Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling
26 januari 2013
Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.
De methode die in deze video wordt getoond, maakt gebruik van lotkaarten van het klievingsstadium van het opus-embryo om de cultuur van een enkele blastomeer te identificeren in isolatie om te beoordelen of embryonaal sulfaat wordt bepaald door intrinsieke of extrinsieke instructies. Eerst worden tweecellig embryo's verzameld waarin de eerste klievingsgroef het licht gepigmenteerde gebied van de dierlijke hemisfeer doorkruist. Deze embryo's worden gekweekt totdat de embryo's 16 tot 32 cellen bereiken, waarna het vitel-membraan wordt verwijderd en de buurcellen worden weggesneden van de gekozen cel. Voor explant, wordt de weggesneden blastomeer vervolgens overgebracht naar een kuiltje in een auger-gecoate cultuurput en gekweekt.
Zodra de explant het gewenste stadium bereikt, wordt deze geoogst om gen- of eiwitexpressie te beoordelen met behulp van in situ hybridisatie QPCR of immunohistochemie. Het grote voordeel van deze techniek boven andere, zoals het kweken van grote groepen embryonale cellen of organen op login, is dat enkele embryonale blastomeren waarvan het ontwikkelingslot bekend is uit lijntraceringsstudies, kunnen worden gekweekt zonder toegevoegde groeifactoren of de aanwezigheid van naburige cellen. Zo kan men direct testen of factoren intrinsiek aan de cel de instructie geven dat de blastomeer de voorloper wordt van een specifiek weefsel of dat het signalen vereist van omringende cellen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de dissectie van Blairs en hun overdracht naar kweekputjes delicate manipulaties onder de stereomicroscoop vereist. In deze video zal ik deze methode gebruiken om aan te tonen of moederlijk afgeleid mRNA's cellen biasen naar een neurale bestemming. Werkend onder een dissectiemicroscoop. Slijp vier sets van pincetten met behulp van Illumina schuurfilm.
Een paar pincetten dient als reserve in geval een punt beschadigd raakt tijdens de procedure. Steriliseer alle vier de pincetten in een autoclaaf en bewaar ze in een steriele container. Maak 500 milliliter van elk 0,1 x en 1,0 x van gemodificeerd Barth-zoutrootje of MBS en filter steriliseer ze. Bewaar deze oplossingen gedurende maanden op 14 tot 18 graden Celsius in een glazen fles met schroefdop, bereid 2% elektroforesekwaliteit aros in 100 milliliter van een X-kweekmedium. Autoclaveer om de aros op te lossen, magnetron om de aros te vloeibaar maken wanneer deze de volgende keer nodig is, terwijl de aros vloeibaar is.
Plaats ongeveer 0,5 milliliter op de bodem van elke put van een steriele 24-puts kweekplaat. Dit voorkomt dat de implantaten aan het plastic plakken. Giet vervolgens ongeveer twee tot drie milliliter op de bodem van twee tot 360 millimeter petrischalen en slinger voorzichtig om te verdelen.
Deze zullen dienen als dissectieplaten en de aros voorkomt dat embryo's aan het plastic plakken. Zodra hun membranen zijn verwijderd, wanneer de aros is afgekoeld en verhard, vlam de punt van een zesduimse pastoerpipet tot het smelt tot een bal. Hervorm de bal kort, en raak hem dan licht aan op het oppervlak van de aros in een put van de kweekplaat.
Dit zal een ondiepe kuil creëren waarin de X-explant wordt geplaatst. Herhaal dit voor elke put in de plaat. Vul vervolgens elke put van de kweekplaat met één milliliter van een x steriele kweekmedium.
Vul vervolgens de dissectieplaat met 0,1 XMBS om de blastomeerscheiding te vergemakkelijken. Zodra de dissectieplaten zijn voorbereid, breng gefertiliseerde eieren over met de verwijderde geleedschalen naar 100 millimeter petrischalen met 0,5 x kweekmedium. Diegene die niet onmiddellijk worden gebruikt, kunnen worden gekweekt bij 14 graden Celsius terwijl de eerste schaal wordt onderzocht op tweecellig embryo's.
Onderzoek de embryo's in de eerste schaal met behulp van een dissectiemicroscoop. Gebruik een plastic transferpipet om ongeveer 101 cel- en tweecellig embryo's over te brengen naar een aparte schaal gevuld met 0,5 x kweekmedium. Plaats de petrischaal in een incubator van 14 graden Celsius. Het vermogen van deze test om nauwkeurig het ontwikkelingspotentieel van een cel te beoordelen, is afhankelijk van het dissecteren van de juiste blastomeer op basis van lotkaarten.
Daarom is het van cruciaal belang om embryo's te kiezen met het juiste pigmenteringspatroon in het tweecellig stadium die bijgevolg voldoen aan regelmatige klievingspatronen. Zoals hier geïllustreerd. Regelmatige klievingen komen vaak alleen aan één kant van het embryo voor.
Deze embryo's kunnen nog steeds worden gebruikt als donoren als de donorcel afkomstig is van de normale kant. Wanneer embryo's het tweecellig stadium bereiken, sorteer die waarbij de eerste klievingsgroef het licht gepigmenteerde gebied in de dierlijke hemisfeer doorkruist in een aparte schaal, sorteer ongeveer vijf keer zoveel embryo's als er zullen worden gedissected. Deze zullen de donoren zijn voor de explant.
Houd de resterende tweecellig embryo's in een aparte schaal naast de donorembryo's gedurende de procedure om te dienen als broer- en zuscontroles om de explant te bepalen. Nadat de embryo's zijn gesorteerd en gedissected, keer terug naar de schalen in de incubator om meer eencellig en tweecellig embryo's te vinden. Aangezien het ongeveer 90 minuten duurt voordat eencellig embryo's zich delen, kan dit tot twee uur na de eierverzameling worden gedaan.
Om de explant voor te bereiden, plaats vijf tot tien embryo's in een dissectieschaal. Plaats vervolgens het eerste embryo zodat het transparante vitel-membraan kan worden vastgegrepen met pincetten. Het kan meestal niet worden gezien, maar kan worden vastgegrepen op de dierlijke pool waar het wordt gescheiden door een heldere ruimte boven het oppervlak van het embryo.
Gebruik een geslepen pincet in de ene hand, grijpt op een afstand van de blastomeer die moet worden gedissected om deze niet te beschadigen. Grijp vervolgens met geslepen pincetten
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de invloed van geërfde moleculen en cel-cel interacties op het lot van embryonale cellen in het splitsingsstadium van het Xenopus-embryo. Door gebruik te maken van lotkaarten kunnen onderzoekers enkele blastomeren in isolatie cultiveren om de bijdragen van intrinsieke versus extrinsieke factoren te onderscheiden.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
- Embryologie
Achtergrond
- Het lot van embryonale cellen kan worden beïnvloed door zowel geërfde moleculen als signalen van naburige cellen.
- Het begrijpen van deze invloeden is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- Xenopus-embryo's dienen als model voor het bestuderen van vroege ontwikkelingsprocessen.
- Lotkaarten geven een visuele weergave van cellijn en lotbepaling.
Doel van het onderzoek
- Om te beoordelen of het lot van embryonale cellen wordt bepaald door intrinsieke factoren of extrinsieke signalen.
- Om enkele blastomeren in isolatie te cultiveren voor gedetailleerde analyse.
- Om lijnagesturingsstudies te gebruiken om ontwikkelingsresultaten te identificeren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van Xenopus-embryo's in het twee-celstadium.
- Dissectie van naburige cellen van geselecteerde blastomeren.
- Cultivering van geïsoleerde blastomeren in een gecontroleerde omgeving.
- Beoordeling van gen- of eiwitexpressie met behulp van technieken zoals in situ hybridisatie en QPCR.
Belangrijkste resultaten
- Enkele blastomeren kunnen worden gekweekt zonder de invloed van naburige cellen.
- De studie geeft inzichten in intrinsieke versus extrinsieke factoren bij celfate-bepaling.
- Gen- en eiwitexpressie-analyses onthullen het ontwikkelingspotentieel van geïsoleerde cellen.
Conclusies
- Intrinsieke factoren binnen embryonale cellen spelen een belangrijke rol in hun ontwikkelingsfate.
- Extrinsieke signalen van naburige cellen zijn ook belangrijk, maar kunnen geïsoleerd worden bestudeerd.
- Deze methode staat een duidelijker begrip van celfate-bepalingsmechanismen toe.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct testing of intrinsic versus extrinsic factors in cell fate determination, providing mechanistic de-risking for target validation in developmental pathways. By isolating single blastomeres with known lineage, it supports predictive confidence in early discovery by clarifying whether cellular responses are cell-autonomous or dependent on microenvironmental cues. This approach aids in distinguishing true target engagement from indirect effects, improving go/no-go decisions in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by testing whether a cell’s fate is fixed or influenced by extrinsic signals, informing target autonomy.
- Operational Value: Uses fate maps to identify and isolate single precursors with known developmental potential, enabling precise experimental design.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening readiness by establishing baseline autonomous behavior in a controlled, neighbor-free system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-cell resolution readouts (e.g., SOX2 expression via in situ hybridization or qPCR) for pathway-specific reporter assays.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible culture of isolated blastomeres in defined media without exogenous factors, reducing variability.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats, allowing parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early fate commitment mechanisms to later tissue formation, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes require cell-cell communication, helping de-risk targets dependent on niche signaling.
- Predictive Confidence: Distinguishes cell-autonomous drivers from non-autonomous effects, improving target selection for modulation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for pathways where cellular context influences phenotype expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables to determine if a target’s effect is intrinsic or requires intercellular signaling.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs (e.g., marker gene expression) suitable for high-content or multiplexed assay formats.
- Analytics: Enables statistical comparison of fate outcomes across conditions, supporting replication and cross-functional data interpretation.
- Translational Research: Connects early embryonic decisions to later developmental stages, aiding in disease-relevant system modeling when lineage conservation exists.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing genetic or pharmacological perturbations in a defined, isolated cellular context.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating intrinsic cellular properties from extrinsic microenvironmental influences.
- Operational Value: Promotes standardization through defined dissection, culture, and readout procedures, enhancing reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose efficacy depends on cell-autonomous function.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by clarifying whether a target’s modulation requires combination with microenvironment-modulating agents.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and fluorescence- or marker-guided cell identification using fate maps.
- Dependent on sterile culture infrastructure, including controlled-temperature incubators and precision pipetting tools for blastomere transfer.
- Necessitates standardization of culture conditions (e.g., MBS concentration, temperature) to ensure comparability across experiments.
- Must account for variability in embryo quality and cleavage symmetry when selecting donor cells for isolation.
- Limited to species with well-established fate maps and ex utero culture feasibility (e.g., Xenopus), restricting direct translation to mammalian systems without adaptation.
