Name: Hoog rendement, Site-specific Transfectie van adherente cellen met siRNA Met behulp van micro-elektrode arrays (MEA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer site-specifieke transfectie van adherente cellen met siRNA via micro-elektrode arrays. Deze methode biedt precieze ruimtelijke controle en hoge efficiëntie voor gentherapieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. MEA Voorbereiding <ol><li> MMO voor gebruik in elektroporatie experimenten kan worden vervaardigd met behulp van standaard fotolithografie techniek zoals eerder beschreven 18 of gekocht rechtstreeks van leveranciers van MEA fabrikanten zoals Multi Channel Systems <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> en Alpha MED Scientific, Inc <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . De MEA gebruikt in onze experimenten werden gefabriceerd in-house bij de clean room faciliteit in Arizona State University, dat wordt beheerd door het Centrum voor Solid State Electronics Research (CSSER). De MEA gebruikt in onze experimenten 32 indium tin oxide elektrodes had in een 8 bij 4 array met elektrode diameter maten 50 tot 200 micrometer binnen een 1 cm binnendiameter glas goed. Het glas was goed gebonden aan de MEA behulp polydimethylsiloxaan (PDMS). </li><li> Steriliseer het MEA in een autoclaaf voor cel seeding. Andere sterilisatiemethoden zoals onderdompelen in 70% ethanol, UV behandeling en warmwaterbehandeling zoals elders worden gebruikt zolang zij niet de integriteit van de MEA. </li><li> Breng de geautoclaveerde MEA naar een laminaire stroming kap en plaats deze in een standaard steriele polystyreen petrischaal. Voorafgaand aan zaaien cellen op de MEA, steriliseren laminaire stroming kap door het inschakelen van het UV-licht gedurende 20 minuten. Als het MEA gevoelig is voor UV licht dekking van de petrischaal met het MEA met steriele aluminiumfolie terwijl de stroomkap onder UV-belichting. </li></ol> 2. Zaaien Cellen op de MEA <ol><li> Oogst cellen van een lopende hechtende cellijn van zoogdiercellen met trypsine / EDTA en heffen tot een concentratie van 100-200 cellen / ul in 1 ml celmedium voor plating. In onze experimenten hebben we succesvol kweken NIH 3T3 fibroblasten cellijn HeLa cellijn en primaire corticale en hippocampusneuronen de MEA. </li><li&gt; Plaats een 20-30 ul druppel media met cellen op de MEA. Breng de Petri schaal met de MEA in de incubator. Het is belangrijk dat de cel druppelgrootte is groot genoeg om alle elektroden op de MEA dekken. </li><li> 2 uur na uitzetten van de cellen de Petri schaal met de MEA overdracht van de incubator met laminaire stroming kap voorzichtig 400-500 pi pre verwarmd media (37 ° C) en aan de MEA. Controleer onder de microscoop te waarborgen dat cellen nog aan en gelijkmatig op het oppervlak MEA. Breng de MEA terug naar de incubator. De 2 uur wachttijd vóór de toevoeging van media verzekert voldoende om de cellen te hechten aan het oppervlak MEA. Toevoeging van celmedium te snel na het zaaien de cellen kan wegspoelen de cellen. Als cellen niet goed hecht aan de MEA, kan het oppervlak worden behandeld met celhechting factoren aspolylysine, fibronectine en laminine om celhechting te verbeteren. In onze HeLa cel experimenten hebben we meestal de behandeling van de MEA oppervlak met fibronectin (10 ug / ml) gedurende 1-2 uur. </li><li> 8 tot 12 uur na het zaaien van de cellen, voert u 1 tot 2 wasbeurten met PBS om alle dode cellen te verwijderen. Cell medium kan vervangen elke 24-48 uur als dat nodig is. In een typisch experiment worden de cellen gewoonlijk klaar voor transfectie 24-48 uur na uitzaaien. Om consistentie in elektroporatie efficiëntie te handhaven is het raadzaam om te wachten tot de cultuur ten minste 80% confluente voor elektroporatie. </li></ol> 3. Plaatsspecifieke Transfectie van siRNA <ol><li> Bereid nucleïnezuur oplossing. Voor siRNA transfectie bereid een 1-2 uM siRNA elektroporatie oplossing in ijskoude elektroporatie buffer tot een eindvolume van 200-400 ul bereiken. In deze video artikel tonen we de transfectie van HeLa cellen met Alexa 488 geconjugeerde gecodeerde sequentie van siRNA. </li><li> Breng de MEA met cellen van de incubator steriele laminaire stroming kap. Verwijder de cel media uit de MEA en het uitvoeren van een wassen met PBS. Daarna voeg 200-400 ui van de ice koude 1 uM siRNA elektroporatie oplossing van het goed. </li><li> Breng anodische vierkante elektrische pulsen om de beoogde elektroden (zie stap 4 voor het bepalen van optimale parameters van de elektrische puls). In onze experimenten hebben we gebruik gemaakt van een Pragmatische Instruments 2414A golfvorm generator om elektrische pulsen en een dual-inline-pakket (DIP) 16 pin clip om contact te maken met de MEA band pads genereren. De golfvorm generator kan worden aangesloten op de DIP clip via een demultiplexor printplaat om de selectiviteit van afzonderlijke elektroden leveren. Voor de referentie-elektrode Plaats een stalen kathode in de cel media. Terwijl het verlagen van de stalen referentie-elektrode in de media is het uiterst belangrijk dat het geen contact maakt met het oppervlak MEA. Bij contact kan schade aan de cellen en de MEA. Het wordt aanbevolen om de referentie-elektrode verlagen tot een positie van 1 mm boven de cellen. Een spacer met een hoogte van 1 mm worden geplaatst in de put te helpen bij de plaatsing van reference elektrode. Een alternatieve benadering voor een externe referentie-elektrode is liggende elektroden als kathode-anode paren. </li><li> Onmiddellijk na het aanbrengen van de elektrische pulsen om de beoogde elektroden op de MEA, overdragen MEA naar de incubator. Na een incubatieperiode van 5 minuten voorzichtig vervangen 75% van de elektroporatie buffer met voorverwarmde (37 ° C) cell media. Later kunnen fluorescerende beeldvorming worden gedaan om de levering van fluorescent gelabeld siRNA aan de cellen te bevestigen. </li></ol> 4. Elektroporatie Parameter Optimization <ol><li> Om de optimale elektrische stroom parameters bepalen voor elektroporatie, design elektroporatie experimenten voor verschillende waarden van pulsamplitude, pulsduur en het aantal pulsen. In onze ervaring met HeLa-cellen, stellen we vast dat een spanningspuls van amplitude van 3 V 9 V en duur van 1 msec tot 10 msec een elektrode van 100 urn tot succesvolle elektroporatie met miNimal celdood. Het is onze aanbeveling dat een parameter worden gevarieerd tijd en anderen constant gehouden. Om de electroporatie efficiency te kwantificeren voor elk van de pulsparameters gebruiken we propidiumjodide (PI), een cel impermeant kleurstof die vlekken nucleic materiaal en levende assay gebaseerde methode, zoals beschreven in stappen 4.2-4.5. </li><li> Opzet van een celkweek op de MEA volgens de instructies beschreven in stappen 1 en 2. </li><li> Vóór elektroporatie bereiden een 300-500 pl van 30 ug / ml PI oplossing in ijskoude elektroporatiebuffer en 400 ul van 4 uM calcien uur in PBS. </li><li> Breng de MEA van de incubator de laminaire stroming kap. Verwijder de cel media uit de MEA en het uitvoeren van een wassen met PBS. Daarna voeg 300-500 ui van de ijskoude elektroporatiebuffer met PI. </li><li> Breng elektrische pulsen met de gewenste puls amplitude en duur om de beoogde elektroden (De apparatuur die wordt gebruikt in onze experimenten voor het genereren en toepassen van de elektronischesche puls de MEA wordt beschreven in stap 3.3). Voor de referentie-elektrode, hetzij een stalen elektrode goed zakken in de elektroporatie buffer in de MEA of gebruik de naburige elektrode als referentie. Door selectief impulsen van veranderlijke amplitude of duur om verschillende elektroden meerdere experimenten worden uitgevoerd op hetzelfde apparaat. Bijvoorbeeld op een 32 electrode MEA kan 8 experimenten worden uitgevoerd door het splitsen van de 32 elektroden in 8 groepen, elk bestaande uit 4 elektroden. Elk van de 8 groepen kunnen vervolgens worden gestimuleerd door een rechthoekige spanningspuls van 5 msec duur met amplitudes variërend 3 V-6 V bereik van 0,5 V stappen en een groep kan worden gebruikt als een controle. </li><li> Onmiddellijk na het aanbrengen van de spanningspulsen overdragen MEA de incubator gedurende 5 minuten. Daarna voorzichtig en verwijder 75% van de elektroporatie buffer van de MEA en vervang deze door warme cel media. Breng de MEA terug naar de incubator. </li><li> Na een incubatietijd van 2-4 uuren vervangen celmedia in de MEA met 3-500 pl van 4 uM calceïne AM oplossing in PBS. Breng de MEA naar incubator gedurende 30 minuten. </li><li> Na de incubatie van de cellen met Calcein AM, vervangen Calcein AM oplossing in de MEA goed met PBS na twee wassen met PBS. Verkrijgen fluorescerende beelden van cellen met behulp van een optische microscoop met filters voor PI (excitatie / emissie - 535 nm/617 nm) en Calcein AM (excitatie / emissie - 490 nm/520 nm). De opname van PI, als gevolg van elektroporatie, zorgt ervoor dat cellen in rood fluoresceren en de calceïne AM zorgt ervoor dat cellen die in leven zijn te fluoresceren groen. Drie mogelijke scenario&#39;s die kunnen worden waargenomen zijn: 1) cel geëlektroporeerde en levend (zal fluoresceren zowel rood en groen), 2) cellen in leven, maar niet geëlektroporeerd (zal fluoresceren enkel groen) en 3) Cellen doden als gevolg van elektroporatie (zal fluoresceren alleen rood) . De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend als percentage van het totale aantal cellen in leven op de elektrode en de elektroporatie efficiency werd berekend als percentage van het totale aantal cellen geladen met PI / siRNA. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Figuur 1 toont de plaatsspecifieke laden van HeLa cellen met PI. Kan worden waargenomen dat alleen cellen op de elektrode een opname van PI (Figuur 1B) tonen. Een live assay uitgevoerd na elektroporatie werd gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen (Figuur 1A) beoordelen. De elektroporatie efficiency en cellevensvatbaarheid voor het voorbeeld in figuur 1 is 81,8% en 96,1% respectievelijk. Hoge cellevensvatbaarheid en elektroporatie efficiency kan worden bereikt door het optimaliseren van de elektroporatie pulsparameters. Plaatsspecifieke transfectie van HeLa cellen met fluorescent gelabeld siRNA voor een optimale elektroporatie puls (8 V, 1 msec) wordt getoond in figuur 2. De efficiëntie voor de elektroporatie siRNA op 8 V, 1 msec bleek 74,4 ± 16,0% encellevensvatbaarheid bleek 87,9 ± 8,4% (gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, N = 5). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Figuur 1. Site-specifieke aflevering van PI in HeLa cellen een 200 urn elektrode (6 V, 5 msec). A) Calcien gebaseerd levende assay uitgevoerd 2 uur na elektroporatie. Levende cellen worden aangegeven door groene fluorescentie. B) rode fluorescentie toont de opname van PI door cellen op de elektrode. C) Een gesuperponeerd beeld van A en B. De witte pijlen geven aan cellen die zijn geëlektroporeerde en levend. De zwarte pijlen geven cellen die dood zijn. De witte cirkel in A, B en C geeft de omtrek van de elektrode. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Figuur 2. Transfectie van HeLa cellen met fluorescent gelabeld scramble sequentie van siRNA. A) Afbeelding van HeLa cellen op een 100 urn elektrode getransfecteerd met Alexa 488 gelabeld siRNA (8 V, 1 msec). B) Afbeelding van celkernen gekleurd met DAPI. De witte cirkel geeft de rand van de elektrode.

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).</li>
<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550(2002).</li>
<li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).</li>
<li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).</li>
<li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ%2C+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+%28ethyleneimine%29+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium%3F+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
<li>Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).</li>
<li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In deze video artikel tonen we het gebruik van MEA voor plaatsspecifieke transfectie van HeLa cellen met scrambled siRNA sequentie van. Een van de voordelen van deze technologie is de toepasbaarheid van verschillende cellijnen waaronder primaire cellijnen. Onze lab eerder aangetoond dat het gebruik van deze technologie voor plaatsspecifieke transfectie van primaire hippocampale neuronale kweken van E18 dagen oude ratten en NIH-3T3 cellen met scrambled siRNA sequenties en GFP plasmide 18, 19. We hebben ook suc...

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Cel media: Geavanceerde MEM L-Glutamine 200 mM Penicilline / streptomycine Foetaal runderserum </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia Laboratoria / VWR Lonza Group Ltd Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Mobiele media samenstelling: 2% FBS, 2% L-glutamine en 2% Pennstrep Vooraf MEM </td></tr><tr><td> Trypsine EDTA </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 en rhodamine getagd roerei sequheid siRNA </td><td> Qiagen, Inc </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroporatiebuffer </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Waveform generator </td><td> Pragmatisch </td><td> 2414A </td><td> Elke golfvorm / pulsgenerator die tot het gewenste pulsen worden gebruikt. </td></tr></table>

hoog rendement, site-specific transfectie van adherente cellen met sirna met behulp van micro-elektrode arrays (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

De ontdekking van RNAi pathway in eukaryoten en de daaropvolgende ontwikkeling van RNAi middelen, zoals siRNA en shRNA, hebben een krachtige werkwijze voor silencing specifieke genen 1-8 voor functional genomics and therapeutics. Een belangrijke uitdaging die betrokken zijn bij RNAi gebaseerde studies is de levering van RNAi agenten gerichte cellen. Traditionele niet-virale aflevering technieken, zoals elektroporatie bulk en chemische transfectie methoden vaak niet de vereiste ruimtelijke controle productietijd en 9-12 veroorloven slechte transfectie-efficiëntie. Recente vooruitgang in chemische transfectiewerkwijzen zoals kationische lipiden, kationische polymeren en nanodeeltjes hebben geresulteerd in sterk verbeterde transfectie-efficiëntie 13. Echter, deze technieken nog steeds niet precies ruimtelijke controle over de levering die enorm kunnen profiteren miniatuur high-throughput technologieën, enkele cel studies en onderzoeken van cel-cel interacties aan te bieden. nt &quot;&gt; Recente technologische ontwikkelingen in gentherapie hebben ingeschakeld high-throughput transfectie van hechtende cellen 14 tot 23, waarvan een meerderheid te gebruiken microschaal elektroporatie. Microscale elektroporatie biedt nauwkeurige spatio-temporele controle over de levering (tot enkele cellen) en is aangetoond Bovendien te bereiken hoge rendementen 19, 24-26., kan elektroporatie benaderingen vereisen een langere incubatietijd (gewoonlijk 4 uur) met siRNA en DNA complexen als noodzakelijk chemische basis transfectiewerkwijzen en leiden tot directe invoer van naakt DNA en siRNA moleculen in de cel cytoplasma. Bijgevolg genexpressie kan worden bereikt al zes uur na transfectie 27. Onze lab eerder het gebruik van micro-elektrode arrays (MEA) voor plaatsspecifieke transfectie in zoogdiercellen hechtende celkweken 17-19 aangetoond. In de MEA aanpak, wordt de levering van genetische lading bereikt via lokale micro-schaal electroporatiop cellen. Een toepassing van elektrische puls om geselecteerde elektroden genereert lokaal elektrisch veld dat leidt tot elektroporatie van cellen in de regio van de gestimuleerde elektrodes. De onafhankelijke controle van de micro-elektroden biedt ruimtelijke en temporele controle transfectie en kunnen meerdere transfectie gebaseerde experimenten worden uitgevoerd op dezelfde cultuur verhogen van de doorvoer en experimentele verminderen cultuur naar cultuur variabiliteit. Hier beschrijven we de experimentele opstelling en het protocol voor gerichte transfectie van het aanklevende HeLa cellen met een fluorescent gelabeld gecodeerde volgorde siRNA met behulp van elektroporatie. Hetzelfde protocol kan ook gebruikt worden voor transfectie van plasmide vectoren. Daarnaast kan de hier beschreven protocol eenvoudig worden uitgebreid om verschillende zoogdiercellijnen met kleine modificaties. Commerciële beschikbaarheid van MEA&#39;s met zowel vooraf gedefinieerde en aangepaste elektrode patronen te maken van deze techniek toegankelijk to meest onderzoekslaboratoria met basis celkweek apparatuur.

Het artikel beschrijft de protocol voor plaatsspecifieke transfectie van gecodeerde sequentie van siRNA in een hechtende zoogdiercelkweek met een micro-elektrode array (MEA).

Hoog rendement, Site-specific Transfectie van adherente cellen met siRNA Met behulp van micro-elektrode arrays (MEA)

De ontdekking van het RNAi-pad in eukaryoten en de daaropvolgende ontwikkeling van RNAi-middelen, zoals siRNA en shRNA, hebben geleid tot een krachtige methode voor ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om locatie-specifieke transfectie in adherente cellen te bereiken. Dit wordt gerealiseerd door een monocultuur van cellen op een micro-elektrode-array te kweken. Als tweede stap leidt de toepassing van een elektrische puls op geselecteerde elektroden tot electroporatie van de doelcellen die op de elektroden zijn geadhereerd.Dit leidt tot de vorming van poriën in het celmembraan waardoor exogene moleculen de cel kunnen binnendringen. De doelcellen kunnen vervolgens worden gescreend om het resulterende fenotype aan te tonen met behulp van een geschikte assay. De hier beschreven microscale transfectietechniek heeft verschillende belangrijke voordelen ten opzichte van conventionele transfectietechnieken, zoals bulk-elektroporatie of chemische transfectie.A, het stelt ons in staat om een uitmuntende ruimtelijke controle over het transfectieproces zelf te bereiken en helpt ons om individuele cellen of clusters van cellen met een hoge efficiëntie te transfecteren, zelfs in cellijnen die moeilijk te transfecteren zijn. B, het is een benadering die gemakkelijk op te schalen is en ons helpt om moleculaire assays met een hoge doorvoersnelheid te realiseren. Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van een micro-elektrode-array voor site-specifieke transfectie is dat het gelijktijdige functionele beoordeling van de doelcellen mogelijk maakt, zoals kwantitatieve elektrofysiologie en morfologische veranderingen.Om de procedure te starten, wordt de MEA in een autoclaaf gesteriliseerd. Verplaats vervolgens de geautoclaveerde MEA naar een laminaire flowkast en plaats deze in een standaard steriele polystyreen Petrischaal voordat de cellen op de MEA worden gezaaid. Steriliseer de laminaire flowkast door de UV-lamp gedurende 20 minuten aan te zetten. Als de MEA gevoelig is voor UV-licht, dek dan de Petrischaal met de MEA af met steriel aluminiumfolie terwijl de flowkast onder UV-bestraling staat. Behandel vervolgens het oppervlak van de MEA voor helo-cellen gedurende één tot twee uur met 10 µg/mL fibronectine.Voer een spoeling uit met DI-water en laat de MEA aan de lucht drogen in de laminaire flowkast. Oogst daarna de cellen van een actieve cellijn van adherente zoogdiercellen met behulp van trypsine EDTA en breng ze op een concentratie van 100 tot 200 cellen per µL in één milliliter celmedium voor het uitplaten. Plaats vervolgens een druppel van 20 tot 30 µL medium met cellen op de MEA.Zorg ervoor dat deze groot genoeg is om alle elektroden op de MEA te bedekken. Plaats vervolgens de Petri-schaal met de MEA in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Twee tot vier uur.Na het uitplaten van de cellen wordt de petrischaal met de MEA vanuit de incubator overgebracht naar de laminaire flowkast. Voeg vervolgens voorzichtig 400 tot 500 µL voorverwarmd medium van 37 °C toe aan de MEA-put en controleer onder de microscoop of de cellen nog steeds gehecht zijn en gelijkmatig over het MEA-oppervlak verspreid zijn. Plaats de MEA daarna terug in de incubator. Voer acht tot 12 uur na het uitplaten van de cellen één tot twee wasbeurten met PBS uit om dode cellen te verwijderen.In een typisch experiment zijn de cellen gewoonlijk 24 tot 48 uur na het uitplaten klaar voor transfectie. Om de consistentie in de electroporatie-efficiëntie te behouden, wordt aanbevolen om te wachten tot de cultuur bijna confluent is voordat de electroporatie plaatsvindt. Om een zeer efficiënte sRNA-transfectie te bereiken, is het noodzakelijk om eerst de optimale parameters voor de electroporatie-voltagepuls voor een gegeven MEA te bepalen.Hier beschrijven we een reeks experimentele stappen waarbij propidiumjodide wordt gebruikt om de optimale electroporatieparameters te bepalen voorafgaand aan de electroporatie. Bereid een oplossing van 300 tot 500 µL van 30 µg/mL PI in ijskoud electroporatiebuffer voor, en 400 µL van een 4 µM calcium AM-oplossing in PBS. Plaats vervolgens de MEA vanuit de incubator in de laminaire flowkast.Verwijder het celmedium uit de MEA en voer een wasbeurt uit met PBS. Voeg vervolgens 300 tot 500 µL van de ijskoude electroporatiebuffer met pi toe. Plaats daarna een spacer van één millimeter hoog in de MEA.Het is uiterst belangrijk om ervoor te zorgen dat dit de cellen in het centrum van de MEA niet raakt. Sluit vervolgens de MEA aan op de elektrische interconnect en selecteer de gewenste elektroden voor elektroporatie. Pas daarna de elektrische pulsen met de gewenste pulsamplitude en duur toe op de doelelektroden voor de elektroporatiestap.Laat de met aluminiumfolie bedekte stalen kathode in de MEA-put zakken tot deze contact maakt met de spacer van één millimeter. Pas direct daarna elektrische pulsen toe op de doelelektroden. Herhaal vervolgens deze stap met een andere set elektroden, afhankelijk van het experimentele ontwerp.In onze experimenten met helo-cellen observeerden we dat een enkele spanningspuls met een amplitude van drie volt tot negen volt en een duur van één milliseconde tot 10 milliseconden, bij een elektrode van 100 µm, leidde tot succesvolle elektroporatie met minimale celsterfte. Plaats de MEA direct na het toepassen van de spanningspulsen gedurende vijf minuten in de incubator.Na een incubatieperiode van vijf tot 10 minuten wordt de afstandhouder voorzichtig uit de MEA verwijderd. Verwijder vervolgens 75% van de electroporatiebuffer uit de MEA-well en vervang deze door warme celmedium. Plaats de MEA daarna terug in de incubator.Vervang na een incubatieperiode van twee tot vier uur het celmedium in de MEA-put door 300 tot 500 µL van een 4 µM calcium AM-oplossing in PBS. Plaats de MEA na incubatie van de cellen met calcium AM gedurende nog eens 30 minuten terug in de incubator. Vervang het calcium AM in de put door PBS na een wasstap, en maak vervolgens fluorescente beelden van de cellen met een optische microscoop voorzien van filters voor pi.De opname van PI door elektroporatie zorgt ervoor dat de cellen rood fluoresceren, en het calcium AM zorgt ervoor dat de levende cellen groen fluoresceren. De cellevensvatbaarheid voor elke elektrode kan worden geschat met deze vergelijking, en de elektroporatie-efficiëntie voor elke elektrode kan worden geschat met deze vergelijking. Zodra de optimale elektroporatieparameters zijn bepaald, kunnen deze worden gebruikt voor locatie-specifieke aflevering van een a-molecuul, en de elektroporatieprocedure voor siRNA-moleculen is hetzelfde als de elektroporatieprocedure voor pi.Hier wordt de plaatsespecifieke afgifte van propidiumjodide getoond in HeLa-cellen op een elektrode van 200 micrometer. De calciumgebaseerde live-assay werd twee uur na electroporatie uitgevoerd. De levende cellen worden hier aangegeven door groene fluorescentie, en de rode fluorescentie hier demonstreert de opname van PI door cellen op de elektrode.Hier is de supergeponeerde afbeelding. Deze cellen zijn geelektroporeerd en levend, terwijl deze cellen dood zijn. Deze figuur toont de transfectie van rumine-gelabeld irna op een elektrode met een diameter van 200 micrometer, en deze figuur toont de transfectie van hela-cellen met Alexa 4 88-gelabeld irna op een elektrode met een diameter van 100 micrometer.De witte pijlen geven de cellen aan die getransfecteerd zijn met irna, terwijl de zwarte pijlen de dode cellen aangeven. De techniek die we hier hebben gedemonstreerd kan worden uitgebreid naar verschillende cellijnen, inclusief primaire cellijnen die moeilijk te transfecteren zijn, en om deze te transfecteren met grotere moleculen zoals plasmiden en eiwitten.

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier gebruiken we een menselijke esiRNA bibliotheek in een high-throughput screen voor genen die betrokken zijn bij de celdeling. Laten we zien hoe het opzetten en uitvoeren een esiRNA schermen, en hoe te analyseren en valideren van de resultaten.

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

The video demonstrates how to use a microelectrode array (MEA) to record the electrophysiological activity of neurons derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Electrophysiological activity from a multiwell MEA containing a neuron-astrocyte co-culture is recorded to detect action potentials from multiple neurons in the network, confirming the successful differentiation of hiPSCs into neurons.

Measuring the Electrophysiological Activity of Neuronal Networks Using Micro-Electrode Arrays

We beschrijven een methode voor depletie-reddingsexperimenten die de cellulaire integriteit en eiwithomeostase behoudt. Adenofectie maakt functionele analyses van eiwitten mogelijk binnen biologische processen die afhankelijk zijn van fijn afgesteld actine-gebaseerde dynamica, zoals mitotische celdeling en myogenese, op het niveau van een enkele cel.

Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.

Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering

Dit protocol beschrijft een hoge doorvoer plasmide transfectie van zoogdiercellen in een 384-goed plaat met behulp van akoestische druppel ejectie technologie. De tijdrovende, foutgevoelige DNA-afgifte en multiplexing, maar ook de transfectie-reagens afgifte, zijn softwaregestuurd en worden uitgevoerd door een nanodispenser apparaat. De cellen worden vervolgens in deze voorgevulde putten gesest.

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

Dit protocol heeft tot doel een nieuwe methodologie te beschrijven om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten met behulp van micro-elektrode array-registratie van het hele sinoatriale knoopweefsel om pacemaking-defecten bij muizen te identificeren. Farmacologische middelen kunnen ook in deze methode worden geïntroduceerd om hun effecten op intrinsieke pacemaking te bestuderen.

Micro-elektrode array-opname van de vuursnelheid van de sinoatriale knoop om intrinsieke cardiale pacemakingdefecten bij muizen te identificeren

De combinatie van laserporosatie en micro-elektrode arrays (MEA) maakt actiepotentiaalachtige opnames van gecultiveerde primaire en stamcel-afgeleide cardiomyocyten mogelijk. De golfvorm biedt superieur inzicht in het werkingsmechanisme van teststoffen dan standaardopnamen. Het koppelt patch-clamp en MEA-uitlezing om cardioveiligheidsonderzoek in de toekomst verder te optimaliseren.

Laser-geïnduceerde actiepotentiaal-achtige metingen van cardiomyocyten op micro-elektrode arrays voor verhoogde voorspelbaarheid van veiligheidsfarmacologie

Leer site-specifieke transfectie van adherente cellen met siRNA via micro-elektrode arrays. Deze methode biedt precieze ruimtelijke controle en hoge efficiëntie voor gentherapieonderzoek.

Hoog rendement, Site-specific Transfectie van adherente cellen met siRNA Met behulp van micro-elektrode arrays (MEA)

Meer video's verkennen