Name: Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer FACS-isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten uit verse weefsels met PDGFRα-markering. Deze methode minimaliseert contaminatie door immuun- en epitheelcellen en behoudt genexpressieprofielen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Jitschak Oschry en Dr Orit Sagi-Asif voor hun hulp bij FACS sortering. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan NE van de Europese Unie zevende kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr. ​​[276890], van het Israël Cancer Association (# 20110078), en van de Israëlische Cancer Research Fund (Research Career Development Award).

1. Ontleden uier of huidweefsel van muizen <ol><li> Voor het ontleden van de gewenste weefsel van muizen, de voorbereiding van de volgende leveringen en reagentia: Benodigdheden: <ul><li> Chirurgie gereedschap (gewassen met wasmiddel en vervolgens ondergedompeld in 70% ethanol). </li><li> Styrofoam oppervlak de muis rusten tijdens dissectie. </li><li> Pins of naalden aan muizen te houden tijdens dissectie. </li><li> Glazen pot met deksel voor de spijsvertering, met daarin magnetische roerstaaf (geautoclaveerd). </li><li> Waterbad bij 37 ° C, met een dompelpomp magnetische roerder en voldoende water te dompelen de spijsvertering pot, terwijl rust op de roerplaat. </li></ul> Reagentia: <ul><li> FACS buffer I: (4 ° C): Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing CMF (Calcium Magnesium Free) + 0,5% BSA </li><li> Collagenaseoplossing (die onmiddellijk voor gebruik): 0,05 g Collagenase II 0,05 g Collagenase IV 0,01 g deoxyribonuclease 20ml FACS buffer I. houden collagenaseoplossing tot gebruik op ijs. </li><li> PharmLyse (Ammonium Chloride lyseringsreagens). </li><li> FACS buffer II: Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing CMF + 1% FCS. </li></ul></li><li> Dissectie van de borstklieren (zie ook 17). <ul><li> Euthanaseren vrouwelijke muizen met behulp van kooldioxide (CO 2) inademing. </li><li> Op een piepschuim ondergrond, plaatst u de muis op zijn rug en speld vast alle vier de ledematen met 25 gauge naalden (Figuur 1A). Royaal Spuit de muis met 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een tang, trek de buikhuid bij de middellijn en maak een kleine incisie met een scherpe schaar. </li><li> Vanaf de incisie, de huid snijden tot aan de nek van het dier terwijl het vermijden aanprikken van de buik of borstkas holten. </li><li> Snijd de huid op de achterpoten van de middellijn incisie naar het been, resulterend in een &quot;Y-vorm&quot;. </li><li> Trek de huid van de muis lichaam en vastpinnen, het blootstellen vande borstklieren aan de onderkant van de huid (Figuur 1B). </li><li> Gebruik Q-tips om voorzichtig melkklieren te scheiden van de huid tijdens het snijden bindweefsel met kleine scherpe schaar om de borstklier te scheiden in de richting van de rug van de muis. </li><li> De abdominale klieren (# 4, 5) zijn het beste voor dit protocol. U kunt ook gebruik maken van de 2 e borstklier, maar houd in gedachten dat deze klieren anatomisch bevinden zich in de nabijheid van de borstspier, die moeilijker te scheiden, wat resulteert in cellen van gemengde weefsels oorsprong. </li><li> Opmerking: Wanneer ontleden tumorweefsel, is het raadzaam om necrotische gebieden te verwijderen. </li></ul></li><li> Dissectie van huidweefsel: De eenvoudigste manier om de huid weefsel te verkrijgen, zonder dat te maken met ontharing is het gebruik van de muis oren. Als een grotere hoeveelheid weefsel nodig is, kunt u afscheren haar van de muis torso en ontleden huid. <ul><li> Euthanaseren muizen met CO2 inhalatie. </li><li> Met behulp van een scherpe schaar, sneed beide oren en plaats direct bij de spijsvertering pot met een klein volume (~ 0,5 ml) van PBS op ijs. </li></ul></li></ol> 2. Voorbereiding van borstklier / huid enkele celsuspensie <ul><li> Plaats melkklieren / achtergrond in vertering pot met een klein volume PBS op ijs. Als weefsel is bloederig wassen x2 met PBS, en dan gooi overtollige PBS. </li><li> Hak grondig met gebogen schaar. </li><li> Voeg 20 ml collagenase oplossing (let op: dit bedrag van collagenase oplossing zal ongeveer 5 g van mammaire of tumorweefsel en oren efficiënt distantiëren van maximaal 15 muizen). </li><li> Plaats onmiddellijk roerplaat in 37 ° C waterbad en incubeer gedurende 15 min onder roeren bij gemiddelde snelheid. </li></ul> Opmerking: optimale incubatietijd kan variëren als het verteren van andere weefsels. <ul><li> Om de reactie te stoppen, voeg 30 ml koude DMEM + 10% FCS. </li><li> Zeef het weefsel / media mengsel througha 70 urn celzeef bovenop een 50 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer de conische buis gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C. </li></ul> 3. Rode bloedcellen Lysis Let op: deze stap is niet nodig als muizen waren hart-perfusie met PBS voordat ze werden geofferd. <ul><li> Zuig de supernatant met een glazen pipet aan vacuum, zonder de celkorrel. </li><li> RBC, resuspendeer celpellet lyseren in 10 ml PharmLyse oplossing en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Neutraliseer de PharmLyse oplossing door toevoeging van ongeveer 40 ml FACS-buffer I. </li><li> Draai de conische buis met cellen gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatant. </li></ul> 4. Het blokkeren van endogene Fc <ul><li> Optioneel: aantal cellen naar de juiste volume voor de volgende stappen te bepalen. </li><li> Resuspendeer cellen in 1-3 ml FACS buffer I (afhankelijk on aantal cellen, en de hoeveelheid antistoffen die u wilt gebruiken). </li><li> Voeg FcBlock (anti-muis CD16/CD32) tot 1:50 verdunning (10 ug / ml) te bereiken en op ijs geïncubeerd gedurende 10-20. Geen behoefte te wassen FcBlock. </li></ul> 5. Kleuring <ul><li> Neem 100 ul aliquots op eppendorf buizen worden gebruikt als een niet-gekleurde bediening met een kleurinstellingen (volgens het aantal gebruikte fluorescente antilichamen). </li><li> Om label fibroblasten: voeg anti-PDGFRα (direct geconjugeerd aan fluorofoor) met een verdunning van 1:50 (10 ug / ml). </li><li> Om andere celpopulaties (bijv. immuuncellen, macrofagen, endotheelcellen, enz.) te labelen: voeg de juiste fluorescent geconjugeerde antilichamen aan de oppervlakte markers, een 1:50 verdunning. </li></ul> Opmerking: hoewel PDGFRα is een robuuste marker voor fibroblasten, wordt aanbevolen antilichamen omvatten immuuncellen en epitheelcellen om eventuele dubbele positieve sluitenpopulaties en zo de zuiverheid van geïsoleerde fibroblasten. <ul><li> Voeg 2 pi van elk antilichaam aan elk van de kleur control eppendorf buizen. </li><li> Incubeer cellen met antilichamen gedurende 1 uur op ijs in het donker. </li><li> Te wassen: vul buizen met FACS-buffer I en draai gedurende 5 minuten bij 450 xg bij 4 ° C. </li><li> Zuig supernatant, resuspendeer cellen in FACS buffer I tot een concentratie van ongeveer 2 x 10 6 cellen / ml, of welke concentratie meest geschikt voor het sorteren met de beschikbare FACS sorter. </li></ul> Optioneel: Cellen worden opnieuw gesuspendeerd in FACS buffer II gedurende de sortering. Dit kan de levensvatbaarheid van de cellen. Echter kan de blootstelling aan factoren in serum van invloed genexpressie die moet worden getest, en in aanmerking genomen. <ul><li> Overdracht gelabelde cellen in FACS buisjes met filter boven: filter cellen in de buizen naar cel klonten te voorkomen. </li><li> Om dode cellen te sluiten, voegt 7AAD (0,5 ug / ml) of Propidium jodide (PI) monsters (met uitzondering van de niet-gekleurde controle). </li></ul> Opmerking: Om te voorkomen dat het verspillen van cellen, kunt u 7AAD/PI toevoegen aan de niet-gekleurde monster na het opnemen in de FACS, en opnieuw als 7AAD controlegroep met uitsluitend gebruiken. <ul><li> Bewaar monsters op ijs tijdens het analyseren. </li></ul> 6. Isolatie van cellen door FACS (Let op: dit deel van het protocol vereist voorkennis in de exploitatie van een FACS sorter, bijvoorbeeld BD FACS AriaII, of de hulp van een vakman). <ul><li> Met behulp van de FACS sorter software (BD FACSDiva), voor te bereiden passende analyse percelen voorwaartse verstrooiing (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC), 7AAD, FITC, PE en andere fluorofoor gebruikt om label-cellen (Figuur 2) te analyseren. </li><li> Voor het laden van elk monster voor de cel sorteerder, vortex kort aan cellen opnieuw in suspensie. </li><li> Begin met de ongekleurde monster analyseren om de gating gesteld aan de totale celpopulatie te gate van cell puin, en autofluorescentie of achtergrondkleuring bepalen. </li><li> Analyseer ongekleurde monster + 7AAD bepalen en gate de populatie van levende cellen van de totale celpopulatie. </li><li> Analyseer elke afzonderlijke kleur controle om vast te stellen en te kalibreren parameters zoals compensatie. </li><li> Analyseer de gekleurde monster om de positie van poorten te definiëren voor het sorteren. </li><li> Zodra de parameters en poorten voor de gewenste celpopulaties zijn ingesteld, begint het sorteren van de gelabelde celpopulaties in Eppendorf buizen of 15 ml conische buizen met kweekmedium of RNA lysis buffer (zoals RLT buffer of Trizol). </li></ul> Opmerking: Als het sorteren van een groot aantal cellen, wordt het afgeraden om direct te sorteren in RNA lysis buffer, de grote hoeveelheid mantelvloeistof bij de cellen de lysisbuffer verdunnen en verminderen de opbrengst. <ul><li> Spin Cellen naar beneden direct na het sorteren is voltooid, en de overdracht naar vers medium of RNA lysis buffer, deafhankelijk van het doel van uw experiment. </li><li> Indien het sorteren met het oog op de cultuur geïsoleerde cellen, uit te voeren steriel soort. Voor beter herstel van cellen met fenolrood vrij DMEM + 5% FCS plaats van FACS buffer II en verzamelen cellen in kweekmedium met 20% FCS. </li><li> Als het kweken gesorteerd fibroblasten, alwaysplate op collageen gecoate platen en nooit rechtstreeks op kunststof, omdat dit resulteert in activatie van fibroblasten die leidt tot veranderingen in hun genexpressie. </li></ul>

<ol><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li>
<li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).</li>
<li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
<li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research & therapy. 12, R83Forthcoming.</li>
<li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+mitotic+clock+or+culture+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation%3A+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li>
<li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19(2008).</li>
<li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Terwijl experimenten uitgevoerd in weefselkweek kan informatief en suggereren functionele principes die kunnen worden geverifieerd in vivo is bekend dat grote veranderingen in genexpressie van cellen in kweek 11,12. Om een ​​weefselkweek stap vermijden wanneer genexpressie profilering in fibroblasten, ontwikkelden we een protocol waarmee Isolatie van normale, evenals kanker geassocieerde fibroblasten van verse muis of menselijk weefsel. Dit protocol werd met succes toegepast met de huid, pancreas en ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Naam van het reagens</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogusnummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Opmerkingen (optioneel)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; Biological Industries</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase II</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase IV</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mobiele zeef 70 pm</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gezuiverd anti-muis CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Via sonde (7AAD)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-muis CD140a-PE (PDGFRA)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-muis F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o fenolrood</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collageen type I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (facs)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Kankergeassocieerde fibroblasten (CAF) zijn de voornaamste celtype in de tumorstroma van vele soorten kanker, in het bijzonder borstkanker, en de prominente aanwezigheid wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose 1,2. CAF zijn een geactiveerd subpopulatie stromale fibroblasten, waarvan vele drukken de myofibroblast marker α-SMA 3. CAF afkomstig zijn van plaatselijke weefsel fibroblasten en van beenmerg afgeleide cellen gerekruteerd voor de ontwikkeling en tumor CAF fenotype onder invloed van de tumor micro 4 nemen. CAF werd aangetoond dat de tumor initiatie, groei en vooruitgang te bevorderen door middel van signalering dat bevordert tumorcelproliferatie, angiogenese en invasie 5-8. We hebben aangetoond dat CAF tumor groei door bemiddeling tumor-bevorderende ontsteking, vanaf de eerste stadia preneoplastisch 9. Ondanks de toenemende bewijs van de belangrijke rol CAF spelen in het faciliteren van de groei van tumoren,bestuderen CAF is een permanente uitdaging vanwege het ontbreken van CAF-specifieke markers en de enorme heterogeniteit van deze cellen met vele subtypen coëxisterende in de tumor micro-omgeving 10. Bovendien onderzoekt fibroblasten in vitro belemmerd door het feit dat hun genexpressieprofiel vaak veranderd in weefselkweek 11,12. Om dit probleem aan te pakken en onpartijdige genexpressie van fibroblasten van verse muis en menselijke weefsels mogelijk te maken, werd een methode ontwikkeld op basis van eerdere protocollen voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 13,14. Onze aanpak is gebaseerd op het benutten van PDGFRα als een oppervlak marker om fibroblasten te isoleren van verse muis en menselijk weefsel. PDGFRα is overvloedig uitgedrukt door zowel de normale fibroblasten en CAF 9,15. Deze methode maakt isolatie van zuivere populaties van normale fibroblasten en CAF, inclusief maar niet beperkt tot α-SMA + geactiveerd myofibroblasten. Fibroblasten geïsoleerd kunnen danvoor karakterisering en vergelijking van de ontwikkeling van genexpressie die optreedt in CAF tijdens tumorigenese. Sterker nog, wij en anderen gemeld expressie profilering van fibroblasten geïsoleerd door celsortering 16. Dit protocol werd met succes uitgevoerd te isoleren en hoogverrijkt populaties van fibroblasten profiel van de huid, borstklier, pancreas en longen. Bovendien maakt onze methode ook kweken van cellen gesorteerd, om functionele experimenten en verontreiniging door tumorcellen, die vaak een groot obstakel wanneer het proberen om cultuur CAF voorkomen.

Met PDGFRα als marker voor fibroblasten resultaten in isolatie van sterk verrijkte populaties van weefsel fibroblasten. De zuiverheid na sortering was 99%, zoals gekwantificeerd door post-sort analyse (Figuur 2A). Geschatte percentage niet-contaminerende fibroblast cellen door de relatieve expressie van cel-specifieke controle genen (Figuur 2B) toont typisch 0,1-0,6% verontreiniging. Deze zuiverheid maakt het mogelijk hoge kwaliteit transcriptoom profilering van geïsoleerde fibroblasten...

Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Kankerassociated fibroblasten (CAF's) zijn het meest prominente celtype binnen het tumorstroma van veel soorten kanker, in het bijzonder borstcarcinomen, en hun ...

Het doel van deze procedure is om normale en met kanker geassocieerde fibroblasten te isoleren uit vers weefsel. Dit wordt bereikt door eerst de melkklieren te dissekeren. De tweede stap bestaat uit het prepareren van de melkklieren tot enkelcel-suspensies, waarna de cellen worden behandeld met fibroblast-specifieke antilichamen, evenals antilichamen die specifiek zijn voor andere celpopulaties.De laatste stap is het uitvoeren van fluorescence-activated cell sorting (FACS). Uiteindelijk wordt Q-R-T-P-C-R expressieprofilering van specifieke markers die tot expressie komen in de gesorteerde celpopulaties gebruikt om de zuiverheid van deze populaties te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor fibroblastisolatie is dat het de isolatie van de meerderheid van de weefselfibroblasten mogelijk maakt met minimale contaminatie door immuuncellen of epitheelcellen, terwijl een weefselkweekstap wordt vermeden die het genexpressieprofiel van de fibroblasten zou kunnen veranderen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot alle therapieën voor borstkanker, omdat het begrijpen en identificeren van moleculaire targets een nieuwe combinatorische benadering kan bieden om de progressie van borstkanker te bestrijden, de overleving van patiënten te verlengen en uiteindelijk kan helpen bij het verbeteren en afstemmen van individuele therapeutische opties. Naast u zal Dr. Lena, de labmanager, de procedure demonstreren. Om deze procedure te starten, plaatst u de geëuthanaseerde vrouwelijke muis op haar rug op een styrofoam ondergrond en gebruikt u naalden van 25 gauge om alle vier de ledematen stevig vast te pinnen.Besproei de muis ruim met 70% ethanol met behulp van een pincet. Trek de abdominale huid bij de middellijn omhoog en maak met een scherpe schaar een kleine incisie vanaf het startpunt. Snijd de huid door tot aan de nek van het dier, waarbij u voorkomt dat de abdominale en thoracale holtes worden geperforeerd.Snijd de huid op de achterpoten vanaf de midline-incisie in de richting van het poot, zodat er een Y-vorm ontstaat. Trek vervolgens de huid weg van het lichaam van de muis en zet deze vast met spelden om de melkklieren bloot te leggen die aan de onderzijde van de huid zijn bevestigd. Een van de meest problematische aspecten van deze procedure is het vermijden van het meenemen van spierweefsel.Om dit probleem te voorkomen, neem ik alleen de vierde en vijfde melkklier en niet de tweede, aangezien deze zich in nauwe nabijheid van het spierweefsel bevindt. Gebruik wattenstaafjes om de melkklier voorzichtig van de huid te scheiden, terwijl het bindweefsel met kleine scherpe scharen wordt doorgesneden om de melkklier richting de ruggengraat van de muis te scheiden; verwijder alle aangetroffen necrotische regio's. Plaats de gedissecteerde melkklieren in PBS op ijs.De eenvoudigste manier om huidweefsel te verkrijgen zonder rekening te hoeven houden met ontharing, is door muizeroren te gebruiken. Gebruik een scherpe schaar om beide oren van de geëuthanaseerde muis af te knippen. Plaats de oren onmiddellijk in een digestiepot met een klein volume PBS op ijs.Om een enkelcellesuspensie van de melkklier te bereiden, werden gebogen scharen gebruikt om de melkklieren grondig fijn te knippen in een digestiepot met een klein volume PBS op ijs; voeg vervolgens 20 milliliters collagenase-oplossing toe aan het fijngeknipte weefsel. Deze hoeveelheid collagenase-oplossing zal ongeveer vijf gram melkklier- of tumorweefsel en vetten van maximaal 15 muizen efficiënt dissociëren. Plaats dit onmiddellijk op een roerplaat in een waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 15 minuten onder matig roeren; stop de reactie door 30 milliliters koud DMEM plus 10% FCS toe te voegen.Zef vervolgens het mengsel van weefsel en medium door een cellenzeef van 70 micron die bovenop een conische buis van 50 milliliter is geplaatst. Centrifugeer de conische buis gedurende vijf minuten bij 450 ×g bij vier graden Celsius. Indien de muizen vóór de offerdatum niet met PBS hartgeperfundeerd zijn, moeten de rode bloedcellen in het monster worden gelyseerd vóór de immuunkleuring.Cellen moeten worden geblokkeerd voor endogeen Fc voorafgaand aan de labeling van fibroblasten en andere celpopulaties. Resuspendeer de cellen in één tot drie milliliter FACS-buffer 1 en voeg vervolgens Fc-blok toe in een verdunning van 1:50; incubeer op ijs gedurende 10 tot 20 minuten. Het is niet nodig om de Fc-blok af te wassen. Transfer celaliquots van 100 µL naar Eppendorf-buisjes om te gebruiken als ongestreepte controle en enkelkleurcontroles.Afhankelijk van het aantal fluorescerende antilichamen dat in deze demonstratie wordt gebruikt, worden twee fluorescerende antilichamen gebruikt om fibroblasten te labelen met anti-PDGF-receptor-alfa. Deze is direct geconjugeerd aan een fluor in een verdunning van 1:50 voor het sorteermonster, evenals voor de enkelkleur-controles om andere celpopulaties te labelen. Voeg de passende fluorescerend geconjugeerde antilichamen tegen oppervlaktemarkers toe, eveneens in een verdunning van 1:50.Voeg antilichamen ook toe aan de juiste enkelkleur-controlebuisjes; het wordt aanbevolen om antilichamen voor immuuncellen en epitheelcellen op te nemen om dubbelpositieve populaties uit te sluiten en zo de zuiverheid van de geïsoleerde fibroblasten te verhogen. Incubeer de cellen vervolgens gedurende één uur op ijs in het donker met de antilichamen. Was de cellen na een uur door de buisjes te vullen met FACS-buffer 1 en deze vijf minuten te centrifugeren bij 450 ×g bij 4 °C. Aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in FACS-buffer 1 tot een concentratie die het meest geschikt is voor sortering met de te gebruiken FACS-sorter. Breng de gelabelde cellen over naar FACS-buisjes met filterdoppen en filter de cellen in de buisjes om celklonters te voorkomen en dode cellen uit te sluiten.Voeg DPI toe aan alle monsters, behalve aan de ongekleurde controle. Houd de monsters op ijs tijdens de FACS-analyse. Gebruik om deze procedure te starten de software van de FACS-sorter om de fluorescentie-instellingen, acquisitie-instellingen en de hydrodynamische druppelinstellingen voor te bereiden.Vortex elk monster kort om de cellen opnieuw te suspenderen voordat ze in de cel sorter worden geladen. Begin met het analyseren van het ongekleurde monster om de gating voor de totale celpopulatie in te stellen, zodat celdebris kan worden uitgesloten en de autofluorescentie of achtergrondkleuring kan worden bepaald. Analyseer vervolgens het ongekleurde monster met toevoeging van DPI om de populatie levende cellen uit de totale celpopulatie te bepalen en te gaten.Analyse elke enkelvoudige kleurcontrole om parameters zoals compensatie te bepalen en te kalibreren. Analyseer het gekleurde monster om de positie van de gates voor sortering te definiëren. Zodra de parameters en gates voor de gewenste celpopulaties zijn ingesteld, begint u met het sorteren van de gelabelde celpopulaties in eph-buisjes of 15 milliliter conische buisjes die cultuurmedium of RNA-lysebuffer bevatten.Spin de cellen direct na voltooiing van de sortering naar beneden en breng ze over naar vers medium of RNA-lysisbuffer. Afhankelijk van het doel van uw experiment: als de gesorteerde fibroblasten gekweekt moeten worden, moeten deze altijd op collageen-gecoate platen worden geplaatst en nooit direct op plastic, aangezien dit zal leiden tot activering van de fibroblasten en daarmee tot veranderingen in hun genexpressie. Het gebruik van PDGF-receptor alfa als marker voor fibroblasten resulteert in de isolatie van sterk verrijkte populaties weefsel-fibroblasten.In dit voorbeeld werden enkelcel-suspensies van muisborstklieren gekleurd met PDGF-receptor alfa- en F4/80-antilichamen. De FACS-sorteerplot wordt weergegeven in het linkerpaneel, waarbij P2 de poort voor fibroblasten is en P4 de poort voor macrofagen. Er werd een post-sorteeranalyse uitgevoerd om de zuiverheid van de gesorteerde fibroblasten (getoond in het rechterpaneel) en macrofagen (getoond in het middelste paneel) te bepalen.De volgende figuur toont een analyse van de zuiverheid van de bron via Q-R-T-P-C-R van cel-specifieke controlegenen voor fibroblasten, immuuncellen en epitheelcellen. De resultaten werden genormaliseerd naar twee housekeeping-genen, ga, DH en mgus, en de relatieve expressie ten opzichte van gap. DH wordt getoond; dergelijke analyses vertonen doorgaans 0,1 tot 0,6% contaminatie.Dit zuiverheidsniveau maakt transcriptoomprofilering van hoge kwaliteit van geïsoleerde fibroblasten mogelijk. Kwantificering van de expressie van PDGF-receptor alfa in een ongesorteerde populatie borstfibroblasten geeft aan dat ongeveer 85% van de totale weefselfibroblasten in de melkklieren PDGF-receptor alfa-positief zijn. Ik heb geïsoleerd.Fibroblasten kunnen direct na sortering worden gekweekt, maar hebben mogelijk enkele dagen nodig om te herstellen. Het is essentieel om alle verdere experimenten uit te voeren met cellen met een laag passagenummer, aangezien primaire fibroblasten senescentie ondergaan tijdens propagatie. In cultuur kan deze techniek, eenmaal beheerst, in vier uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Als de geselecteerde cellen gekweekt gaan worden, is het van groot belang om de gehele procedure onder steriele omstandigheden uit te voeren. In deze opname hebben we geen steriele sortering uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een sterk verrijkte populatie fibroblasten uit vers weefsel kunt isoleren.

isolation-normal-cancer-associated-fibroblasts-from-fresh-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire fibroblast/myofibroblast (MF) culturen te isoleren en te vestigen uit bevroren maag-, dunne darm- en colonweefsel, waardoor cellen met een MF-fenotype worden verkregen. Deze cellen expresseren CD90, α-SMA en vimentin. MF's kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan functionele assays, inclusief enzymatische activiteit en cytokineproductie.

Isolatie van CD 90+ Fibroblast / Myofibroblasten van Human Frozen Maag Monsters

Dit manuscript beschrijft een FACS-gebaseerd protocol voor isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid. Het omzeilt in vitro cultuur die onvermijdelijk was met de algemeen gebruikte isolatie protocol via explant culturen. De afkomstige fibroblast subsets zijn functioneel onderscheiden en display differentieel genexpressie en lokalisatie binnen de dermis.

Isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid door fluorescentie-geactiveerde cel het sorteren

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Dit artikel heeft tot doel een protocol te bieden voor de isolatie en kweek van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van triple-negatieve borstkanker en hun toepassing voor de preklinische studie van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om zich te richten op de tumormicro-omgeving.

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

De precieze identificatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en spierstamcellen (MuSC's) is van cruciaal belang voor het bestuderen van hun biologische functie in fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol biedt richtlijnen voor de isolatie, zuivering en cultuur van FAPs en MuSC's van volwassen muisspieren.

FACS-isolatie en kweek van fibro-adipogene voorlopers en spierstamcellen van onverstoorbare en gewonde muizenskeletspieren

Meercellige 3D-tumorsferoïden werden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten, gevolgd door de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) uit deze sferoïden. Geïsoleerde CAFs werden vergeleken met normale fibroblasten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen door het mitochondriale transmembraanpotentieel, reactieve zuurstofsoorten en enzymatische activiteiten te bestuderen.

Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

Dit protocol biedt een uitgebreide procedure om fibroblasten te isoleren, uit te breiden en onsterfelijk te maken van radicale prostatectomieën. Bovendien beschrijft het tests die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van overspraak tussen fibroblast en tumorcellen te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel behandeling met geconditioneerd medium als co-kweek.

Isolatie, kweek en karakterisering van prostaatkanker-geassocieerde fibroblasten

Leer FACS-isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten uit verse weefsels met PDGFRα-markering. Deze methode minimaliseert contaminatie door immuun- en epitheelcellen en behoudt genexpressieprofielen.

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Meer video's verkennen