditionele microscopie, is dat zwempatronen kunnen worden waargenomen terwijl de soort zich vrij in een driedimensionale ruimte beweegt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in vrij zwemmende zeeelegantie, kan deze ook worden toegepast op andere transparante, kleine en microscopische organismen die worden blootgesteld aan verschillende omstandigheden. Om C elegant voor video-analyse op te zetten, begint u met het gebruik van een afgeplatte platinadraad om 10 tot 20 GR volwassen nematoden naar vers NGM te verplaatsen.
Agar gevulde petrischalen met kleine cirkelvormige vlekken van e coli. Laat de nematoden drie tot vijf uur eieren leggen en verwijder vervolgens de volwassenen. Zo wordt een kleine ontwikkelingsgesynchroniseerde cultuur van 50 tot 150 nematoden gevestigd om de nematoden tot vroege volwassenheid te laten groeien, incubeer de petrischalen gedurende vier tot vijf dagen bij 20 graden Celsius.
Op de dag van de video-analyse, gebruik een milliliter gedeïoniseerd gedistilleerd water om een plaat van jonge volwassen nematoden te spoelen, waardoor 50 tot 150 wormen uit de gesynchroniseerde cultuur worden verzameld. Gebruik een microcentrifuge om de wormen naar de bodem van de buis te centrifugeren of laat ze ongeveer 15 minuten door zwaartekracht bezinken. Verwijder het grootste deel van het water uit de buis en vervang het door een milliliter gedeïoniseerd gedistilleerd water om eventuele aanhankende bacteriën van de nematoden te wassen.
Gebruik een micropipet om vijf tot 10 nematoden in water over te brengen naar een kwartsvete. Monteer de optische opstelling zoals hier getoond, met behulp van een 543 nanometer helium neon laser voor oversampling twee frontoppervlakken aluminium spiegels die worden gebruikt om de laserstraal door de vete te sturen, een vetehouder, een projectiescherm en een hogesnelheidscamera die in staat is om bij ongeveer 240 frames per seconde te filmen. Gebruik vervolgens een stuk paraform om de bovenkant van de vete te bedekken en draai het om de nematoden in de waterkolom te mengen.
Plaats de vete in een vetehouder zodat de wormen zich aanvankelijk nabij de bovenkant van de vete bevinden. Gebruik de spiegels om de laserstraal door het midden van de vete te sturen. Omdat de nematoden dichter zijn dan water, zullen ze langzaam naar de bodem van de vete zakken terwijl ze in de waterkolom op het projectiescherm zwemmen, kleed de vlek die overeenkomt met de doorgelaten laserstraal zwart om verstrooiing te verminderen wanneer de doorgelaten straal het projectiescherm bereikt.
Het elimineren of verminderen van verstrooiing van de doorgelaten straal zal voorkomen dat de CCD-array van de camera verzadigd raakt door de doorgelaten straal. Om een maat voor de grootte van het diffractiepatroon te meten, tekent u een lijn van ongeveer vijf centimeter op het projectiescherm naast de vlek van de doorgelaten laserstraal zonder de diffractielichtafbeelding te storen. Doe het kamerlicht uit en neem diffractiebeelden op het scherm op terwijl de wormen door de laserstraal gaan.
Om de videogegevens voor te bereiden, installeert u het volgende video-analyseprogramma en importeert u de video in het programma. Stel de oorsprong in om samen te vallen met de doorgelaten laservlek met behulp van de software. Volg de hoekverplaatsing van het diffractiebeeld gevormd door elke nematode.
Kopieer en plak gegevens in een spreadsheet en voeg 180 graden of PI toe voor alle negatieve hoeken. Om een continue grafiek te produceren. Gebruik de video-analyseopstelling, plaats een fotodiode met een klein gebied uit het centrum in het diffractiepatroon direct voor het projectiescherm via een USB-poort.
Verbind de fotodiode met de digitale oscilloscoop die op de computer aansluit. Observeer de slingerpatronen op het computerscherm. Sla gegevenssets op in ASCI of tekstformaat om de gegevens te analyseren.
Gebruik video of de foto om de gegevens in een gegevensanalyseprogramma te importeren dat in staat is om golfvormen te passen. Gebruik chiqua-minimalisatie om een sinusvormige curve te passen om de slingerfrequentie te bepalen. Bereken de gemiddelde zwemfrequenties van verschillende monsters en bepaal de variantie.
Voor dit onderzoek werden gegevens statistisch geanalyseerd met behulp van een enkele factor Inova, gevolgd door de Bon Ferran. Meervoudige vergelijkingen testen Een P-waarde van minder dan 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd om diffractiepatronen te modelleren. Begin met het gebruik van een microscoop om afbeeldingen te maken om een afbeelding te meten.
Sleep het in Mathematica. Gebruik de binaire ogen-opdracht om het in zwart-wit te converteren. Gebruik alternatief de randdetectie-opdracht om een zwart-witte afbeelding te maken waarbij de twee achterblijvende cijfers de grofheid van de resulterende randen regelen.
Gebruik vervolgens de afbeeldingsgegevensopdracht om de afbeelding om te zetten in een matrix van nullen en enen. Gebruik de voordere opdracht om de matrix te voorderen, transformeer de matrix, vier vervolgens de absolute waarde van de matrix en bekijk de resulterende afbeelding, wat het diffractiepatroon is dat overeenkomt met de originele afbeelding. Gebruik bovendien de log-functie om de contrastverhouding van de afbeelding te schalen.
Vergelijk ten slotte de modeldiffractiepatronen met de diffractiepatronen verkregen van vrij zwemmende wormen. In dit voorbeeld werd zeeelegantie bestudeerd in een kwarts Q vete, een centimeter breed, vijf millimeter dik en vier centimeter hoog. Een enkele worm samplen met behulp van video-analyse.
De gemiddelde zwemfrequentie verkregen uit video-analyse in een vijf millimeter dikke vete was ongeveer 2,5
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe aanpak om het zwemgedrag van de nematode C. elegans te analyseren met behulp van diffractiepatronen. Door de temporele periodiciteit van deze patronen te volgen, kunnen onderzoekers inzicht krijgen in de voortbeweging van deze microscopische organismen in een driedimensionale omgeving.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- C. elegans is een modelorganisme voor het bestuderen van voortbeweging.
- Traditionele microscopiemethoden beperken de observatie van organismen in de driedimensionale ruimte.
- Diffractiepatronen kunnen een nieuwe methode bieden voor het analyseren van beweging.
- Deze techniek kan worden toegepast op andere transparante microscopische organismen.
Doel van het onderzoek
- Om de kronkelfrequenties van vrij zwemmende C. elegans te meten.
- Om voortbewegingspatronen te analyseren met behulp van diffractie-analyse.
- Om bestaande methoden voor het observeren van zwemgedrag te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een gesynchroniseerde cultuur van C. elegans.
- Installatie van een optisch systeem met behulp van een helium neon-laser.
- Opname van diffractiepatronen terwijl nematoden door een laserstraal zwemmen.
- Gegevensanalyse met behulp van video-analysesoftware en statistische methoden.
Belangrijkste resultaten
- De gemiddelde zwemfrequentie van C. elegans werd gemeten op ongeveer 2,37 Hz.
- Er werden verschillen in zwemfrequentie waargenomen in vergelijking met kruipgedrag.
- De techniek maakt realtime observatie van voortbeweging in drie dimensies mogelijk.
- Statistische analyse bevestigde de significantie van de resultaten.
Conclusies
- Deze diffractiemethode biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van zwemgedrag bij C. elegans.
- De aanpak kan worden aangepast voor andere microscopische organismen.
- Toekomstige studies kunnen de implicaties van voortbewegingspatronen onder verschillende omstandigheden verder onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neuromuscular function in live, unconstrained model organisms.
- Supports functional target validation by measuring real-time behavioral outputs under varying conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and perturbed locomotion patterns.
- Provides reproducible, quantitative endpoints for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput measurement of locomotor activity for phenotypic screening.
- Generates reproducible, quantitative data suitable for assay development and compound evaluation.
- Enables rapid comparison of locomotion metrics across experimental conditions and genetic backgrounds.
- Supports platform scalability and reuse for diverse transparent micro-organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in neurobiology and movement disorders.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of neuromuscular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, statistically validated outputs.
- Facilitates predictive de-risking for movement-related therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neuromuscular function in live organisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible locomotion metrics for compound and genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative frequency measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning behavioral outputs with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse transparent micro-organism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates behavioral phenotyping with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of movement-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical instrumentation and quantitative behavioral analysis.
- Needs access to laser diffraction setup, high-speed imaging, and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of data acquisition and statistical analysis protocols.
- Adaptable to various transparent micro-organisms with appropriate calibration.
- Limited to organisms and conditions compatible with optical diffraction and real-time imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
