Name: Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Leer blastomeer explantaten voor cel fate commitment tijdens embryonale ontwikkeling met Xenopus. Deze methode onthult intrinsieke versus extrinsieke factoren in ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de GWU Harlan Fellowship erkennen voor de ondersteuning van Paaqua Grant en de GWU Luther Rice Fellowship voor ondersteuning van Mona Herold. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation subsidie ​​MCB-1121711.

1. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Media en Gerechten <ol><li> Verscherpen vier tang met behulp van Alumina schurende film. Doe dit onder een dissectiemicroscoop aan het uiteinde formaat te controleren. Een pincet dient als back-up bij een tip wordt beschadigd tijdens de procedure. Autoclave vier forceps en bewaar in een steriele container. </li><li> Maak 500 ml elk van 0,1 x en 1,0 x kweekmedium (ofwel Marc&#39;s gemodificeerd Ringers [MMR] of zoutoplossing Gewijzigd Barth&#39;s [MBS]; recepten in 15) en filter steriliseren. We routinematig gebruik MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO3). Bewaren bij 14-18 ° C gedurende maanden. </li><li> Een 2% agarose oplossing in kweekmedium (2 g agarose elektroforese gehalte in 100 ml 1X kweekmedium in een schroefdop glazen fles). Autoclaaf agarose op te lossen. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maanden en magnetron de agarose vloeibaar wanneer het volgende nodig. </li><li> Terwijl de agarose vloeibaar, giet ongeveer 0,5 ml op de bodem van elk putje van een steriele 24-putjes kweekplaat. Dit voorkomt dat de explantaten kleven aan het plastic. </li><li> Terwijl de agarose is vloeibaar, giet ongeveer 2-3 ml op de bodem van twee tot drie 60 mm petrischalen, en schud zachtjes te zorgen dat de bodem bedekt is. Deze zullen als dissectie gerechten en de agarose voorkomt embryo kleven aan het plastic als hun membranen worden verwijderd. </li><li> Wanneer de agarose afgekoeld en gehard, vlam het uiteinde van een 6 &quot;Pasteur pipet tot het smelt tot een bal, en licht aanraken van het oppervlak van de agarose in elk putje van de kweekplaat. Hierdoor ontstaat een ondiepe depressie waarin het explantaat wordt geplaatst. </li><li> Vul elk putje van de cultuur plaat met 1X steriel kweekmedium. </li><li> Wanneer de agarose is afgekoeld en verhard, vul de dissectie schotel met verdunde kweekmedium (0,1 x 0,1 x MMR of MBS) naar blastomeer scheiding te vergemakkelijken. </li&gt; </ol> 2. Selectie van embryo <ol><li> Verkrijgen bevruchte eieren en verwijder de gelei lagen volgens standaardprotocollen 15. Overbrengen naar 0.5X kweekmedium in een 100 mm petrischaal. </li><li> Als embryo&#39;s de 2-cel stadium bereiken, sorteren die waarin de eerste splitsing doorkruisen het licht gepigmenteerde gebied in het dier halfrond (figuur 1) snijdt in een aparte schaal. Dit zullen de donoren voor de explantaten. Het resterende 2-cellige embryo&#39;s in een apart schaaltje naast de donor embryo gedurende de procedure om te dienen als controles om de sibling explantaten fase. </li></ol> 3. Bereiding van explantaten <ol><li> Plaats 5 tot 10 embryo&#39;s in een dissectie schotel, maar alleen op een embryo te werken op een moment. </li><li> Plaats de eerste embryo zodat het doorzichtige vitelline membraan kan worden gezien, is gescheiden door een ruimte (perivitelline space) boven het oppervlak van de animale pool van de embryo. Met een geslepen forceps in je subdominant hand (linkerhand als men recht wordt overhandigd), pakt de vitelline membraan boven de perivitelline ruimte. Met een geslepen forceps in de andere hand het membraan als de eerste forceps tip en voorzichtig in tegengestelde richtingen trekken te pellen het membraan weg. Het begin-greep op een afstand van de cel die wordt ontleed, waardoor de doelcel niet beschadigd tijdens het verwijderen van het membraan. Men kan zeggen dat het membraan is verwijderd omdat het embryo zal afvlakken. </li><li> Pak een naburige cel met de tang in de subdominant hand en gebruik deze cel als een &quot;handvat&quot;, zodat de cel te worden ontleed wordt niet direct geraakt. Met een pincet in de andere hand voorzichtig trek de resterende aangrenzende cellen van de gewenste blastomeer. Als middellijn cellen, die hetzelfde lot delen, gericht, kunnen ze worden verwijderd samen als een paar. Tot slot, ontleden weg het &quot;handvat&quot; cel. </li><li> Ophalen blastomeer (of blastomeer pair), met een steriele, Glas Pasteur pipet, het vermijden van luchtbellen en overmatige afzuiging. De pipet kan brand-gepolijst om scherpe randen die de cel kunnen beschadigen te verwijderen, maar we weten niet routinematig doen. Plaats de punt van de pipet Pasteur onder het oppervlak van het kweekmedium in een putje van het explantaat kweekschaal en voorzichtig verdrijven de blastomeren. Het moet schuiven in de ondiepe depressie door de zwaartekracht. Dezelfde blastomeer van meerdere embryo kunnen worden gecombineerd tot een explantaat. </li><li> Herhaal deze procedure met de overige embryo&#39;s in de dissectie schotel, een voor een. Na ongeveer 10 embryo wordt de dissectie schaal gevuld met celresten. Wanneer dit gebeurt, te wijzigen in een nieuwe dissectie schotel. </li><li> Nadat alle dissecties worden gedaan, na te gaan of de explantaten zijn in de ondiepe depressies. Zo niet, kunnen ze voorzichtig worden geduwd in de depressie met een haar lus die is gesteriliseerd in 70% ethanol en luchtgedroogd. </li><li> Ongeveer een uur na de laatste dissectie, verwijder vuil surrounding de genezen explantaten met een steriele glazen Pasteur pipet. </li><li> Cultuur de plaat van explantaten bij 14-20 ° C naast de petrischaal die de sibling, controle-embryo&#39;s. Sibling embryo&#39;s geeft de fase van ontwikkeling van de blastomeer explantaten. </li></ol> 4. Oogsten Explantaten voor Analyse <ol><li> Oogst de explantaten als de broers en zussen het gewenste ontwikkelingsstadium. Deze explantaten overleven heel goed, zelfs als een deel van de cellen uit elkaar vallen. Daarom kan een bewolkte massa in de cultuur goed ontdekken die een haar loop of forceps te bepalen of een gezond explantaat begraven binnen. </li><li> Ophalen explantaten in een klein volume van cultuur met glazen Pasteur pipet en voorzichtig te drijven in een fixeermiddel of lysis buffer geschikt voor de assay worden uitgevoerd. </li></ol>

<ol><li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li>
<li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li>
<li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li>
<li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+SA+%22Cell+Fate+and+Lineage+Determination%22">Cell Fate and Lineage Determination</a>. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).</li>
<li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li>
<li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li>
<li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li>
<li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li>
<li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((foxD5a%2C+a+Xenopus+winged+helix+gene%2C+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li>
<li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li>
<li>Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs%3A+an+early+step+in+embryonic+axis+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li>
<li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+A%3A+Solutions+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li>
<li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li>
<li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De belangrijkste stappen voor een succesvolle kweken van afzonderlijke blastomeren zijn: 1) het identificeren van de juiste plaats blastomeer, 2) het behoud van een steriele, gezonde cultuur 3) ontleden cellen op het juiste deel van de celcyclus en 4) de noodzakelijke handmatige behendigheid om beschadiging tijdens dissectie en goed te dragen aan de cultuur. Te manipuleren specifieke blastomeren is essentieel om de assen kardinaal identificeren. In Xenopus embryo kan de rugzijde wor...

Xenopus laevis embryo&#39;s zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen die embryonale cellen krijgen hun specifieke lot omdat hun eieren groot genoeg om microchirurgische benaderingen mogelijk identificeren. Bovendien ontwikkelen ze buiten zonder voedingssupplementen van het kweekmedium omdat elke cel een rijke intracellulaire levering van dooier bloedplaatjes die een intrinsieke energie store. Een belangrijk voordeel voor het bestuderen van de mechanismen waarmee lot van de cel wordt bepaald is een uitgebreide reeks lot kaarten van de splitsing fase blastomeren (van 2 - tot 32-cell fasen) 1, 2, 3, 4, 5, 6. De kaarten werden geconstrueerd door microinjecting een detecteerbaar molecuul in een, identificeerbaar blastomeer en controle later in ontwikkeling die weefsels worden bevolkt door de gemerkte nageslacht. Consistent lot kaarten zijn mogelijk omdat de kardinaal assen van de embryo betrouwbaar kan worden geïdentificeerd in vele Embryos. Ten eerste, in alle wild-type embryo&#39;s het dier halfrond is gepigmenteerd, terwijl de plantaardige halfrond is het niet. Anderzijds de ingang van het sperma bij bevruchting vindt een contractie van het dier halfrond pigmentatie naar de toekomst buikzijde, in veel embryo&#39;s een pigmentatie verschil kan daarom gebruikt worden om onderscheid te maken tussen dorsale en ventrale kanten. Derde, de eerste splitsplek vore benadert het sagittale middenvlak in de meeste embryo&#39;s, en kan dus worden gebruikt om de rechter-en linkerzijde van de embryo identificeren. Het lot kaarten zijn ook afhankelijk van het feit, dat op natuurlijke wijze bevruchte eieren vaak aankleven in regelmatige patronen die elke blastomeer identificeerbare over een grote populatie van embryo&#39;s. Hoewel er variabiliteit binnen en tussen legsels van eieren ten aanzien van pigmentatie en decollete patronen, met behulp van selectieprocedures die hierin worden beschreven kunnen cellen met voorgeschreven lot te worden geïdentificeerd met ongeveer 90% nauwkeurigheid. Celtypes kunnen afschrikkenbepaald tijdens embryogenese door verschillende mechanismen. Intrinsieke factoren, zoals erfelijke differentieel cytoplasmatische mRNA of eiwitten, bijdragen tot verschillende aspecten van vroege patronen. Bijvoorbeeld specifieke maternale mRNA bepalen welke cellen bijdragen aan de kiemlijn, worden de endoderm, of bijdragen aan de dorsale lichaamsas (beoordeeld in 7). Extrinsieke factoren lokaal door naburige cellen of verder af van een embryonale signalering centrum verantwoordelijk voor het induceren van specifieke weefselsoorten en patroonvorming vrijwel elk orgaansysteem. Voorbeelden van signalering centra zijn ook de organisator / node in de gastrula dat de neurale ectoderm en patronen het mesoderm induceert, en de zone van polariserende activiteit die patronen van de anterior-posterior as van de ledematen. Hoewel lot maps identificeren voorlopers van de verschillende organen en onthullen de ontwikkeling weg die hun nakomelingen in normale embryo, kunnen ze geen onderscheid tussen intrinsiekeen extrinsieke invloeden op deze cellen. Ook blijkt dat er geen volledige ontwikkeling van een cel, die nakomelingen differentiëren in het complex signaleren omgeving van de embryo. Twee experimentele benaderingen kunnen testen of een cel lot bepaald door intrinsieke factoren of daarna beïnvloed door externe factoren: 1) transplantatie van de cel naar een nieuwe locatie in het embryo, of 2) verwijderen van de cellen van de embryo, gevolgd door kweek in afwezigheid van exogeen signalen. Beide experimentele benaderingen zijn mogelijk in Xenopus omdat de cellen groot genoeg om handmatig gescheiden. Zo hebben vele studies verwijderd enkele cellen van embryo&#39;s (tot cel-cel interacties veranderen) of getransplanteerde cellen op nieuwe plaatsen in ontvangende embryo&#39;s testen lot veranderingen (beoordeeld in 7, 8, 9). Bovendien de tweede benadering van explanteren kleine aantallen cellen van verschillende gebieden van de embryo into cultuur inductieve weefsel interacties in de afwezigheid van exogene factoren verduidelijken is mogelijk omdat de cellen van het Xenopus embryo zijn gevuld met een intracellulaire voedingsstof store, de dooier bloedplaatjes. Daarom kunnen ze worden gekweekt een paar dagen in een gedefinieerd medium zonder zout nutritioneel of groeifactor aanvulling van het kweekmedium. Wij hebben deze benadering te laten zien dat dorsale dier blastomeren een autonome vermogen om neurale en dorsale mesodermale weefsels door maternaal overgeërfd mRNAs 10, 11 produceren en anderen aangetoond dat mesoderm specificatie van 32-cell blastomeren gebeurt zowel intrinsieke als extrinsieke informatie 12 . Een voordeel van het kweken van cellen als explantaten is dat het medium ook kan worden aangevuld met gedefinieerde signaalfactoren te bepalen welke cel-tot-cel communicatie pathway kan het lot van de geëxplanteerde cel 12, 13, 14 beïnvloeden. Daarnaast kan men injecteren de blastomeer prior om cultuur mRNA tot overexpressie een gen, of anti-sense oligonucleotiden de vertaling van endogene mRNA&#39;s te voorkomen. Deze, winst-en verlies-van-functie analyses kunnen bepalen welke moleculen nodig zijn voor een autonoom uitgedrukt lot. Het lot van het explantaat te analyseren, kan de identificatie van specifieke celtypen worden uitgevoerd door standaard genexpressie (bijvoorbeeld in situ hybridisatie, RT-PCR) en immunocytochemische assays. Dit protocol biedt een eenvoudige, maar krachtige, manier om onderscheid te maken tussen intrinsieke en extrinsieke mechanismen die regelen hoe een embryonale cel zich ontwikkelt tot specifieke weefsels.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Alumina schurende film </td><td> Thomas Wetenschappelijke </td><td> # 6775E-38 </td><td> Cursus (12 micrometer), voor groot onderhoud van een tang tips </td></tr><tr><td> Alumina schurende film </td><td> Thomas Wetenschappelijke </td><td> # 6775E-46 </td><td> Medium (3 pm) voor fijn slijpen van forceps tips </td></tr><tr><td> Alumina schurende film </td><td> Thomas Wetenschappelijke </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fine (0,3 micrometer), voor het polijsten van de verlostang tips </td></tr><tr><td> Pincet: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> # 11.252-30 </td><td> Deze hebben de fijne tips die het niet nodig worden geslepen, wanneer het eerst kocht. Corrosiebestendige, zodat ze kunnengeautoclaveerd worden. </td></tr><tr><td> Gentamicine oplossing </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Toevoegen aan medium op dezelfde dag als het gebruik </td></tr></tbody></table>

blastomeer explantaten om te testen voor mobiele fate commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate kaarten opgebouwd uit stam tracering alle cellen van een embryo, blijkt dat weefsels afstammen van elke cel van de embryo. Hoewel lot kaarten zijn zeer nuttig voor het identificeren van de voorlopers van een orgaan en voor het ophelderen van de ontwikkelingstraject waarbij de afstammeling cellen die organen bevolken de normale embryo, ze illustreren de volledige ontwikkelingspotentieel van een precursor cel of identificeren mechanismen waarmee het lot bepaald. Om te testen voor lot van de cel inzet, men vergelijkt een cel normale repertoire van nakomelingen in het intacte embryo (het lot kaart) met die uitgedrukt na een experimentele manipulatie. Is de cel het lot bepaald (vastgelegd), ongeacht de omringende cellulaire omgeving, of is het beïnvloed door externe factoren die door zijn buren? Met behulp van de uitgebreide lot kaarten van de Xenopus embryo beschrijven we hoe te identificeren, isoleren en cultuur een decollete stadium precursoren, genoemd blastovennen. Deze benadering maakt het mogelijk om te beoordelen of deze eerste cellen zijn toegewijd aan het lot zij in hun normale omgeving verwerven in het intacte embryo vereisen interacties met naburige cellen, of kan worden beïnvloed alternatieve lot drukken bij blootstelling aan andere soorten signalen.

Het vermogen van deze assay goed te beoordelen ontwikkeling van de cel berust op de juiste ontleden blastomeer gebaseerd op het lot kaarten 1, 2, 3, 4, 5, 6. Daarom is het essentieel om embryo&#39;s te kiezen met de juiste pigmentatie patroon op de 2-cel stadium, zoals geïllustreerd in figuur 1, die vervolgens overeenstemming regelmatig splitsingspatronen, zoals geïllustreerd in figuur 2. Als men neemt de gesorteerd embryo&#39;s bij het bereiken van de vereiste decollete podi...

Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Bestemmingskaarten, opgesteld door middel van lineage tracing van alle cellen van een embryo, onthullen uit welke cellen van het embryo welke weefsels voortkomen. Hoewel bestemmingskaarten ...

De in deze video getoonde methode maakt gebruik van lotkaarten van het embryo in het delingsstadium om individuele blastomeren geïsoleerd te kweken, om vast te stellen of het embryonale lot wordt bepaald door intrinsieke of extrinsieke instructies. Eerst worden twee-cel-embryo's verzameld waarbij de eerste delingsgroefHet lichtgepigmenteerde gebied van de animale hemisfeer doorsnijdt. Deze embryo's worden gekweekt; wanneer de embryo's 16 tot 32 cellen bereiken, wordt het vitellijnvlies verwijderd en worden naburige cellen weggesneden van de gekozen cel. Voor transplantatie wordt de gedissecteerde blastomeer vervolgens overgebracht naar een inkeping in een agaro-gecoate kweekput en gekweekt.Zodra het explantaat het gewenste stadium heeft bereikt, wordt het geoogst om de gen- of eiwitexpressie te beoordelenen met behulp van in situ hybridisatie, qPCR of immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals het kweken van grote groepen embryonale cellen of organoïden, is dat individuele embryonale cellen waarvan het ontwikkelingslot bekend is uit lineage tracing-studies, gekweekt kunnen worden zonder toegevoegde groeifactoren of de aan

blastomere-explants-to-test-for-cell-fate-commitment-during-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een stap-voor-stap handleiding voor gerichte chimerisch zebravis embryo's genereren door transplantatie op de blastula of gastrulastadium.

Het genereren van Chimère zebravis embryo&#39;s door transplantatie

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

We demonstreren een methode voor het enten van gekweekte cellen in specifieke delen van vroege muis-embryo's om hun in vivo potentieel te bepalen. We introduceren ook een geoptimaliseerde elektroporatiemethode die glazen capillairen van bekende diameter gebruikt, waardoor de nauwkeurige levering van exogeen DNA in een paar cellen in de embryo's mogelijk wordt.

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Zebravis blastoderm explantaten worden gegenereerd door embryonale cellen te isoleren van endogene signaleringscentra in het vroege embryo, waardoor relatief naïeve celclusters worden geproduceerd die gemakkelijk ex vivokunnen worden gemanipuleerd en gekweekt. Dit artikel geeft instructies voor het maken van dergelijke explants en toont hun nut aan door rollen te onderzoeken voor nodale signalering tijdens gastrulatie.

Generatie van naïeve Blastoderm Explants uit Zebravis Embryo's

De geweekte kraaltest omvat gerichte toediening van testreagens op elk ontwikkelingstijdpunt om de regulatie van celdifferentiatie en morfogenese te bestuderen. Een gedetailleerd protocol, toepasbaar op elk proefdiermodel, voor het bereiden van drie verschillende soorten geweekte kralen en het implanteren hiervan in de interdigit van een kippenembryo wordt gepresenteerd.

Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay

Ole Isacson geeft een beknopt overzicht van de ziekte van Parkinson, de oorzaken ervan, therapeutische strategieën, en de vorderingen in het onderzoek van Parkinson.

Ole Isacson: ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de ziekte van Parkinson

Dit protocol laat zien hoe het behoud van gezonde, ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen.

Cultuur en onderhoud van menselijke embryonale stamcellen

Leer blastomeer explantaten voor cel fate commitment tijdens embryonale ontwikkeling met Xenopus. Deze methode onthult intrinsieke versus extrinsieke factoren in ontwikkelingsbiologie.

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Meer video's verkennen