Name: Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Leer epitoop-specifieke T-cellen isoleren met peptide:MHC-tetrameren en magnetische microbeads. Deze methode verrijkt zeldzame T-celpopulaties uit muizen voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Andre Han en Lawrence Yen voor technische bijstand, en leden van de Jenkins lab bedanken voor hulp bij de ontwikkeling van dit protocol.

1. Cell Isolatie van lymfeweefsel <ol><li> Voeg 1 ml ijskoud cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamycine, 2 mM L-glutamine, 55 mM 2-mercaptoethanol) of andere gelijkwaardige T-cel medium, een 60 mm kweekplaat die een klein stukje 100 um nylon gaas en plaats op ijs. </li><li> Euthanaseren muis. </li><li> Verwijder de milt en zoveel gemakkelijk toegankelijke lymfeknopen mogelijk. Deze omvatten ten minste de lies, oksel, brachiale, cervicale en mesenterische lymfklieren. Plaats ze bovenop de nylon mesh in de kweekschaal. </li><li> Met behulp van de platte bovenkant van een gesloten 1,5 ml microfugebuisje, het lymfoïde weefsel voorzichtig mash over de nylon mesh om lymfocyten te bevrijden. Voeg een 1 ml cEHAA en pipet op en neer om cellen werken in een suspensie. Breng de cellen door een ander stuk nylon mesh geplaatst over de top van een 15 ml polypropyleen centrifugebuis. Spoel de schaal en gaas met een 1 ml ijskoude cEHAA, pooling de volumes in dezelfde buis. Herhalen om een ​​uiteindelijke celsuspensie volume van 4 ml te bereiken. </li><li> Voeg koud sorter buffer (PBS + 2% FBS, 0,05% azide) tot een eindvolume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C. </li><li> Zuig de supernatant voorzichtig, zodat er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in Fc block (sorter buffer + 2.4G2 antilichaam) tot een volume gelijk aan ongeveer twee keer die van de pellet zelf. Bijvoorbeeld, de milt en lymfeknopen van een naïeve muis produceert gewoonlijk een cel pellet ongeveer 100 pl. In dit geval wordt 100 pl Fc blok om het volume op 200 pl brengen. Als er een grote mate van cel klonteren heeft plaatsgevonden, verwijder voorzichtig de cel klonteren op dit punt met een pipet tip. </li></ol> 2. Tetrameer Staining <ol><li> Voeg PE-of APC-gemerkte pMHC tetrameer tot een eindconcentratie van 10 nM (of empirisch geoptimaliseerd concentratie). </li><li> Mix en incute 1 uur bij kamertemperatuur (of empirisch geoptimaliseerd tijd en temperatuur). </li><li> Voeg koud sorter buffer tot een volume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C. Bewaar monsters op ijs of bij 4 ° C vanaf nu. </li><li> Zuig de supernatant voorzichtig, zodat er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in sorter buffer tot een eindvolume van 200 ul. Voor dubbele tetrameer verrijking, resuspendeer tot een eindvolume van 150 ul. </li></ol> 3. Magnetische Verrijking <ol><li> Voeg 50 ul van Miltenyi anti-PE of anti-APC microbolletjes. Voor dubbele tetrameer verrijking, voeg 50 ul van beide. </li><li> En incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg koud sorter buffer tot een volume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C. </li><li> Tijdens het wachten, het opzetten van een Miltenyi LS magnetische zuil op een MidiMACS of QuadroMACS magneet. Plaats een open 15 ml polypropyleen centrifugebuis eenrack direct onder de kolom. </li><li> 3 ml buffer sorter naar de top van de kolom, waardoor het afwateren in de 15 ml buis. </li><li> Plaats een nylon mesh 100 urn vierkante bovenop de kolom. </li><li> Wanneer cellen klaar spinnen zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml buffer sorter. </li><li> Breng de celsuspensie door de nylon mesh op de top van de kolom. </li><li> Wanneer de celsuspensie geheel is afgevoerd in de kolom, spoel de oorspronkelijke buis met een 3 ml buffer sorteerder en breng het buffer door de nylon mesh in de kolom, spoelen het gaas in het proces. Gooi de nylon mesh. </li><li> Wanneer de buffer volledig is afgevoerd naar de kolom toe nog 3 ml buffer sorter de kolom. </li><li> Herhaal stap 10 voor een totaal van 3 x 3 ml wasbeurten. </li><li> Verwijder de kolom uit de magneet en plaats over een nieuwe 15 ml polypropyleen centrifugebuis. </li><li> Voeg 5 ml sorteerder buffer aan tHij kolom. </li><li> Plaats onmiddellijk de zuiger in de top van de kolom en in een vloeiende beweging, duw de zuiger helemaal naar beneden, waardoor de buffer van de kolom in de buis. </li><li> Centrifugeer de buizen die het geëlueerde gebonden fractie en de doorstroom ongebonden fractie gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C. </li><li> Zuig voorzichtig het supernatans van de gebonden fractie, waarbij er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in sorter buffer tot een eindvolume van 95 pi precies. Zuigen en resuspendeer de ongebonden fractie tot een eindvolume van 2 ml. </li></ol> 4. Flow Cytometry <ol><li> Voor elke fractie, verwijderen 5 pl en aan 200 pl tellen kralen (ingesteld op een concentratie van 200.000 / ml in buffer sorter) in een 5 ml FACS buis. Terzijde bij 4 ° C voor analyse later. Om tijd te besparen, kan kralen vooraf worden verdeeld in fracties om gelabelde buizen voor de start van het experiment. </li><li> Bereid amaster mix van antilichamen tegen oppervlaktemerkers op de cellen (tabel 1) kleuring. Om tijd te besparen, kan deze worden verricht vóór de start van het experiment. </li><li> De gebonden fractie direct voeg een dosis van antilichaam cocktail de ~ 90 pi cellen in de buis. Als een analyse van de ongebonden fractie gewenst breng 90 pl van cellen aan een 5 ml FACS buis en voeg een dosis van antilichaam cocktail. </li><li> Het opzetten van een panel van een kleur vergoeding controles voor de flowcytometer. Voor elke fluorochroom te gebruiken mix 50 pi overgebleven ongebonden fractie cellen in een 5 ml FACS buis met 1 pi anti-CD4 antilichaam geconjugeerd aan de overeenkomstige fluorochroom. Vergeet niet om het opzetten van een ongekleurde controle ook. </li><li> Vortex en incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 5 ml buffer sorter aan elke buis en centrifugeer 5 min bij 300 xg, 4 ° C. </li><li> De gebonden fractie, zorgvuldig aspireren supernatant en resuspendeer de cellen in 200 ul sorter buffer. Breng de cellen in een 1,2 ml FACS microbuisjes. Spoel de buis met een andere 200 ul sorteerder buffer en het zwembad in dezelfde microbuisjes. Als celklonten zijn duidelijk zichtbaar, langs de cellen door een 50 pm filter. </li><li> Voor de ongebonden fractie en compensatie controles, schenk of aspireren het supernatans en resuspendeer in 2 ml sorter buffer. </li><li> Stel de flowcytometer met behulp van de single-kleurcompensatie controles. Selecteer zijwaartse verstrooiing-breedte (SSC-W) als extra parameter op te nemen. </li><li> Analyseer de gekleurde monsters met een reeks opeenvolgende integratie poorten CD4 + identificeren of CD8 + T-cellen zoals weergegeven in figuren 1 en 2. Voor gebonden fracties, verzamel zo veel cellen als mogelijk tot een maximum van 2.000.000 in totaal gebeurtenissen. Voor ongebonden fracties, het verzamelen van 1.000.000 totaal evenementen. Houd de overname tarief op of onder 3.000 gebeurtenissen per seconde. </li><li> Met dezelfde machine-instellingen, het analyseren van de tellen kraal monsters. Verzamel 10.000 in totaal gebeurtenissen. &lt;/ Li&gt; <li> Sla alle gegevens FCS-bestanden. </li></ol> 5. Data-analyse <ol><li> Analyseer FCS gegevensbestanden voor de telling kraal monsters met behulp van FlowJo software. Plot voorwaartse verstrooiing door FITC en zet een hek aroung het tellen kralen (zie figuren 1 en 2). Bepaal het aantal tellen beads in elk monster. Aftrekken van het totale aantal verzamelde gebeurtenissen het aantal verzamelde cel gebeurtenissen. </li><li> Bereken het totale aantal cellen in elk monster met behulp van de vergelijkingen beschreven in box 1. </li><li> Analyseer FCS gegevensbestanden voor de gebrandschilderde gebonden en ongebonden fractie monsters. Stel een reeks opeenvolgende integratie poorten lymfoïde +, side scatter-breedte lo stortplaats-, CD3 +, CD4 + of CD8 +, tetrameer + T-cellen in elk monster zoals weergegeven in figuren 1 en 2. Identificeren </li><li> Vermenigvuldig het totale aantal cellen in het monster door de frequenties van elk van de opname poorten gebruikt om CD4 + definiëren tetrameer+ Of CD8 + cellen tetrameer + het totale aantal epitoop-specifieke T-cellen (Box 1) berekenen. </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De pMHC tetrameer gebaseerde mobiele verrijking methode die door dit protocol is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van epitoop-specifieke T-cellen van endogene T-cel repertoire. Het gebruik van pMHC tetrameren maakt detectie van epitoopspecifieke T-cellen rechtstreeks gebaseerd op het vermogen van de TCR aan cognate pMHC liganden binden. De verrijking een niveau van gevoeligheid zodat uiterst zeldzame populaties van antigeen-specifieke T-cellen kunnen gedetecteerd worden uit repertoires van endogene T-cellen z...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagens</strong</td&gt;<td<strong&gt; Vendor</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogus nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE of APC geconjugeerd pMHC tetrameer (of multimeer)</td&gt;<td&gt; Gemaakt door onderzoeker, verkregen uit de NIH tetrameer kern, of gekocht uit commerciële bronnen</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE geconjugeerd magnetische microkorrels</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC geconjugeerde magnetische microkorrels</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS magnetische columns</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS of QuadroMACS magneet</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 of 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mobiele tellen kralen</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide: mhc tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke t-cellen

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Een basisvereiste voor onderzoekers die met adaptieve immuniteit in vivo experimentele modellen is het vermogen om T-cellen op basis van hun T-cel antigen receptor (TCR) specificiteit identificeren. Veel indirecte methoden beschikbaar waarin een bulk populatie van T-cellen wordt gestimuleerd in vitro met een specifiek antigeen en epitoop-specifieke T-cellen worden geïdentificeerd door het meten van een functionele reactie zoals proliferatie, cytokine productie of expressie van merkers van activering 1. Echter, deze methoden alleen identificeren epitoopspecifieke T-cellen vertonen een van de vele functies en zijn niet gevoelig genoeg om epitoop-specifieke T-cellen te detecteren op naïeve precursor frequenties. Een populair alternatief is de TCR transgene adoptieve transfer model, waarbij monoklonale T-cellen van een TCR transgene muizen worden geënt in histocompatibel hosts een groot precursor populatie van epitoop-specifieke T-cellen die kunnen worden EASI creërenly gevolgd met behulp van een antilichaam congenische marker 2,3. Terwijl krachtige Deze werkwijze heeft experimentele artefacten die met de niet-fysiologische frequentie van T-cellen met specificiteit voor een epitoop 4,5. Bovendien kan dit systeem niet worden gebruikt om de functionele heterogeniteit van epitoop-specifieke T cel klonen te onderzoeken binnen een polyklonale populatie. De ideale manier om adaptieve immuniteit bestuderen dienen onder directe detectie van epitoopspecifieke T-cellen van het endogene T-cel repertoire volgens een methode die TCR specificiteit onderscheidt uitsluitend door haar binding aan verwant peptide: MHC (pMHC) complexen. Het gebruik van pMHC tetrameren en flowcytometrie volbrengt deze 6, maar is beperkt tot het opsporen van hoogfrequente populaties van epitoopspecifieke T-cellen aangetroffen volgende antigen geïnduceerde klonale expansie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze die het gebruik van pMHC tetrameren coördineert en magnesiumtic cel verrijkingscocktail technologie voor de detectie van extreem lage frequentie epitoopspecifieke T-cellen van muizen lymfoïde weefsels 3,7 toestaat. Met deze techniek kan men volledig volgen gehele epitoopspecifieke populaties van endogene T-cellen in muizen in alle stadia van de immuunrespons.

Figuur 1 geeft representatieve flowcytometrie stukken pMHCII tetrameer verrijkte milt en lymfeklieren monsters van naïeve muizen, terwijl Figuur 2 toont representatieve gegevens voor muizen geïmmuniseerd met de relevante peptide + CFA. Serial gating verwijdert autofluorescerende en andere ongewenste gebeurtenissen uit de analyse van CD4 + T-celpopulaties. De CD8 + T-celpopulatie dient als nuttige interne negatieve controle voor pMHCII tetrameer kleuring van CD4 + T-cellen. Merk op dat g...

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats van<em&gt; In vivo</em&gt; Experimentele systemen.

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

Een basisbehoefte voor onderzoekers die adaptieve immuniteit bestuderen met in vivo experimentele modellen is het vermogen om T-cellen te identificeren op basis van hun T-cel...

Het algemene doel van het volgende experiment is om zeldzame epitooppecifiek T-cellen te identificeren uit het endogene T-celrepertoire van muizen. Dit wordt bereikt door geoogste lymfoïde cellen eerst te kleuren met peptide MHC-tetrameer-reagentia, die de relevante epitooppecifiek T-cellen fluorescent zullen labelen. Deze met tetrameer gelabelde cellen worden vervolgens gekleurd met magnetische microbeads geconjugeerd aan antilichamen die specifiek zijn voor de fluorescerende marker op het tetrameer.Vervolgens worden de magnetisch gelabelde cellen door een gemagnetiseerde kolom geleid om het monster te verrijken met tetrameer-gebonden epitopespecifieke T-cellen. Ten slotte worden de cellen gekleurd voor de gewenste experimentele celmarkers en wordt er multiparametrische flowcytometrie uitgevoerd om de zeldzame, met tetrameren verrijkte populaties epitopespecifieke T-cellen te detecteren en te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals het TCR-transgene T-cel adoptieve transfer-systeem, is dat studies worden uitgevoerd op werkelijke polyklonale populaties epitopespecifieke T-cellen die zich op natuurlijke wijze binnen het immuunsysteem ontwikkelen.Bovendien maakt de hoge detectiesensitiviteit van deze techniek studies mogelijk van deze populaties wanneer ze in extreem lage frequenties aanwezig zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van veel kernvragen op het gebied van de immunologie, zoals hoeveel naïeve T-cellen een bepaald antigeen van een pathogene microbe kunnen herkennen, en hoe de clonale samenstelling van een epitopespecifieke T-celpopulatie verandert gedurende het verloop van een immuunrespons. Voeg vóór het begin van de dissectie 1 mL compleet EHAA-medium toe aan een kweekschaal van 60 mm die een klein vierkantje nylon gaas van 100 micron bevat, en plaats de schaal op ijs.Verwijder vervolgens de milt van een geëuthanaseerde muis en zoveel mogelijk gemakkelijk toegankelijke lymfeklieren. Plaats de weefsels op het nylon gaas in de kweekschaal. Gebruik de platte bovenkant van een gesloten 1,5 millimeter microcentrifugebuisje om de lymfoïde weefsels voorzichtig op het nylon gaas te pletten.Voeg om de lymfocyten vrij te maken nog een milliliter medium toe aan de schaal en pipetteer de oplossing vervolgens herhaaldelijk op en neer om de cellen in suspensie te brengen. Plaats nu een nieuw nylon gaasje bovenop een schone centrifugebuis van 15 milliliter van polypropyleen en breng de cellen door het nieuwe gaasje over. Spoel de schaal en het gaasje met nog een milliliter koud medium en trek de volumes door het nieuwe stukje gaas naar de 15 milliliter buis.Herhaal het spoelen nog een keer. Voeg koud sorteerbuffer toe tot een eindvolume van 15 milliliters en centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 300 ×g en vier °C. Aspireer vervolgens voorzichtig het snat resus.Resuspendeer de celpellet in FC block tot een eindvolume dat ongeveer twee keer zo groot is als dat van de pellet zelf. Indien er sprake is van sterke celklontering, verwijder het celklontje dan voorzichtig met een pipetpunt om antigen-specifieke T-cellen te kleuren.Voeg fluorescentie-gelabeld peptide MHC-tetrameer toe aan het geresuspendeerde celpellet in de geoptimaliseerde concentratie. Meng vervolgens de celsuspensie en incubeer deze gedurende de geoptimaliseerde tijd en temperatuur voor tetrameerbinding. Voeg daarna koude sorteerbuffer toe om het volume aan te vullen tot 15 milliliters en centrifugeer terwijl de cellen op vier graden Celsius worden gehouden.Aspire nu zorgvuldig het supernatant. Resuspendeer vervolgens de celpellet in sorterbuffer tot een eindvolume van 200 µL. Voeg nu 50 µL toe van de met antilichamen geconjugeerde microbeads van Miltenyi, die specifiek zullen binden aan de fluorescente tag van de tetrameermix, en incubeer vervolgens de tetrameergebonden cellen en beads bij 4 °C.Was na 20 minuten de cellen in sorterbuffer terwijl de cellen in de centrifuge zitten. Plaats een milani LS magnetische kolom op een quadro max magneet en positioneer een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter van polypropyleen. Voeg direct boven de kolom drie milliliter sorterbuffer toe aan de bovenkant van de kolom, zodat deze in de 15 milliliter buis kan weglopen.Plaats vervolgens een nylon gaas vierkant van 100 micron bovenop de kolom. Wanneer de cellen klaar zijn met centrifugeren, aspireer dan voorzichtig het supernatant en resuspendeer het pellet in drie milliliter sorteerbuffer; breng de celsuspensie vervolgens via het nylon gaas over naar de bovenkant van de kolom. Wanneer de celsuspensie volledig in de kolom is gelled, spoel de oorspronkelijke buis dan na met nog eens drie milliliter sorteerbuffer en breng dit via het gaas over naar de kolom.Verzamel het wassel in de opvangbuis en gooi het nylon gaas weg. Wanneer de buffer vervolgens volledig in de buis is geloopen, wordt de kolom nog twee keer gewassen met telkens drie milliliters sorteerbuffer. Verwijder daarna de kolom van de magneet en plaats deze boven een nieuwe polypropylene centrifugebuis van 15 milliliter.Voeg nu nog eens vijf milliliter sorteerbuffer toe aan de kolom. Plaats onmiddellijk de zuiger bovenop de kolom en duw deze in één continue beweging volledig naar beneden, zodat de buffer uit de kolom in de buis wordt geperst. Nadat zowel de buis met de geëlueerde gebonden fractie als de buis met de unbound flow-through fractie zijn gecentrifugeerd, wordt het supernatant van de gebonden fractie voorzichtig afgezogen en wordt de celpellet geresuspendeerd in sorteerbuffer tot een eindvolume van precies 95 µL; zuig de unbound fractie af en resuspendeer deze tot een eindvolume van twee milliliter voordat de celfracties verder worden gekleurd. Voeg 200 µL telbeidjes toe aan een buis van vijf milliliter voor FACS en breng vijf µL cellen over naar deze buis.Zet deze buizen apart bij vier graden Celsius voor analyse. Stel vervolgens een mastermix van antilichamen samen om oppervlaktemarkers op de cellen te kleuren volgens de tabel. Voeg voor de gebonden fractie een dosis van het antilichaamcocktail direct toe aan de cellen voor de ongebonden fractie.Breng 90 µL van de cellen over naar een vijf milliliter faxbuis en voeg aan het overgebrachte monster een dosis antilichaamcocktail toe voor elk te gebruiken fluorochroom. Meng 50 µL van de resterende ongebonden fractie cellen in een vijf milliliter faxbuis met één µL anti-CD4-antilichaam geconjugeerd aan het juiste fluorochroom. Zet daarnaast een ongekleurde controle apart, vortex vervolgens en incubeer daarna alle monsters gedurende 30 minuten bij 4 °C.Was vervolgens elke buis met vijf milliliter sorterbuffer, aspireer zorgvuldig het supernatant van de monsters van de gebonden fractie en resuspendeer de cellen in 200 µL sorterbuffer. Breng de cellen over naar 1,2 ml fax microbuisjes en spoel daarna de vorige buizen met nog eens 200 µL sorterbuffer, waarbij de spoelvloeistoffen worden samengevoegd in de overeenkomstige microbuisjes. Indien er klonten zichtbaar zijn, worden de cellen van de ongebonden fractie en de compensatiecontroles door een 50 micron filter gehaald; schenk het supernatant af en resuspendeer de pellets in één milliliter sorterbuffer.Analyseer de gekleurde monsters met behulp van een reeks opeenvolgende inclusiepoorten om CD4-positieve of CD8-positieve T-cellen te identificeren, zoals hier geïllustreerd voor de monsters van de gebonden fractie. Verzamel zoveel mogelijk cellen, tot een maximum van 2 miljoen totale events voor de monsters van de ongebonden fractie. Verzamel 1 miljoen totale events.Verzamel tot slot, met dezelfde machine-instellingen, 10.000 events van de monsters met telkralen. Deze eerste figuur TOONT representatieve flowcytometrie-plots van peptide MHC II-tetrameer-verrijkte milt- en lymfeknoopmonsters van naïeve muizen voor gebonden en ongebonden celfracties. Er werd een reeks gates ingesteld om lymfoïde scatter-positieve side scatter-events te selecteren die dump-negatief en CD3-positief waren; van deze events werden de CD4-positieve of CD8-positieve events gegated voor de analyse van epitoop-specifieke T-cellen of achtergrondkleuring.Aliquoten van niet-gekleurde cellen uit de gebonden en ongebonden fracties werden gemengd met fluorescerende telkralen en afzonderlijk geanalyseerd. Deze dichtheidsplots tonen representatieve gegevens voor muizen die vooraf waren geïmmuniseerd met het relevante peptide plus compleet adjuvans. Dezelfde seriële gating-strategie als in het vorige experiment werd gebruikt om autofluorescentie en andere ongewenste events te verwijderen.Uit de analyse van de CD4-positieve T-celpopulaties bleek dat de CD8-positieve T-celpopulatie diende als een bruikbare interne negatieve controle voor de peptide-MHC II-tetrameerkleuring van CD4-positieve T-cellen. De absolute aantallen epitopspecifieke T-cellen in een monster worden berekend door het totale aantal cellen in de gebonden fractie van het verrijkte monster, zoals bepaald via de bead-telling-analyse, te vermenigvuldigen met de proportie van deze cellen die tetrameer-positief zijn, zoals bepaald via de celkleuringsanalyse. Voor de getoonde representatieve gegevens van naïeve muizen in de eerste serie densiteitsplots was het totale celgetal 4.411 en het bead-getal 5.589. De concentratie van de bead-voorraad was 2 × 10⁵ per milliliter.Het kraalvolume was 0,2 milliliters en het celvolume was 0,005 milliliters. Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om de celconcentratie van 6,31 x 10⁶ per milliliter te berekenen. De celconcentratie werd daarna vermenigvuldigd met het totale monstervolume om het totale aantal cellen te bepalen.Deze gegevens werden vervolgens vermenigvuldigd met het percentage tetrameer-positieve events uit de celanalyse om vast te stellen dat het aantal epitopspecifieke CD4-positieve T-cellen van deze naïeve muis 98 bedroeg. Voor de representatieve gegevens van de geïmmuniseerde muis in de tweede reeks dichtheidsplots was het totale aantal epitopspecifieke CD4-positieve T-cellen 1,53 × 10⁴. De efficiëntie van de verrijking neemt af naarmate het aantal epitopspecifieke T-cellen toeneemt.Hierdoor kunnen tetrameer-positieve cellen worden aangetroffen in de ongebonden fractie van monsters met zeer hoge frequenties van epitoopspecifieke T-cellen. In dergelijke gevallen kan het aantal epitoopspecifieke T-cellen in de ongebonden fractie afzonderlijk worden berekend en worden opgeteld bij het aantal in de gebonden fractie. In de representatieve ongebonden cel-fractie van de geïmmuniseerde muis bedroeg het totale aantal epitoopspecifieke CD4-positieve T-cellen bijvoorbeeld 8,97 × 10³.Door dus de getallen van de gebonden en ongebonden fracties op te tellen, waren er in het gehele geïmmuniseerde muismonster 2,43 x 10⁴ totale epitoop-specifieke CD4-positieve T-cellen. Indien de expansie van epitoop-specifieke cellen voldoende robuust is, kan het verrijkingsproces inderdaad worden overgeslagen. Na de verrijkingprocedure kunnen fixatie- en permeabilisatiestappen worden uitgevoerd om kleuring van intracellulaire eiwitten, zoals cytokinen en transcriptiefactoren, mogelijk te maken.Hoewel deze methode oorspronkelijk was ontworpen voor studies naar T-cellen uit de milt en lymfeklieren, kan deze ook worden toegepast op andere weefsels, zoals de thymus en de darm. De techniek kan daarnaast worden gebruikt om epitypespecifieke T-cellen in menselijke bloed- en weefselmonsters te bestuderen.

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

This video describes a protocol for isolating rare-antigen-specific CD8+ T cells using magnetic nanoparticle-based artificial antigen-presenting cells (aAPCs) functionalized with antigenic peptide-loaded MHC-Igs and anti-CD28 antibodies. Interaction of the aAPCs with CD8+ T cells specifically expressing the antigenic peptide-targeting T cell receptors, followed by their expansion in vitro, results in the enrichment and expansion of this CD8+ T cell population.

Nanoparticle-Based Enrichment and Expansion of Antigen-Specific CD8+ T Cells

This video demonstrates a method for characterizing CD8+ memory T cells specific to simian immunodeficiency virus (SIV) using peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers. A pMHC-I tetramer is a complex of four MHC-I molecules bound to SIV-specific peptides and conjugated to a fluorophore. These tetramers selectively bind to T cell receptors (TCRs) on SIV-specific CD8+ T cells, facilitating the characterization of these cells.

A Peptide-MHC-I Tetramer Staining Technique to Analyze SIV-Specific CD8+ Memory T Cells

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van MHC klasse I en klasse II peptidecomplexen uit muis- en menselijke cellijnen die hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens leveren. Het protocol richt zich op monstervoorbereiding met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.

Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Leer epitoop-specifieke T-cellen isoleren met peptide:MHC-tetrameren en magnetische microbeads. Deze methode verrijkt zeldzame T-celpopulaties uit muizen voor immunologisch onderzoek.

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

Meer video's verkennen