Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Klassiek gezien omvat de communicatie tussen de pre- en postsynaptische elementen een actiepotentiaal die het presynaptische uiteinde bereikt, wat door een toename van calcium de afgifte van glutamaat triggert, waardoor postsynaptische receptoren worden geactiveerd. De observatie dat astrocyten synapsen nauw contacteren en neurotransmitterreceptoren tot expressie brengen, heeft dit beeld echter veranderd in het concept van de tripartite synaps. Lopende glutamaterge transmissie zal daarom ook de astrocyt activeren en een stijging van het intracellulaire calcium triggeren.

De afgifte van gliotransmitters, die vervolgens kunnen binden aan extrasynaptische of synaptische receptoren, moduleert pre- en postsynaptische activiteiten. Bovendien drukken astrocyten het belangrijkste opnamesysteem uit voor synaptisch vrijgekomen glutamaat. Daarnaast ruimen ze kalium op, dat vrijkomt tijdens het vuren van actiepotentialen en de daaropvolgende postsynaptische activatie vanuit de pre- en postsynaptische uiteinden via hun kaliumkanalen.

Dit kalium wordt vervolgens intracellulair getransporteerd naar plaatsen met lagere extracellulaire kaliumgehaltes, waar het wordt vrijgegeven of via gap junctions diffundeert naar aangrenzende astrocyten. Zo spelen astrocyten, door zowel het reguleren van de extracellulaire concentratie van neuroactieve stoffen als door het vrijgeven van clear transmitters, een belangrijke rol bij het bepalen van de sterkte van de synaptische activiteit. Mijn laboratorium onderzoekt de rol van neurogliale interacties bij cerebrale fysiopathologie.

Wij hebben deze techniek uitgebreid gebruikt en geperfectioneerd om de rol van astrocyten in de synaptische transmissie van moment op moment te ontrafelen. Deze techniek is bijzonder krachtig omdat het mogelijk maakt om de dynamische elektrofysiologische responsen van neuronen online en simultaan te monitoren. Vandaag zullen Ash en Jeremy Siebel, leden van het laboratorium, demonstreren hoe deze techniek wordt uitgevoerd en uitleggen hoe het ons helpt de intieme dialoog tussen neuronen en astrocyten te begrijpen.

Ik heb het effect van astrogliale netwerken op neuronen, synaptische transmissie en plasticiteit onderzocht door middel van dubbele registraties van neuronale activiteit en de aanwezigheid van astrogliaal kalium- en glutamaattransport; hierbij heb ik vastgesteld dat astrogliaal netwerken de extracellulaire verwijdering van kalium en glutamaat tijdens neurale activiteit vergemakkelijken. Ik heb de intrinsieke eigenschappen en plasticiteit van astrogliaal optreden in relatie tot de neurofysiologie onderzocht. Tijdens de registratie van astrogliale en neuronale geëvoceerde activiteit heb ik kunnen vaststellen dat de respons van astrocyten op neuronale activatie hoofdzakelijk plaatsvindt via kaliumstromen.

Deze stroom heeft zijn eigen elektrofysiologische plasticiteit, die de neurale acceptabiliteit en plasticiteit niet reguleert. Met andere woorden, de astrocyten zijn zeer geëxciteerd. We presenteren hier een belangrijke methode om gelijktijdig de neurale en astrogliale activiteit in acute hippocampusschijfjes te onderzoeken door middel van dubbele registraties van astrocytaire membraanstromen en neurale veldpotentialen opgewekt door presynaptische vezelstimulatie.

Verder zullen we gepaarde opnames maken van individuele neuronen en aangrenzende astrocyten om ASTO gly-responsen tijdens neuronale activiteit te onderzoeken. We hebben gekozen voor de hippocampus omdat deze regio een sterke anatomische en functionele compartimentalisatie vertoont en goed gekarakteriseerd is wat betreft neurocircuitry, alsofwel synaptische activiteit en plasticiteit. Start de experimenten door hippocampale hersensnijden voor te bereiden; bereid hiervoor eerst met zuurstof verzadigde, ijskoude vloeistof voor.

Kunstmatig cerebrospinaal vocht: anesthetiseer uw muizen diep, decapiteer ze snel en plaats ze in A CSF. Open de schedel met drie incisies om de twee hemisferen te scheiden. Plaats ze vervolgens in gezuurstofte A CSF.

Laat het ongeveer vijf minuten gelijkmatig inwijken. Begin nu met één hemisfeer. De dissectie van de hippocampus begint met het verwijderen van de middenhersenen.

De gedetailleerde dissectie van de hippocampus wordt nu in deze figuur geïllustreerd. Plaats eerst de gescheiden hemisfeer op de corticale zijde om toegang te krijgen tot de middenhersenen. Verwijder de middenhersenen met behulp van twee lepels.

Nu is de hippocampus zichtbaar, zoals aangegeven door de stippellijnen. Disseceer de hippocampus eruit met een lepel, beginnend bij de fimbria, die zichtbaar is als een brede structuur. Plaats een lepel onder de hippocampus en snijd, met behulp van een tweede lepel, de cortex naast de hippocampus weg.

Breng de hippocampus over naar een kleine kweekschaal met geoxygeneerde A CSF en ga verder met het tweede hemisfeer. Plaats beide hippo op een klein AGA-blok met de alveo-zijde naar boven. Zuig nu de DS A CSF weg. Plak de hippo vast op het apparaat van de snijkamer.

Breng de hippocampus over naar de snijkamer en snijd plakjes van 300 of 400 micrometer. Verzamel de plakjes in een zuurstofrijke bewaarkamer en laat ze vóór de opname ten minste één uur rusten bij kamertemperatuur om volledige opnames van enkele astrocyten uit te voeren. Plaats uw hippocampusplakje op een met polylysine gecoat dekglas.

Droog het overtollige A CSF af om de hechting van de hippocampus-slice aan het poly-gecoate dekglasplaatje mogelijk te maken en voeg vervolgens opnieuw A CSF toe bovenop de slice. Verplaats de slice naar uw registratiekamer, die constant wordt geperfuseerd met gezuurslof A CSF bij een perfusiesnelheid van één tot twee milliliter per minuut. Om astrocyten te identificeren, kunnen muizen die EGFP tot expressie brengen onder de astroglia-specifieke GFAP-promotor worden gebruikt voor patchclamp-registraties.

Vul een glazen pipet met een weerstand van vier tot zes mega ohm met gefiltreerde koude intracellulaire oplossing; door gebruik te maken van een intracellulaire oplossing die roddan bevat, kunt u de gepatchte astrocyt in het rood en in het groen visualiseren. U ziet de naburige astrocyten die EGFP tot expressie brengen. Onder de GFAP-promotor kunnen astrocyten worden geïdentificeerd aan hun kleine soma-grootte van ongeveer 10 micrometer en de vertakking van hun hoofduitvloeisel, dat gewoonlijk drie tot vier takken bevat.

Een spuit die via een slang aan de pipet is verbonden, maakt het mogelijk om positieve druk toe te passen terwijl men in het weefsel afdaalt; activeer in het opdrachtvenster een testpuls van 10 millivolt en nulstel de holdstroom. Beweeg vervolgens de pipet met behulp van de micromanipulator in het weefsel om de cel te naderen. Wanneer het celoppervlak is bereikt, bewegen we verder totdat er een kuiltje zichtbaar is als een lichtafbuiging, wat aangeeft dat we het celoppervlak enigszins vervormen.

Door de toepassing van positieve druk zal het astrocytaire celmembraan nu stevig afsluiten op de opening van de glazen pipettepunt, wat kan worden waargenomen door een toenemende weerstand zodra er een gigaseal is bereikt. Voer capaciteitscompensatie uit in de configuratie door voorzichtig negatieve druk toe te passen terwijl de testpatronen in het opdrachtvenster worden geobserveerd. Het doorbreken van de cel zal zichtbaar zijn door de stroom die door het membraan vloeit.

Toepassing van een reeks hyperpolariserende en depolariserende voltagesprongen maakt het mogelijk de eigenschappen van het celmembraan te karakteriseren; astrocyten vertonen normaal gesproken alleen passieve stroomresponsen. Stroominjectie in Current clamp-modus resulteert niet in een actiepotentiaal. Het uitblijven van vuren is een verdere bevestiging dat er inderdaad een astrocyt is gepatcht. Toevoeging van een tracer, zoals sulforhodamine B, aan de patchpipet maakt de visualisatie van de gepatchte astrocyt mogelijk.

Bovendien maakt passieve diffusie van de tracer gedurende 20 minuten in de current clamp-modus het mogelijk om de via gap junctions verbonden naburige astrocyten te visualiseren om dubbele opnames te maken van neuronale excitatoire transmissie en de daaropvolgend opgewekte astrocytAire stromen. We blokkeren eerst de inhibitoire transmissie met precor toin om hyperexcitabiliteit te voorkomen, die optreedt bij afwezigheid van GABAerge transmissie. We snijden de via shaer collaterals gemedieerde verbindingen tussen CS drie en C één door met een klein irismes.

Vervolgens positioneren we een A CSF veldstimulatie-elektrode, een veldregistratie-elektrode en de astrocytaire patch clamp-elektrode. In de hippocampus-slice kiezen we een astrocyte en positioneren we de veldelektrode 200 micrometer daarvandaan om te garanderen dat de astrocyte inderdaad de activiteit integreert die wordt geregistreerd met de veldelektrode; stimulatie van de collateralen van Schaffer zal een exciterend veldpotentieel opwekken. Dit veldpotentieel bestaat uit de vezelwand, die het aantal gestimuleerde axonen weerspiegelt, en de daaropvolgende postsynaptische depolarisatie, om dubbele registraties uit te voeren van neuronale veldpotentialen en whole-cell stroomresponsen van astroglia.

Positioneer eerst uw veldregistratie-elektrode op ongeveer 50 micrometer afstand van de gekozen astrocyten. Verplaats vervolgens uw patch-elektrode naar het soma van de astrocyten en voer een patchclamp uit; bevestig aan de hand van de passieve membraaneigenschappen dat de gekozen cel inderdaad een astrocyten is. Door nu de Shaer Cs te stimuleren, kunnen we gelijktijdig neurale activiteit en een daaropvolgende astrocytische stroom registreren, welke bestaat uit een langdurige respons tot 50 pic oum vanwege hun netwerkconnectiviteit en het feit dat één astrocyten contact maakt met synapsen van tot wel 100 neuronen.

Deze cellen integreren de activiteit van een groot aantal gelijktijdig geactiveerde synapsen om dubbele whole-cell opnames uit te voeren van individuele neuronen en aangrenzende astrocyten; daal met twee patchelektroden af naar het stratum area van de hippocampus-snede. Identificeer in de C-regio een neuron van belang en, op dezelfde diepte op ongeveer 20 tot 60 µm afstand, een astrocyt. Positioneer vervolgens beide pipetten ongeveer 10 µm boven elke cel terwijl er positieve druk wordt uitgeoefend. De opnamepipet voor de astrocyt moet zo dicht mogelijk bij de doelastrocyt worden geplaatst om verdere mechanische bewegingen te voorkomen.

Bereik eerst de gga-afdichting op het neuron. Ga nu verder met het patchen van de astrocyt, die gewoonlijk langzamer afdicht dan neuronen. Om de belangrijke stappen voor het uitvoeren van dubbele wholesale-metingen samen te vatten: laat eerst de twee opnamepipetten in de slice zakken.

Benader het soma van de astrocyten, voer vervolgens de gga-afdichting uit op het neuron en voltooi dit door de gga-afdichting op de astrocyte uit te voeren; neuronen hebben gewoonlijk een veel hogere membraanweerstand dan astrocyten, wat voor piramidale neuronen rond de 200 tot 500 mega ligt bij beide cellen. Nu in voltage-clamp modus T en hyperpolariserend, activeert het membraan voorbijgaande natriumstromen in het neuron en passieve kaliumresponsen in de astrocyte. We tonen hier aan dat de inductie van snelle excitatoire postsynaptische veldpotentialen door stimulatie van shaa-collateralen een daaropvolgende langdurige stroomrespons opwekt.

In de aangrenzende astrocyten onthult inhibitie van ionotrope glutamaatreceptoren met remiczuur dat het grootste deel van de astrogly-stroom te wijten is aan excitatoire postsynaptische activatie. De resterende B AIC-respons bestaat uit het snelle transiënte glutamaattransport dat gevoelig is voor TBOA en de kleine, langdurige stroom, die zeer waarschijnlijk het gevolg is van de presynaptische kaliumvrijgave tijdens actiepotentiaalvuring; deze astrocytaire stroom monitort zeer betrouwbaar de postsynaptische activiteit, aangezien beide lineair toenamen bij een toename van de presynaptische activiteit.

Bovendien vertonen astrocytaire stromen, net als neuronale responsen, gepaarde pulsfacilitatie. Een matige enkelvoudige stimulatie van de schaffer-collateralen induceert een relatief grote synaptisch opgewekte astroglyiale stroom in vergelijking met de kleine opgewekte depolarisatie die in dezelfde cel in current-clampmodus wordt geregistreerd. Dit is te wijten aan de lage membraanweerstand van astrocyten.

De registratie van de synaptisch opgewekte TTO gly membraanpotentiaal-dynamiek is een directe maat voor de lokale extracellulaire kaliumconcentraties. Door gepaarde registraties uit te voeren van een neuron en een aangrenzende astrocyten, observeerden we geen astrocytaire stroomrespons terwijl het neuron actiepotentialen vuurde, wat aangeeft dat ze niet elektrisch gekoppeld waren. Excitatoire postsynaptische potentialen opgewekt in de CS drie-regio wekken echter wel astrocytaire stroomresponsen op. Bovendien potentieerde stimulatie van zone een de neuronale respons in de CS drie-regio sterk, terwijl de astrocytaire stroom slechts matig toenam.

Na het bekijken van deze video zouden we een beter inzicht moeten hebben in hoe we succesvolle dubbele elektrofysiologische opnames van neuronen en astrocyten kunnen opzetten en uitvoeren. Met deze techniek kunt u de dynamische signalering in real-time tussen neuronen en astrocyten bestuderen voor de elektrofysiologische respons waarin u geïnteresseerd bent. In het bijzonder kunt u onderzoeken of nieuwe interacties tussen glia en neuronen, waarbij ionkanaalfuncties en -modulaties betrokken zijn, bijdragen aan het definiëren van fysiologische of pathologische situaties.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.