Name: Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: Leer hoe u dubbele elektrofysiologische opnames van neuronen en astrocyten uitvoert in acute hippocampus-snedes. Deze methode onthult de dynamische neurogliale interacties tijdens synaptische transmissie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, en Roch Chopier, die de video en animaties, evenals Florian Beck bedanken voor de foto&#39;s en de post-productie van de video voice-over. Dit werk werd gesponsord door Olympus en worden ondersteund door subsidies van de HFSPO (Career Development Award), ANR (Programma Jeunes chercheurs en programma Blanc Neurowetenschappen), FRC (Federation pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM en La Pitie-Salpêtrière ziekenhuis (Translationeel onderzoek contract) aan NR, van Frans Research ministerie en Deutsche Forschungsgemeinschaft postdoc beurzen naar UP, en van de doctoral school &quot;Frontiers in Life Science&quot;, Paris Diderot Universiteit, Bettencourt Schuller stichting, en FRM (Fondation pour la Recherche Medicale) doctorale beurs aan JS

1. Voorbereiding van kunstmatige cerebrospinale vloeistof en intracellulaire oplossing <ol><li> Voordat de proef, moet men de interne oplossing bereid voor de patch clamp opnames, evenals de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor de bereiding hippocampus. U zal bovendien behoefte aan een dissectie kit bestaande uit chirurgische schaar en fijne iris schaar, twee spatels en een pincet (Fine Science Tools), een glas vergassen apparaat (micro-filter kaars, Robu Duitsland) en weefsel net (klamboe of nylon strak), alsmede superlijm (Uhu Dent). De configuratie van de elektrofysiologie slice patch setup werd door Finkel &amp; Bookman, 2001 1. </li><li> Voor de interne oplossing opgelost (in mM): 105 K-gluconaat, 30 KCl, 10 HEPES en 0,3 EGTA in gedeïoniseerd water (in 70-80% van het uiteindelijke volume). Koel de oplossing tot 4 ° C en voeg (in mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris en 10 creatinefosfaat. Breng de pH op 7,4 met KOH en vul up met gedeïoniseerd water om het eindvolume. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtreer deze oplossing (poriegrootte 0,2 pm). Gealiquoteerd oplossing is 3-4 weken bij - 20 ° C. Voor een experimentele dag, ~ 1 ml interne oplossing nodig. </li><li> Tenzij anders vermeld, de hippocampus ACSF voor bereiding en opnames van cellen in het CA1-gebied bevat (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,3 MgSO4, 1 NaH 2PO 4, 26,2 NaHCO3 en 11 glucose. Deze zouten opgelost in gedeïoniseerd water (~ osmolariteit 320 mOsm) en zuurstof deze oplossing gedurende ten minste 10 min (pH ~ 7,3 tot 7,4) met carbogen (95% O2 en 5% CO2). Bereid ten minste 1 liter oplossing per experiment. Bijzondere zorg moet worden genomen voor de bereiding van hippocampale weefsel dat wordt gebruikt om de experimenten uit te voeren in CA3 gebied van de hippocampus. Inderdaad, deze regio gekenmerkt activiteit en daaropvolgende neuronale dood epileptische. Zo synaptIC activiteit moet sterk worden verminderd tijdens slice voorbereiding, en dit wordt bereikt door het uitvoeren van de hippocampus dissectie in ijskoude sucroseoplossing bevattende (in mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 1 NaH 2PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 en 75 Sucrose Glucose. In deze oplossing, de combinatie van lage natrium, laag calcium en magnesium hoge concentraties massaal verminderen presynaptische vuren en afgifte waarschijnlijkheid evenals postsynaptische NMDA receptor activiteit, dus het minimaliseren van spontane activiteit en celdood. Na bereiding hippocampale plakken voor opnamen van cellen van het CA3 regio geperfundeerd met gemodificeerde ACSF, die 4 mM CaCl 2 en 4 MgSO4, om polysynaptic activiteit te minimaliseren. </li></ol> 2. Acute hippocampus Slice Voorbereiding <ol><li> Afkoelen ~ 300 ml van ACSF voor versnijding kamer, alsmede voor de bereiding bij 4 ° C, onder voortdurend zuurstof metcarbogen. Bereid een klein bekerglas met ACSF bij kamertemperatuur (RT) slice opslag, ook met zuurstof carbogen (Schema figuur 1). </li><li> Verdoof de muis onder een kap met een klein papieren handdoek gedrenkt in 1 ml isofluraan die wordt toegevoegd in de kooi. </li><li> Nadat de muis is diep verdoofd, knip de kop eraf en voeg het direct toe in een kleine schotel met ijskoude zuurstofrijk ACSF. Verwijder de hoofdhuid met een kleine schaar en breng het hoofd naar weefsel voor de volgende stappen. Beginnen de hippocampus ontleden, zoals afgebeeld en beschreven in figuur 1. </li><li> Snijd 300-400 pm dikke transversale plakjes lage snelheid (3 um / sec) en trilfrequentie van 70 Hz in ijskoude zuurstof ACSF, en deze overbrengen naar een opslagruimte. Laat de plakjes rusten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur vóór opname. Plakken voor CA3 experimenten opgeslagen 25 min bij 34 ° C en ten minste 30 min bij kamertemperatuur, te herstellen van de snijproces. </li></ol&gt; 3. Dual Recording van Evoked astrogliale Stromen en Neuronale Field Potentials We beschrijven hier hoe u opnemen astrogliale en neuronale responsen, dwz reacties veroorzaakt door synaps activering door afference stimulatie met behulp van een extracellulaire elektrode synaptisch-opgeroepen. <ol><li> Voortdurend perfuseren de opname kamer met ACSF geoxygeneerde (1.5-2 ml / min, RT), dat 100 uM picrotoxin (GABA A antagonist) aan exciterend reacties isoleren. Breng een plak op een poly-L-lysine (1,5 tot 3 mg / ml) bekleed dekglaasje, genieten de vloeistof een goede hechting slice en voeg een druppel ASCF bovenop de slice. Plaats het dekglaasje in de opname kamer. Blokkade van remmende overdracht door picrotoxin kan resulteren in epileptische activiteit, namelijk spontaan synchrone afvuren van neuronale populaties, waarbij de meting van opgewekte gebeurtenissen verstoren. Dus om epileptische activiteit te voorkomen, eenDos (alleen het oppervlak) tussen de CA1 en CA3 gebieden op de voortplantingsrichting via de Schaffer collateralen (zoals in figuur 2a) te voorkomen. </li><li> Stratum radiatum astrocyten kunnen worden geïdentificeerd door hun kleine omvang soma (~ 10 micrometer) en stellatum proces montage. Kies een cel ten minste 20-30 urn onder het oppervlak slice. Monteer een glazen stimulatie-elektrode (tip weerstand ~ 1 MQ) op de zilveren draad die is aangesloten op de stimulus isolatie box en geaard op het bad (eenvoudig door het wikkelen van de tweede zilver draad rond de glazen pipet). Plaats de stimulatie-elektrode in de Schaffer zekerheid regio, zoals aangegeven in figuur 2A op een afstand van 200-300 urn afstand van de gekozen astrocyten. Monteer het gebied registratie-elektrode (~ 2-5 MQ) op een gechloreerd zilverdraad verbonden met de headstage van de versterker. Beide elektroden zijn gevuld voordat met ACSF. Kies in Multiclamp de modus I = 0, wat externe com uitgeschakeldmand ingang en plaats de elektrode ~ 50 urn afstand van de astrocyten in het stratum radiatum gebied (figuur 2A). Noteer de reacties met Gain 2 tot 10 en filter met 2 kHz Bessel filter. Elektrische stroom injectie in de hersenen slice triggers actiepotentialen in de omliggende Schaffer onderpand axonen en de daaropvolgende afgifte van transmitter op de presynaptische terminals dat project aan de postsynaptische CA1 pyramidale neuronen. De vrijgekomen zenders zal leiden tot een positieve lading stroom in de cellen door postsynaptische ionotrope-receptoren, die meetbaar extracellulair als een kleine negatieve potentiaal. Dit veld excitatoire postsynaptische potentiaal (fEPSP) integreert de activiteit van een groep gelijktijdig actief neuronen, terwijl remmende transmissie farmacologisch geblokkeerd. Breng wat stroomstoten (0,1 msec duur) om een ​​fEPSP roepen, sommige herpositionering van de stimulatie-elektrode kunnen helpen om de fEPSP te verhogen. Een typische CA1 stratum Radiatum fEPSP wordt geïllustreerd in figuur 2B. Verdere details over positionering en golfvormen reactie vindt in Yuan et al.. 2003 2. De fEPSP amplitude in een gezonde hippocampus slice moet meestal meer dan tweemaal zo groot als de amplitude van de vezel volley. Voor nauwkeurige kwantificering van fEPSP amplitude of helling moet de opgeroepen respons te monosynaptic als polysynaptic activiteit (detecteerbaar als een multi-piekrespons) geeft synaptische activiteit onafhankelijk van de elektrische stimulatie, wat een teken voor hyperexciteerbaarheid zijn. Voor experimenten in de CA3 gebied van de hippocampus zijn stimulatie als opname pipetten gepositioneerd zoals weergegeven in figuur 3C. Om duidelijk te identificeren mosvezel ingangen, die sterk vergemakkelijken, gekoppeld-puls stimulatie (50 msec interpuls interval) en 1 Hz stimulatie gedurende enkele seconden worden toegepast op massaal verbeteren van de aanvankelijk lage amplitude opgeroepen fEPSP responses.At het eindevan het experiment DCGIV een mGluR2 / 3 receptor antagonist, kan worden gewassen om verder te verifiëren dat inderdaad mosvezel inputs gestimuleerd. De toepassing van deze antagonist moet verminderen de fEPSP met ~ 90% te wijten aan de hoge expressie van mGluR2 / 3 receptoren, remmen presynaptische vrijlating uit mosvezel boutons. </li><li> Vul een patch pipet (~ 2-5 MQ) met interne oplossing gefiltreerd en monteren op een gechloreerde zilverdraad met de tweede headstage toepassen positieve druk met een injectiespuit, die via slangetje om pipethouder. Voortdurend toepassen van een 20 msec testpuls van 10 mV en beweeg de pipet in het weefsel tot aan het celoppervlak en de doorbuiging van het membraan zichtbaar. Nulpuntverschuiving de pipet, verwijder de positieve druk, en klem het membraan naar - 80 mV. Wachten tot een gigaseal (ten minste 1 GΩ) bereikt (het mag niet langer dan enkele seconden). Gentle toepassing van een aantal negatieve druk zou kunnen helpen om ag te bereikenigaseal. Breken in de cel wordt bereikt door een korte toepassing van negatieve druk of met de zap functie Multiclamp. Start de gelijktijdige opname van de Schaffer onderpand opgeroepen fEPSP en de astrogliale respons in spanning klem (Vhold - 80 mV; frequentie 0,1 Hz, Bessel-filter 2 kHz, gain 10). De astrogliale huidige reactie is bifasisch: eerst zul je een snelle voorbijgaande uiterlijke huidige zie, als gevolg van fEPSPs gegenereerd door aangrenzende piramidale cellen. Dit wordt gevolgd door een langzaam stijgende en vervallen binnenwaartse stroom (aanhoudende enkele seconden (&gt; 10 sec) na beëindiging van neuronale reacties). Deze stroom is voornamelijk te wijten aan kalium binnenkomst in astrocyten, na vrijgave door de omliggende gedepolariseerde postsynaptische terminals. Een gelijktijdig geactiveerd snel voorbijgaande glutamaat transporter stroom (GLT), veroorzaakt door presynaptische glutamaat release wordt gemaskeerd door de kalium stroom. De holding potentieel van de astrocyten, en de toegang weerstand van de pleister moet monitored gehele experiment en mag niet meer variëren dan ~ 20%, een onnauwkeurige controle van astrogliale REPONSES door veranderingen in de opnameomstandigheden voorkomen. Alleen astrocyten met een oorspronkelijke bedrijf potentieel&gt; -70 mV moeten worden onderzocht om gezonde cellen te bestuderen. </li><li> Schakelen van voltage-clamp bij lopende om de opgewekte astrocytische membraandepolarisatie nemen. Isoleer de gliale glutamaat transporter (GLT) stroom door perfusie van de ionotrope glutamaat receptor blokker kynurenic zuur (5 mM), totdat de fEPSP volledig geblokkeerd en de GLT amplitude heeft een plateau bereikt. Om duidelijk de GLT stroom, gelden de specifieke antagonist DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic zuur (DL-TBOA, 200 uM). Verhoog de stimulatie sterkte 2-voudig tot 5-voudig tot neuronale en astrogliale reacties opnemen met verschillende synaptische sterkte, en twee dicht bij elkaar gelegen stimuli (50 msec interval) toegepast om reacties te onderzoeken gepaarde puls stimulatie. Stabiliteit van de serie rWeerstand en membraanpotentiaal van de gliale cel worden gevolgd gedurende de opname. </li><li> Een beeld van de omvang van de gap-junction gemedieerd astrogliale netwerken moet kleurstof koppeling experimenten worden uitgevoerd in stroomtang modus, zonder stroominjectie, van passieve diffusie van laag moleculaire kleurstoffen (&lt;1,5 kDa), zoals sulforhodamine-B kunnen, door middel van gap junction kanalen. Om kleurstof spillover te minimaliseren in het omliggende weefsel, dient positieve druk worden toegepast door middel van de patch pipet net bij het betreden van het weefsel en de pleister moet zo snel mogelijk worden bereikt. </li></ol>

<ol><li>Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinkel%2C+A+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. Crawley, J. N., et al. , (2001).</li>
<li>Yuan, Y. A., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elelctrophysiological+studies+of+neurotoxicants+on+central+synaptic+transmission+in+acutely+isolated+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2003).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+release+monitored+with+astrocyte+transporter+currents+during+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP.</a> Neuron. 21, 425-433 (1998).</li>
<li>Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+glutamate+release+during+LTP+with+glial+transporter+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents.</a> Neuron. 21, 435-441 (1998).</li>
<li>Pannasch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+networks+scale+synaptic+activity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).</li>
<li>Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-evoked+increases+in+extracellular+potassium+modulate+presynaptic+excitability+in+the+CA1+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus.</a> J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+buffering+during+slow+and+paroxysmal+sleep+oscillations+in+cortical+networks+of+glial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transporters+buffer+synaptically+released+glutamate+on+a+submillisecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).</li>
<li>Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+glutamate+clearance+and+synaptic+efficacy+by+glial+coverage+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons.</a> Science. 292, 923-926 (2001).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+contribution+to+glutamate+uptake+at+Schaffer+collateral-commissural+synapses+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporter+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature. 1, 1235-1247 (2006).</li>
<li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology%3A+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).</li>
<li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li>
<li>Castro, M. A. D. i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nature. 14, 1276-1284 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature. 13, 759-766 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dual opname van synaptisch-neuronale en gliale reacties is een bruikbare methode voor online veranderingen te bestuderen in pre-en postsynaptische activiteiten geassocieerd met veranderingen in astrogliale eigenschappen. De synaptisch-opgeroepen gliale membraan depolarisatie is een directe maat voor de extracellulaire kalium stijging 8, mede als gevolg van presynaptische actiepotentiaal afvuren, maar vooral aan de postsynaptische depolarisatie 7. Daarom opnamen van gliale membraanpotentiaal dynamiek kan worden gebruikt om wijzigingen in presynaptische prikkelbaarheid, postsynaptische activiteit extracellulaire ruimte volume en kalium buffering capaciteit 6, 8 onderzoeken. De astrogliale glutamaat transporter stroom is een gevoelige maat voor presynaptische glutamaat release, in staat om op korte termijn wijzigingen in release waarschijnlijkheid 3, 5, 9 monitoren. Voorts kan worden gebruikt om de functionele synapse-glia interacties karakteriseren verschillende synapsen of in verschillende ontwikkelingsstadia stleeftijd van 10. Benadrukt moet worden dat GLTs zeer temperatuurgevoelig zijn 11 en worden door de elektrochemische gradiënt van Na +, K + en H +12. Dus de amplitude en kinetiek van de huidige GLT sterk afhankelijk van de gekozen experimentele voorwaarden. Bovendien is de werkelijke tijdsverloop van astrogliale glutamaat klaring uit de opgenomen GLT huidige bekende gedeeltelijk worden bedekt. Dit komt door het filteren van GLT stromen door factoren zoals de elektrotone eigenschappen van astrocyten of asynchrone zender release die de kinetiek verstoren 13. Werkwijzen extraheren van de temporele kenmerken van de filter mechanismen ontwikkeld en kunnen worden gebruikt om de werkelijke glutamaat klaring tijdsverloop in fysiologische of pathologische situaties, 6,13,14 recenly uitgevoerd. Daarnaast is de gelijktijdige opname van de astrogliale membraan depolarisatie, in stroomtang, kan INSIGhts naar mogelijke wijzigingen van extracellulaire kalium transiënten. Single astrocyten tot contact tot 100.000 synapsen van ~ 100 verschillende neuronen, en hebben daarom te integreren en die de werking van de lokale neuronale netwerken. Bij het ​​gebruik van de techniek hier gepresenteerd, dat wil zeggen het opnemen elektrofysiologische hele-cel responsen van astrocyten tot inzichten in basale synaptische activiteit te krijgen, moet men in gedachten houden dat in astrocyten, patch-clamp opnames op het soma-niveau kunnen detecteren stromen grotendeels afkomstig van de cel soma of proximale processen. Inderdaad, stromen gedetecteerd bij de soma slechts gedeeltelijk afkomstig fijne distale processen bij sterke activatie van receptoren en kanalen voorkomende in meerdere fijne processen genereren stromen propageren naar de cel soma. Zo basale receptor en activiteit op het kanaal in individuele kleine astrogliale processen met betrekking tot synaptische compartimenten is nauwelijks waarneembaar. Dit is deels te wijten aan de beperkte Spatial en tijdelijke controle van membraan stromen en spanningen door whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten in situ. Er moet echter worden opgemerkt dat het oppervlak van de overvloedige kleine astrocytische processen overschrijdt de membraanoppervlak van de soma en hoofdprocessen. Bovendien zijn deze perisynaptic astrogliale microdomeinen bevatten functioneel relevante receptoren en kanalen, die waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in neuroglial communicatie en synaptische regeling. De techniek die we hier gepresenteerde is dus vooral handig om de astrocytaire integratie van synchrone activiteit van neuronale ensembles studeren, die zich in het bijzonder tijdens afference stimulatie. Het moet niet worden gebruikt om de dialoog tussen individuele synapsen en aangrenzende fijne astrocytische processen die onder basale spontane activiteit te bestuderen. Een alternatieve methode om lokale astrogliale geïnduceerd door basale synaptische activiteit te bestuderen zou zijn patch-clamp opnames uitvoeren van fijn processen, deen in dendrieten 15. Hoewel het patchen van deze fijne astrogliale processen wordt waarschijnlijk uitdagend door hun kleine omvang, is het waarschijnlijk een laan te streven naar meer intieme dialoog tussen astrogliale microdomeinen en individuele synapsen te ontrafelen. Echter, de kans klein elektrofysiologische astrogliale reacties als gevolg van individuele geldboete astrogliale processen onder de drempel-detectie, omdat elektrische ruis bereikt in de gemiddelde 3 tot 5 pA in patch-clamp opnames. Een andere methode om astrogliale reacties studeren om synaptische activiteit is calcium beeldvorming, omdat de activering van astrocytaire membraan receptoren of transporters door neuroactive stoffen kan leiden tot intracellulaire calcium transiënten. Echter, bulkverlading van astrocyten met calcium indicatoren ook weerspiegelen voornamelijk somatische activiteit 16. De combinatie van elektrofysiologie en calcium beeldvorming maakt het ook mogelijk het detecteren van kleine calcium signalen van fijn astrogliale wijze verkregen die zich spontaan of getriggerd by minimale synaptische stimulatie 17, 18. Echter, men moet in gedachten houden dat met hoge affiniteit calcium indicatoren kunnen fungeren als calcium buffers, het remmen van belangrijke calcium signaalwegen, terwijl een lage affiniteit indicatoren zou kunnen werken beneden het detectieniveau. Tenslotte een elegant en niet-invasieve techniek om calcium gebeurtenissen in fine astrocytische processen die ook uitwassen van intracellulaire signaalmoleculen omzeilt in whole-cell patch-clamp, onderzoek bestaat uit een membraan gerichte calcium sensor, die kan worden uitgedrukt in astrocyten in situ, evenals in vivo 19. Echter, calcium imaging alleen informatie over een signaalmolecuul die betrokken is in veel, maar niet alle cellulaire activiteiten, terwijl gehele-cel patch-clamp geeft kwantitatieve informatie over de verschillende ionische stromen geactiveerd op kanaal receptor activatie. Daarom gelijktijdige elektrofysiologische opnamen van neuronen en astrocytenzijn een unieke en krachtige methode om te ontrafelen online de dynamiek van neuroglial ionische signalering en haar rol hersenen informatie verwerken.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Picrotoxin </td><td> Sigma </td><td> P1675 </td><td> oplossen in DMSO </td></tr><tr><td> Kynurenic Acid </td><td> Tocris </td><td> 0223 </td><td> lossen bij 34 ° C roeren of sonicatie </td></tr><tr><td> DL-TBOA </td><td> Tocris </td><td> 1223 </td><td> DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

dubbele elektrofysiologische opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en neuronale responsen bij acute hippocampus slices

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocyten vormen samen met neuronen tripartiete synapsen, waar ze integreren en moduleren neuronale activiteit. Inderdaad, astrocyten voelen neuronale input door activering van hun ionkanalen en neurotransmitter receptoren, en verwerken van informatie voor een deel door middel van de activiteit-afhankelijke afgifte van gliotransmitters. Bovendien astrocyten de belangrijkste opname te vormen voor glutamaat, bijdragen aan kalium ruimtelijke buffering, alsmede GABA klaring. Deze cellen dan ook voortdurend op synaptische activiteit, en zijn daardoor gevoelig indicatoren voor veranderingen in synaptisch uitgebrachte glutamaat, GABA en extracellulaire kalium. Bovendien kunnen veranderingen in astrogliale opname activiteit of buffercapaciteit ernstige effecten op de neuronale functies, en kan het hoofd worden gezien bij het karakteriseren van fysiopathologische situaties of knock-out muizen. Dubbele registratie van neuronale en astrogliale activiteiten is dan ook een belangrijke methode om veranderingen te bestuderen insynaptische kracht geassocieerd met veranderingen in de astrogliale opname en buffering capaciteiten gelijktijdige. Hier beschrijven we hoe u de hippocampus plakjes, hoe stratum radiatum astrocyten te identificeren, en hoe tegelijkertijd neuronale en astrogliale elektrofysiologische respons op te nemen voor te bereiden. Daarnaast beschrijven we hoe u farmacologisch de synaptisch-opgeroepen astrogliale stromingen isoleren.

Een vertegenwoordiger gelijktijdige registratie van synaptisch opgewekte astrogliale en neuronale reacties (fEPSPs) in het CA1 gebied van de hippocampus wordt getoond in figuur 2 AB. De opgewekte stroom is astrogliale bifasisch, dat wil zeggen het bestaat uit een voorbijgaande passieve stroom en een langzaam rottende binnenwaartse stroom (&gt; 10 sec) (Figuur 2B). De uiterlijke huidige weerspiegelt de opgeroepen fEPSP, en wordt geblokkeerd na remming van ionotrope glutamaat receptoren door kynurenic zuur (donkergrijs spoor, Figuur 2B) 3. Het merendeel van de langzame binnenwaartse stroom reflecteert kalium binnenkomst in de astrocyten volgende postsynaptische depolarisatie, aangezien ook afgeschaft door kynurenic zuur dat postsynaptische ionotrope glutamaatreceptor activiteit remt (figuur 2B en figuur 2C 1) 3-6, waarover de belangrijkste vertegenwoordigen bron (80%) kalium release 7. De resterende een snel stijgended rottende binnenwaartse stroom wordt geremd door DL-antagonist GLT TBOA (lichtgrijs trace, figuur 2B en figuur 2C 2). Post-hoc aftrekken van de resterende langzame stroom in TBOA (lichtgrijs trace) van de stroom in kynurenic acid (donkergrijs spoor) kan de isolatie van de pure astrogliale glutamaattransporter stroom (black trace), zoals geïllustreerd in figuur 2C 2. De aanhoudende langzaam rottende stroom in kynurenic zuur en TBOA (lichtgrijs trace, figuur 2B en figuur 2C 2) worden geblokkeerd door TTX (data niet getoond), en weerspiegelt waarschijnlijk de ophoping van extracellulaire K + model in presynaptische afferente bakken 3. Matige enkele stimulering van Schaffer collateralen induceert een relatief grote synaptisch opgewekte stroom astrogliale opzichte van de kleine opgeroepen depolarisatie opgenomen in dezelfde cel (Figuur 2D). Dit komt door delage membraan weerstand van astrocyten. Opname van het synaptisch opgewekte astrogliale membraanpotentiaal dynamiek, zoals geïllustreerd in figuur 2D, is een directe maat van de lokale extracellulaire kalium 8. Normalisering van de opgeroepen astrogliale antwoorden op de onderliggende neuronale activiteit laat een directe vergelijking van verschillende experimenten, zoals onlangs aangetoond 6. Astrogliale stromen kunnen bovendien zeer betrouwbaar bewaken veranderingen in excitatoire transmissie de totale synaptisch opgewekte stroom volgt lineair astrogliale de toename van het fEPSP (figuur 2E). Astrogliale stromen weerspiegelen ook de korte termijn synaptische plasticiteit, omdat ze laten zien, zoals neuronen, gepaarde-pulse facilitatie (figuur 2F). Gepaarde whole-cell opname van een CA1 pyramidale cel en een astrocyt blijkt zeer verschillend gedrag elektrofysiologische in beide celtypes, aangezien de weergave neuron actiepotentialen in antwoord op een depolariserende puls,terwijl de naburige astrocyten zwijgt (figuur 3A-B). Echter, gematigde stimulatie van de Schaffer collateralen tegelijk oproepen snel exciterend posynaptic potentieel in het CA1 pyramidale cel en een snelle en langzame buiten naar binnen stromen in de aangrenzende astrocyten (Figuur 3B 2). Dual opnamen van synaptisch-geïnduceerde neuronale en astrogliale reacties kunnen ook worden opgenomen in de CA3 gebied van de hippocampus, zie figuur 3C. Inderdaad, enkel stimulatie van CA3 bemoste vezels oproept in basale omstandigheden zeer kleine neuronale responsen, opgenomen als lokale fEPSPs, geassocieerd met kleine snelle heen-en langzaam naar binnen stromen in astrocyten (Figuur 3D 1). Daarentegen 1 Hz stimulatie van CA3 mosvezels enkele seconden versterkt sterk de fEPSP, terwijl het slechts matig verhoogt de astrogliale respons (Figuur 3D 2). Figuur 1. Hippocampus isolement te transversale plakjes bereiden. Naar de hersenen ontleden, snijd de schedel langs de middellijn (a). Een coronale snede ter hoogte van de bulbus olfactorius (b) en vervolgens op het niveau van het cerebellum (c). Voorzichtig de schedel te verwijderen met behulp van een pincet (d), scheidt de twee hersenhelften met een mes (e), en breng ze op een kleine lepel in koud zuurstofrijk ACSF (f). Na 5 min equilibratie ~ Plaats een hemisfeer op droog weefsel de mediale oppervlak tot (g). Met de hulp van twee lepels verwijder het diencephalon (hj). De hippocampus is nu zichtbaar, zoals geïllustreerd door de onderbroken lijnen (k). Ontleden de hippocampus met een lepel uit vanaf de fimbria, zichtbaar als witte structuur (lm). Terug Breng de hippocampus in de koude ACSF. Bereid een kleine agarose-blok, plaats de twee hippocampus met de alveus naar boven en de ventrale hippocampons naar de rand van de agar blok en genieten zorgvuldig alle vloeistof weg een goede hechting laat de agar (n). Lijm de hippocampus aan de agar blok op het ventrale deel (o). <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg"/> Figuur 2. Gelijktijdige neuronale en astrogliale-synaptisch opgeroepen reacties in het CA1 gebied van de hippocampus. A) Schema van de hippocampus slice illustreert de opstelling van de stimulerende elektrode, de Schaffer collateralen (SC), de patch pipet elektrode activeren astrocytische stromen opnemen en de extracellulaire elektrode aan fEPSP opnemen, opgewekt door stimulatie SC in de hippocampus CA1 gebied. B) Vertegenwoordiger sporen van gelijktijdige opnamen van fEPSPs (bovenste paneel) en astrocytische stromen (onderste paneel) opgewekt door SC-synaptisch stimulatie in de presencinge van farmacologische drugs. De reacties worden eerst opgeslagen in de aanwezigheid van een GABA-receptor blocker (picrotoxin, 100 uM, zwarte sporen) exciterend reacties isoleren. Latere toepassing van ionotrope glutamaatreceptor blocker (kynurenic zuur, 5 mM, donkergrijs sporen), remt de fEPSP en het grootste deel van de langdurige astrogliale stroom ontmaskeren kleine en snel veranderende component van de huidige astrocytaire antwoord, dat gevoelig voor een glutamaat transporter blocker (TBOA, 200 uM, lichtgrijs sporen). Scale bar, fEPSP 0,1 mV, astrocytaire huidige 15 pA, 10 msec. C 1). Voorbeeld spoor van astrogliale kaliumstroom (1-2), die de opgewekte reactie, getoond in B (onderste paneel, black trace), worden geïsoleerd door het aftrekken van de gelijkstroomcomponent resterende kynurenic zuur (2) van de totale stroom ( 1). Scale bar, 20 pA, 1 sec. C 2) Sample spoor van de glutamaat transporter stroom (2-3), verkregen door aftrekken van de TBOA insensitive langzame component (3) van de huidige in kynurenic zuur (2). Scale bar, 2,5 pA, 25 msec. D) Voorbeeld sporen van een binnenwaartse stroom opgeslagen in voltage-clamp (onderste paneel) en de overeenkomstige membraandepolarisatie in de lopende-klem (bovenste paneel) geïnduceerd door astrocyten in een SC stimulatie. Scale bar, de huidige-clamp 1,5 mV, voltage-clamp 5 Pa, 1 sec. E) Input-output curven illustreren de verhouding tussen de presynaptische vezel salvo (input) en de totale stroom astrogliale (output) opgenomen gelijktijdig in reactie op stimulatie SC (n = 6). Het astrogliale huidige lineair toeneemt met de toenemende vezel volleys, de neuronale fEPSP. F) Sample sporen van de neuronale respons (fEPSP) en de huidige astrocytische getoond voor gepaarde puls stimulatie met 40 msec interpuls interval. De synaptisch-opgeroepen astrogliale huidige tentoonstellingen, zoals neuronen, gepaarde-pulse faciliteren. Scale bar, 0,1 mV, 5 pA, 20 msec. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg"/> Figuur 3. Dual opnamen van synaptisch geïnduceerde neuronale en astrogliale reacties in het CA1 en CA3 gebieden van de hippocampus. A) reconstructie van een CA1 pyramidale cel geïnjecteerd met sulforhodamine-B (rood, 0,1%) en een astrocyt gevuld met fluoresceïne dextran (groen, 0,1%) met de gehele cel patch-clamp techniek. Schaal bar, 10 urn. B 1) Representative sporen van gelijktijdige gehele-cel opname van membraanpotentialen in de lopende-klem van een CA1 pyramidale cel en een aangrenzende astrocyte. Neuronale actiepotentiaal verbranding (zwart trace), opgeroepen door injectie van een 20 pA depolariserende stroompuls geen reactie oproept in de aangrenzende astrocyten (grijze trace). Scale bar, 20 mV, 10 pA, 100 msec. B 2) Sample sporen van dual whole-cell opnames van een CA1 pyramidale cel in de huidige-clamp en een aangrenzend astrocyt in voltage-clamp na SC stimulatie in aanwezigheid van picrotoxin (100 uM). SC stimulatie roept een prikkelende postsynaptische potentiaal (EPSP, zwart spoor), geassocieerd met een kleine en langdurige astrocytaire stroom (grijze spoor). Scale bar, 5 mV, 10 pA, 100 msec. C) Regeling van de hippocampus slice is die in de dentate gyrus (DG) en CA3 gebieden de opstelling van de stimulerende elektrode, de mosvezels de patch pipet elektrode (grijs) om astrocytische stromen opnemen en het extracellulaire elektrode activeren opnemen fEPSP, opgeroepen door CA3 bemoste vezels stimulatie. D, E) Representative sporen van gepaarde opnamen van CA3 fEPSPs (bovenste panelen, zwarte sporen in D1 en D2) en astrocytische hele-cel responsen (onderste panelen, grijs sporen in D 1 en D 2) op enkele stimulatie van CA3 mossy vezels van 0,02 Hz (zoom in de inzet) (D 1) of 1 Hz stimulatiefrequentie (D 2). Scale bar voor D <sub&gt; 1 en D2, 0,2 mV, 15 pA, tijd: D 1 1 sec; D 2 100 msec. Inzet schaalbalk, 0,1 mV, 100 msec.

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen in<em&gt; Stratum radiatum</em&gt; Tijdens de stimulatie van Schaffer collateralen wordt beschreven. De farmacologische isolatie van astrogliale kalium en glutamaat transporter stromingen wordt aangetoond.

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocyten vormen samen met neuronen tripartite synapsen, waarin zij neuronale activiteit integreren en moduleren. Astrocyten nemen inderdaad neuronale input waar ...

Klassiek gezien omvat de communicatie tussen de pre- en postsynaptische elementen een actiepotentiaal die het presynaptische uiteinde bereikt, wat door een toename van calcium de afgifte van glutamaat triggert, waardoor postsynaptische receptoren worden geactiveerd. De observatie dat astrocyten synapsen nauw contacteren en neurotransmitterreceptoren tot expressie brengen, heeft dit beeld echter veranderd in het concept van de tripartite synaps. Lopende glutamaterge transmissie zal daarom ook de astrocyt activeren en een stijging van het intracellulaire calcium triggeren.De afgifte van gliotransmitters, die vervolgens kunnen binden aan extrasynaptische of synaptische receptoren, moduleert pre- en postsynaptische activiteiten. Bovendien drukken astrocyten het belangrijkste opnamesysteem uit voor synaptisch vrijgekomen glutamaat. Daarnaast ruimen ze kalium op, dat vrijkomt tijdens het vuren van actiepotentialen en de daaropvolgende postsynaptische activatie vanuit de pre- en postsynaptische uiteinden via hun kaliumkanalen.Dit kalium wordt vervolgens intracellulair getransporteerd naar plaatsen met lagere extracellulaire kaliumgehaltes, waar het wordt vrijgegeven of via gap junctions diffundeert naar aangrenzende astrocyten. Zo spelen astrocyten, door zowel het reguleren van de extracellulaire concentratie van neuroactieve stoffen als door het vrijgeven van clear transmitters, een belangrijke rol bij het bepalen van de sterkte van de synaptische activiteit. Mijn laboratorium onderzoekt de rol van neurogliale interacties bij cerebrale fysiopathologie.Wij hebben deze techniek uitgebreid gebruikt en geperfectioneerd om de rol van astrocyten in de synaptische transmissie van moment op moment te ontrafelen. Deze techniek is bijzonder krachtig omdat het mogelijk maakt om de dynamische elektrofysiologische responsen van neuronen online en simultaan te monitoren. Vandaag zullen Ash en Jeremy Siebel, leden van het laboratorium, demonstreren hoe deze techniek wordt uitgevoerd en uitleggen hoe het ons helpt de intieme dialoog tussen neuronen en astrocyten te begrijpen.Ik heb het effect van astrogliale netwerken op neuronen, synaptische transmissie en plasticiteit onderzocht door middel van dubbele registraties van neuronale activiteit en de aanwezigheid van astrogliaal kalium- en glutamaattransport; hierbij heb ik vastgesteld dat astrogliaal netwerken de extracellulaire verwijdering van kalium en glutamaat tijdens neurale activiteit vergemakkelijken. Ik heb de intrinsieke eigenschappen en plasticiteit van astrogliaal optreden in relatie tot de neurofysiologie onderzocht. Tijdens de registratie van astrogliale en neuronale geëvoceerde activiteit heb ik kunnen vaststellen dat de respons van astrocyten op neuronale activatie hoofdzakelijk plaatsvindt via kaliumstromen.Deze stroom heeft zijn eigen elektrofysiologische plasticiteit, die de neurale acceptabiliteit en plasticiteit niet reguleert. Met andere woorden, de astrocyten zijn zeer geëxciteerd. We presenteren hier een belangrijke methode om gelijktijdig de neurale en astrogliale activiteit in acute hippocampusschijfjes te onderzoeken door middel van dubbele registraties van astrocytaire membraanstromen en neurale veldpotentialen opgewekt door presynaptische vezelstimulatie.Verder zullen we gepaarde opnames maken van individuele neuronen en aangrenzende astrocyten om ASTO gly-responsen tijdens neuronale activiteit te onderzoeken. We hebben gekozen voor de hippocampus omdat deze regio een sterke anatomische en functionele compartimentalisatie vertoont en goed gekarakteriseerd is wat betreft neurocircuitry, alsofwel synaptische activiteit en plasticiteit. Start de experimenten door hippocampale hersensnijden voor te bereiden; bereid hiervoor eerst met zuurstof verzadigde, ijskoude vloeistof voor.Kunstmatig cerebrospinaal vocht: anesthetiseer uw muizen diep, decapiteer ze snel en plaats ze in A CSF. Open de schedel met drie incisies om de twee hemisferen te scheiden. Plaats ze vervolgens in gezuurstofte A CSF.Laat het ongeveer vijf minuten gelijkmatig inwijken. Begin nu met één hemisfeer. De dissectie van de hippocampus begint met het verwijderen van de middenhersenen.De gedetailleerde dissectie van de hippocampus wordt nu in deze figuur geïllustreerd. Plaats eerst de gescheiden hemisfeer op de corticale zijde om toegang te krijgen tot de middenhersenen. Verwijder de middenhersenen met behulp van twee lepels.Nu is de hippocampus zichtbaar, zoals aangegeven door de stippellijnen. Disseceer de hippocampus eruit met een lepel, beginnend bij de fimbria, die zichtbaar is als een brede structuur. Plaats een lepel onder de hippocampus en snijd, met behulp van een tweede lepel, de cortex naast de hippocampus weg.Breng de hippocampus over naar een kleine kweekschaal met geoxygeneerde A CSF en ga verder met het tweede hemisfeer. Plaats beide hippo op een klein AGA-blok met de alveo-zijde naar boven. Zuig nu de DS A CSF weg. Plak de hippo vast op het apparaat van de snijkamer.Breng de hippocampus over naar de snijkamer en snijd plakjes van 300 of 400 micrometer. Verzamel de plakjes in een zuurstofrijke bewaarkamer en laat ze vóór de opname ten minste één uur rusten bij kamertemperatuur om volledige opnames van enkele astrocyten uit te voeren. Plaats uw hippocampusplakje op een met polylysine gecoat dekglas.Droog het overtollige A CSF af om de hechting van de hippocampus-slice aan het poly-gecoate dekglasplaatje mogelijk te maken en voeg vervolgens opnieuw A CSF toe bovenop de slice. Verplaats de slice naar uw registratiekamer, die constant wordt geperfuseerd met gezuurslof A CSF bij een perfusiesnelheid van één tot twee milliliter per minuut. Om astrocyten te identificeren, kunnen muizen die EGFP tot expressie brengen onder de astroglia-specifieke GFAP-promotor worden gebruikt voor patchclamp-registraties.Vul een glazen pipet met een weerstand van vier tot zes mega ohm met gefiltreerde koude intracellulaire oplossing; door gebruik te maken van een intracellulaire oplossing die roddan bevat, kunt u de gepatchte astrocyt in het rood en in het groen visualiseren. U ziet de naburige astrocyten die EGFP tot expressie brengen. Onder de GFAP-promotor kunnen astrocyten worden geïdentificeerd aan hun kleine soma-grootte van ongeveer 10 micrometer en de vertakking van hun hoofduitvloeisel, dat gewoonlijk drie tot vier takken bevat.Een spuit die via een slang aan de pipet is verbonden, maakt het mogelijk om positieve druk toe te passen terwijl men in het weefsel afdaalt; activeer in het opdrachtvenster een testpuls van 10 millivolt en nulstel de holdstroom. Beweeg vervolgens de pipet met behulp van de micromanipulator in het weefsel om de cel te naderen. Wanneer het celoppervlak is bereikt, bewegen we verder totdat er een kuiltje zichtbaar is als een lichtafbuiging, wat aangeeft dat we het celoppervlak enigszins vervormen.Door de toepassing van positieve druk zal het astrocytaire celmembraan nu stevig afsluiten op de opening van de glazen pipettepunt, wat kan worden waargenomen door een toenemende weerstand zodra er een gigaseal is bereikt. Voer capaciteitscompensatie uit in de configuratie door voorzichtig negatieve druk toe te passen terwijl de testpatronen in het opdrachtvenster worden geobserveerd. Het doorbreken van de cel zal zichtbaar zijn door de stroom die door het membraan vloeit.Toepassing van een reeks hyperpolariserende en depolariserende voltagesprongen maakt het mogelijk de eigenschappen van het celmembraan te karakteriseren; astrocyten vertonen normaal gesproken alleen passieve stroomresponsen. Stroominjectie in Current clamp-modus resulteert niet in een actiepotentiaal. Het uitblijven van vuren is een verdere bevestiging dat er inderdaad een astrocyt is gepatcht. Toevoeging van een tracer, zoals sulforhodamine B, aan de patchpipet maakt de visualisatie van de gepatchte astrocyt mogelijk.Bovendien maakt passieve diffusie van de tracer gedurende 20 minuten in de current clamp-modus het mogelijk om de via gap junctions verbonden naburige astrocyten te visualiseren om dubbele opnames te maken van neuronale excitatoire transmissie en de daaropvolgend opgewekte astrocytAire stromen. We blokkeren eerst de inhibitoire transmissie met precor toin om hyperexcitabiliteit te voorkomen, die optreedt bij afwezigheid van GABAerge transmissie. We snijden de via shaer collaterals gemedieerde verbindingen tussen CS drie en C één door met een klein irismes.Vervolgens positioneren we een A CSF veldstimulatie-elektrode, een veldregistratie-elektrode en de astrocytaire patch clamp-elektrode. In de hippocampus-slice kiezen we een astrocyte en positioneren we de veldelektrode 200 micrometer daarvandaan om te garanderen dat de astrocyte inderdaad de activiteit integreert die wordt geregistreerd met de veldelektrode; stimulatie van de collateralen van Schaffer zal een exciterend veldpotentieel opwekken. Dit veldpotentieel bestaat uit de vezelwand, die het aantal gestimuleerde axonen weerspiegelt, en de daaropvolgende postsynaptische depolarisatie, om dubbele registraties uit te voeren van neuronale veldpotentialen en whole-cell stroomresponsen van astroglia.Positioneer eerst uw veldregistratie-elektrode op ongeveer 50 micrometer afstand van de gekozen astrocyten. Verplaats vervolgens uw patch-elektrode naar het soma van de astrocyten en voer een patchclamp uit; bevestig aan de hand van de passieve membraaneigenschappen dat de gekozen cel inderdaad een astrocyten is. Door nu de Shaer Cs te stimuleren, kunnen we gelijktijdig neurale activiteit en een daaropvolgende astrocytische stroom registreren, welke bestaat uit een langdurige respons tot 50 pic oum vanwege hun netwerkconnectiviteit en het feit dat één astrocyten contact maakt met synapsen van tot wel 100 neuronen.Deze cellen integreren de activiteit van een groot aantal gelijktijdig geactiveerde synapsen om dubbele whole-cell opnames uit te voeren van individuele neuronen en aangrenzende astrocyten; daal met twee patchelektroden af naar het stratum area van de hippocampus-snede. Identificeer in de C-regio een neuron van belang en, op dezelfde diepte op ongeveer 20 tot 60 µm afstand, een astrocyt. Positioneer vervolgens beide pipetten ongeveer 10 µm boven elke cel terwijl er positieve druk wordt uitgeoefend. De opnamepipet voor de astrocyt moet zo dicht mogelijk bij de doelastrocyt worden geplaatst om verdere mechanische bewegingen te voorkomen.Bereik eerst de gga-afdichting op het neuron. Ga nu verder met het patchen van de astrocyt, die gewoonlijk langzamer afdicht dan neuronen. Om de belangrijke stappen voor het uitvoeren van dubbele wholesale-metingen samen te vatten: laat eerst de twee opnamepipetten in de slice zakken.Benader het soma van de astrocyten, voer vervolgens de gga-afdichting uit op het neuron en voltooi dit door de gga-afdichting op de astrocyte uit te voeren; neuronen hebben gewoonlijk een veel hogere membraanweerstand dan astrocyten, wat voor piramidale neuronen rond de 200 tot 500 mega ligt bij beide cellen. Nu in voltage-clamp modus T en hyperpolariserend, activeert het membraan voorbijgaande natriumstromen in het neuron en passieve kaliumresponsen in de astrocyte. We tonen hier aan dat de inductie van snelle excitatoire postsynaptische veldpotentialen door stimulatie van shaa-collateralen een daaropvolgende langdurige stroomrespons opwekt.In de aangrenzende astrocyten onthult inhibitie van ionotrope glutamaatreceptoren met remiczuur dat het grootste deel van de astrogly-stroom te wijten is aan excitatoire postsynaptische activatie. De resterende B AIC-respons bestaat uit het snelle transiënte glutamaattransport dat gevoelig is voor TBOA en de kleine, langdurige stroom, die zeer waarschijnlijk het gevolg is van de presynaptische kaliumvrijgave tijdens actiepotentiaalvuring; deze astrocytaire stroom monitort zeer betrouwbaar de postsynaptische activiteit, aangezien beide lineair toenamen bij een toename van de presynaptische activiteit.Bovendien vertonen astrocytaire stromen, net als neuronale responsen, gepaarde pulsfacilitatie. Een matige enkelvoudige stimulatie van de schaffer-collateralen induceert een relatief grote synaptisch opgewekte astroglyiale stroom in vergelijking met de kleine opgewekte depolarisatie die in dezelfde cel in current-clampmodus wordt geregistreerd. Dit is te wijten aan de lage membraanweerstand van astrocyten.De registratie van de synaptisch opgewekte TTO gly membraanpotentiaal-dynamiek is een directe maat voor de lokale extracellulaire kaliumconcentraties. Door gepaarde registraties uit te voeren van een neuron en een aangrenzende astrocyten, observeerden we geen astrocytaire stroomrespons terwijl het neuron actiepotentialen vuurde, wat aangeeft dat ze niet elektrisch gekoppeld waren. Excitatoire postsynaptische potentialen opgewekt in de CS drie-regio wekken echter wel astrocytaire stroomresponsen op. Bovendien potentieerde stimulatie van zone een de neuronale respons in de CS drie-regio sterk, terwijl de astrocytaire stroom slechts matig toenam.Na het bekijken van deze video zouden we een beter inzicht moeten hebben in hoe we succesvolle dubbele elektrofysiologische opnames van neuronen en astrocyten kunnen opzetten en uitvoeren. Met deze techniek kunt u de dynamische signalering in real-time tussen neuronen en astrocyten bestuderen voor de elektrofysiologische respons waarin u geïnteresseerd bent. In het bijzonder kunt u onderzoeken of nieuwe interacties tussen glia en neuronen, waarbij ionkanaalfuncties en -modulaties betrokken zijn, bijdragen aan het definiëren van fysiologische of pathologische situaties.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

dual-electrophysiological-recordings-synaptically-evoked-astroglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the procedure for setting up a brain slice in a submersion chamber to record synaptic activity. The process involves securing the slice on lens paper, maintaining a continuous flow of artificial cerebrospinal fluid (aCSF) to ensure neuronal viability, and accurately positioning the stimulation and recording electrodes relative to a specific brain region of interest. This setup allows for precise monitoring of baseline synaptic activity and the effects of electrical...

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices

This video demonstrates a method to record CA3-CA1 synaptic responses in a rat hippocampal slice. It outlines the steps involved in placing the stimulating and recording electrodes on the hippocampal slice and measuring the field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) to assess synaptic response strength.

Recording CA3-CA1 Synaptic Responses in a Rat Hippocampal Slice

We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Paaropnamen zijn gelijktijdige gehele cel patch clamp opnamen van twee synaptisch verbonden neuronen, waardoor een nauwkeurige elektrofysiologische en farmacologische karakterisering van de synapsen tussen individuele neuronen mogelijk wordt. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie en vereisten voor het vestigen van deze techniek in organotypische hippocampale plakculturen in elk laboratorium dat is uitgerust voor elektrofysiologie.

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

Dit protocol beschrijft de stabilisatie van het zuurstofgehalte in een klein volume van gerecycled buffer en methodologische aspecten van de opname van de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit in verzonken acute hippocampal plakjes.

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

We gebruikten opname-en stimulatie elektroden in longitudinale hippocampal hersen schijfjes en longitudinaal geplaatste opname-en stimulatie elektroden in de rugzijde Hippocampus in vivo om extracellulaire postsynaptische potentialen aan te roepen en te demonstreren op lange termijn synaptische plasticiteit langs de longitudinale interlamellar CA1.

Onderzoek op lange termijn synaptische plasticiteit in Interlamellar Hippocampus CA1 door elektrofysiologische veld opname

Het gepresenteerde protocol beschrijft het transport en de voorbereiding van resected menselijk hippocampal weefsel met het uiteindelijke doel om vitale hersenenplakjes te gebruiken als een preklinische evaluatie tool voor potentiële anti-epileptica.

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

Leer hoe u dubbele elektrofysiologische opnames van neuronen en astrocyten uitvoert in acute hippocampus-snedes. Deze methode onthult de dynamische neurogliale interacties tijdens synaptische transmissie.

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Meer video's verkennen