Optische overvullen van nanodeeltjes

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een diafragma-optische trapping-opstelling om deeltjes met een grootte van ongeveer 20 nanometer te vangen. Hiervoor wordt een detector toegevoegd aan een bestaande optische laser-trapping-opstelling om metingen mogelijk te maken. Vervolgens wordt de te meten nanodeeltjesoplossing in een microfluïdische kamer met de dubbele nanogaatjesval geplaatst, waarna de kamer op de optische trapping-opstelling wordt geladen.

Wanneer een deeltje de verlichte opening binnendringt, neemt de lichttransmissie drastisch toe als gevolg van diëlektrische belading. Als het deeltje de opening probeert te verlaten, veroorzaakt de afgenomen transmissie een verandering in het momentum naar buiten toe vanuit het gat; volgens de derde wet van Newton resulteert dit in een kracht die het deeltje terug in het gat trekt, waardoor het deeltje gevangen wordt. Het deeltje veroorzaakt een roodverschuiving van de transmissiecurve, die gemonitord kan worden.

Hierdoor kan de val als sensor dienen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die vangstgebeurtenissen van nanodeeltjes aantonen, waaronder het ontvouwen van gevangen eiwitten, zoals aangegeven door veranderingen in de laserintensiteit door het dubbele nanogaatje. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals optisch vangen met gradiëntkracht, is dat het kleinere nanodeeltjes kan vangen bij lagere laserintensiteiten.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biochemie, zoals hoe individuele eiwitten vouwen en met elkaar interageren, en hoe virusdeeltjes levende cellen infecteren. Over het algemeen zullen personen bij deze methode problemen ondervinden, omdat het lastig is om het dubbele nanogaatje te integreren in een bestaand laser-trapsysteem. De opstelling voor optische trapping is gebaseerd op een optische pincetkit van Thor Labs, uitgerust met een module voor krachtmeting.

Een avalanche-fotodiode wordt gebruikt om de kwadrantdetector in de krachtmetingsmodule te vervangen. Bij het opzetten van het optische trapping-systeem moet oogbescherming worden gedragen telkens wanneer de laser aan staat. Zorg ervoor dat de bundel binnen een veilig gebied blijft door in een afgesloten ruimte te werken en de bundel zoveel mogelijk binnen de trapping-opstelling te houden; reflecterende sieraden dienen vermeden te worden.

Draag latex handschoenen. Om de reinheid van de optische opstelling te waarborgen, worden de optische pincetkit en de krachtmetingsmodule klaargezet. Volgens de instructies van de fabrikant heeft de geassembleerde optische pincetkit een ontwerp met een omgekeerde lichtmicroscoop en bestaat deze uit de volgende onderdelen: een laser voor de optische val, een 100 x olie-immersieobjectief, een driasige monsterpositioneringstabel en een CCD-camera.

Houd er rekening mee dat bescherming tegen elektrostatische ontlading wordt aanbevolen bij het hanteren van laserdiodes. De krachtmetingsmodule maakt kalibratie van de optische pincet mogelijk met behulp van positiedetectie van het achterste brandvlak van de condensor. In plaats van de krachtmetingsmodules wordt een siliciumgebaseerde avalanche photo DDE of een PD gebruikt.

Plaats daarnaast een weerstands-condensatorfilter of RC-filter met een weerstand van 200 kilo ohm en een condensator van 100 picofarad in de kwadrantpositiedetector. Dit wordt gebruikt om hoogfrequente ruis te verminderen en om het zichtbaar maken van trapping-events op de oscilloscoop te vergemakkelijken. Gebruik een coaxkabel om het RC-filter na de APD aan te sluiten. Gebruik vervolgens coaxkabels en een T-adapter om de oscilloscoop en de data-acquisitiemodule op het RC-filter aan te sluiten.

Het systeem is nu klaar voor het laden van het monster. De dubbele nanogaatjesopening bestaat uit twee nanogaatjes die met een gefocuste ionenbundel in een goudfilm zijn gefreesd. De film is 100 nanometers dik en wordt ondersteund door een glazen substraat.

De nanogaten overlappen elkaar, waardoor twee scherpe punten ontstaan. Nanodeeltjes zullen door laserlicht, dat op het dubbele nanogaat valt, worden vastgehouden in de opening tussen deze punten.

Er moeten ook grote registratiekenmerken in de metaalfilm worden gefreesd om te helpen bij het identificeren van de locatie van het dubbele nanogat in de lichtmicroscoop. Deze kenmerken moeten ongeveer 100 micron verwijderd zijn van het dubbele nanogat. Giet 10 gram polydimethylsiloxaan of PDMS-basis en één gram hardeningsmiddel in een wegwerpbeker. Meng dit gedurende enkele minuten.

Vacumeer vervolgens het mengsel in een vacuümkamer tot alle bellen verdwenen zijn. Giet daarna 1,5 gram PDMS in een Petrischaal met een diameter van negen centimeter. Spin-coat de PDMS op de bodem van de Petrischaal gedurende 65 seconden bij 950 RPM na het starten van het spinnen.

De dikte is niet kritisch, zolang deze onder 80 microns ligt. Plaats voorzichtig drie tot vijf dekglasjes van nummer 1,5 op de PDMS, zodanig dat ze elkaar niet overlappen, en laat dit 30 minuten vacuümeren.

Als de dekglasjes tijdens de evacuatie verschuiven en op elkaar gestapeld raken, verschuif ze dan voorzichtig van elkaar af. Zorg ervoor dat de PDMS onder de dekglasjes dun en uniform blijft. Evacueer de Petrischaal vervolgens opnieuw gedurende 30 minuten.

Haal de Petrischaal uit de vacuümkamer en verhit deze 20 minuten lang op 85 °C op een warmteplaat om de PDMS uit te harden. Zodra de PDMS gestold is, gebruikt u een scheermesje om langs de randen van een van de dekglasjes te snijden. Gebruik vervolgens een fijne pincet of een mesje om het objectglas voorzichtig omhoog te wippen; een dunne laag PDMS zal aan het dekglasje kleven.

Plaats het dekglas met PDMS in een nieuwe Petrischaal. Snijd vervolgens met een scheermesje een venster van drie millimeter bij drie millimeter in het PDMS. Dit venster vormt de kamer waarin de nanodeeltjesoplossing zal worden bewaard.

Gebruik een lasersnijder om een houder voor microscopische preparaten van acryl te vervaardigen met een gat van driekwart inch diameter in het midden. Plak de rand van het gat af met dubbelzijdige tape. Gebruik een scheermesje om overtollige tape weg te snijden.

Plaats het vervaardigde microscopiediapje op een van de voorbereide PDMS-gecoate dekglasjes, zodat het PDMS tussen het glas en het acryl komt te liggen. Voeg met een micropipet een paar druppels van een 0,05% gewicht per volume polystyreen-nanosfeeroplossing toe aan het PDMS-venster.

Voeg een druppel toe op de goudfilm waar de nanogaten zich bevinden. Plaats de goudsample bovenop dekglasplaatjes met de nanogaten binnen het PDMS-venster. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer aanwezig zijn.

Druk vervolgens het gouden monster tegen het dekglas. Absorbeer en verwijder eventuele overtollige oplossing met een vloeipapier, aangezien er een olie-immersieobjectief zal worden gebruikt. Voeg een druppel olie toe aan de andere zijde van het dekglas, bovenop het PDMS-venster.

Let op de locatie van de nanogaatjes. Plaats de microscoop. Schuif de objectglas in de objectglashouder met de olie naar beneden, en laat vervolgens de objectglashouder zakken tot de immersieolie in contact komt met de microscoop.

Lijn de objecttafel grofweg uit, zodat de in de gouden film gefreesde registratiemerken zich onder het objectief bevinden. Gebruik hiervoor beeldacquisitie-software zoals ThorSight, dat deel uitmaakt van de trapping-kit. Zoek de registratiemerken op de gouden film en volg de indicatielijnen naar de nanogaten.

Positioneer de objectglas zo dat indicatiemerken en andere open gebieden uit het centrum van het scherm zijn verwijderd. Overmatige lichttransmissie kan de A PD beschadigen; schakel de laser in. Aangezien de dichroïsche spiegel niet perfect is, zou er een spot van de laserstraal nabij het centrum van het scherm verschijnen moeten.

Gebruik de besturingssoftware voor de piëzotabel. Verfijn de uitlijning op alle drie de assen verder. Wanneer de uitlijning correct is, zal de maximale PD-spanning worden waargenomen, wat duidt op de hoogste transmissie door de nano-apertuur.

Nu het systeem is ingesteld en het monster is geladen, kunnen de gegevens voor optische trapping worden verzameld. Positioneer de spot met behulp van de indicatiemerken dicht bij een bekende locatie van een nanogaatje. De dubbele nanogaatjes zullen te klein zijn om duidelijk te kunnen worden opgelost en zullen als kleine stippen op het scherm verschijnen.

De lichttransmissie door het monster wordt aangegeven door het signaalniveau op de oscilloscoop. Lijn het monster verder uit om de lichttransmissie te maximaliseren. Let op indicatiemerken en zichtbare en onzichtbare krassen, aangezien de lichttransmissie in deze gebieden hoog zal zijn; nanogaten zullen plotselinge sprongen in de lichttransmissie vertonen, terwijl krassen dat niet doen.

Gebruik de golflaamplaat om geleidelijkere veranderingen teweeg te brengen. Pas de lichtpolarisatie aan om de hoogste lichttransmissie te bereiken, aangezien de dubbele nano-gatstructuur gepolariseerd is. Gebruik de data-acquisitiemodule om de spanning van de APD's gedurende de gewenste tijd te bemonsteren om gegevens te verkrijgen.

De acquisitietijden bedragen doorgaans honderden seconden. In dit geval wordt aangepaste software gebruikt voor de data-acquisitie en wordt de spanning 2000 keer per seconde gesampled. Filter de verkregen gegevens met MATLAB met behulp van een KY Gole-filter en zet deze uit tegen de tijd in een grafiek om het vangen van polystyreen-nanodeeltjes van 20 nanometer aan te tonen; de transmissie door het dubbele nanogaat werd gemeten als functie van de tijd.

Vervolgens werd de optische transmissie van de PD uitgezet. In de loop van de tijd is het vangeven kenmerkend plotseling, met een scherpe overgang die een duidelijke schakeling tussen twee transmissievermogensniveaus laat zien zoals in dit voorbeeld; er is vaak een toename van de signaalruis in de gevangen toestand. Deze toename van de ruis is afkomstig van de brownse beweging van het gevangen deeltje.

Let op dat deze ruisbron niet aanwezig is zonder het gevangen deeltje. Er kunnen artefacten in de resultaten verschijnen die niet duiden op vangstgebeurtenissen. Resultaten die drift vertonen, zichtbaar als langzame veranderingen in de transmissie over een periode van minuten zoals hier getoond, moeten worden verworpen. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals Raman- en fluorescentiespectroscopie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de aard van het gevangen nanodeeltje na de ontwikkeling ervan.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om biologisch relevante nanodeeltjes op het niveau van individuele moleculen te bestuderen. Bijvoorbeeld om eiwitbinding en virusinfecties waar te nemen op het niveau van individuele moleculen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een dubbele nho-optische pincet in een inverterend microscoop-laser T-systeem kan worden geïntegreerd om individuele nanodeeltjes te vangen.