Name: Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer de retinale snijpreparatie van Ambystoma tigrinum voor gelijktijdige whole-cell opnames van fotoreceptoren en tweede-orde neuronen. Deze methode behoudt intacte synaptische contacten voor elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Research voor Blindheid en de National Institutes of Health subsidie ​​EY10542 voorkomen.

1. Netvlies Slices Voorbereiding <ol><li> Monteer de kamer (ontwerp in figuur 1). Plaats twee kralen van vacuüm vet, spaced ~ 8-10 mm uit elkaar, over de opname kamer om een ​​kanaal voor superfusate vormen en waarin aan de retinale plakjes insluiten. Voeg een tweede kraal van vet een paar millimeter verder uit dan elk van deze twee parels van vet op te treden als een dijk en limiet spillover. Plaats een klein driehoekig KimWipe aan het uiteinde van de kamer om vloeistof contact met de referentie-elektrode te waarborgen. </li><li> Druk een stukje nitrocellulose membraan (~ 5 x 10 mm; 0,8 micrometer poriën) plat tegen het glas microscoop dia in twee kleine kralen van vacuüm vet. Voorkomen dat vet direct onder het midden van het nitrocellulosemembraan, omdat dit kan voorkomen dat de retina kleeft. </li><li> Om het weefsel snijmachine te bereiden, breek een dubbele rand scheermesje in 4 stukken en voeg een tot het snijden arm. Snijd een dun plakje van nitrocellulose membraan dat de snijrand van het scheermesje vlak ligt tegen de opname kamer en dus maait door het nitrocellulosemembraan. </li><li> Houd een kleine beker van amfibieën zoutoplossing (tabel 1) op ijs bij de dissectie station. </li><li> Euthanaseren salamander door onthoofding. Hemisect het hoofd saggitaal en merg via het ruggenmerg. Doe de helft van het hoofd op een stuk katoen bevochtigd met amfibie zoutoplossing boven op een linoleum blok. De andere helft van het hoofd kan worden omwikkeld met een vochtige papieren handdoek en bewaard bij 4 ° C voor later op de dag. </li><li> Ophelderen het oog. Met behulp van kleine Vannas een schaar, knip de huid de ogen te sluiten op de omliggende baan. Na lossnijden van de voorkant van het oog van de omliggende orbitale weefsel, trekt het oog naar voren en schuif de schaar onder het oog te snijden door de oogspieren en de oogzenuw, het oog te bevrijden van de baan. </li><li> Plaats de enucleated oog op een bed van katoen op delinoleumblok. Gooi de half hoofd. Knip overtollig orbitale vet van de achterkant van het oog. </li><li> Maak een kleine incisie in het centrum van het hoornvlies met een scherp chirurgisch mes. Verwijder het hoornvlies door te schuiven fijne Vannas schaar in de incisie en verlenging van de snede radiaal uit naar de ora serrata. Knip de omtrek rond de ora serrata door het draaien van de linoleum blok of de katoen tussen bezuinigingen. </li><li> Na het snijden helemaal rond de ogen, verwijder het hoornvlies en de lens door ze uit te trekken van de kant van de oogschelp. Verplaats de resulterende oogschelp op een hard oppervlak van de linoleumblok bevochtigd met amfibie zoutoplossing. Snijd het in tweederde met een scherp scheermesje, met een fijn zagende beweging om ervoor te zorgen dat u helemaal hebben gesneden door de sclera. </li><li> Plaats een of twee stukken oogschelp op nitrocellulose membraan met de retinale naar beneden gericht. Dompel de resterende stukken met extra zout en leg ze in de koelkast bij ca. 4 ° C. </li><li> Gently drukt het stuk oogschelp tegen het nitrocellulose membraan met fijn pincet. Dompel het nitrocellulose membraan en oogschelp stuk met enkele druppels koud amfibie zoutoplossing en vlek aan de randen met KimWipe te helpen het netvlies te houden. Nogmaals, onderdompelen oogschelp en nitrocellulosemembraan met verscheidene druppels koud amfibieën zoutoplossing en afpellen de sclera / vaatvlies / netvliespigmentepithelium de retina isolaat (die roze kan optreden door de aanwezigheid van ongebleekte rhodopsine). Indien nodig, knip de oogzenuw aan het netvlies te bevrijden. </li><li> Als het netvlies heeft niet strak nageleefd, weglopen van de zoutoplossing met een KimWipe aan het netvlies trekken steviger neer op het nitrocellulose membraan. Vervang de zoutoplossing. Herhaal, indien nodig. </li><li> Vult de kamer met koud amfibie zoutoplossing en overbrengen naar het stadium van het weefsel snijmachine. Snijd het netvlies en nitrocellulose membraan in dunne reepjes, het werken van de ene naar de andere door het draaien van de vernier micrometerin stappen van 125 um. Druk op de scheermesje voorzichtig maar stevig door het netvlies en nitrocellulose membraan. </li><li> Overdracht van het netvlies plakken door het bewegen stroken nitrocellulose membraan naar het belangrijkste kanaal van de opname kamer. Til een strook membraan gratis en dan zijn plaats te houden terwijl u de kamer eronder, en zorg ervoor dat de plakjes onder water te houden. Sluit de randen van het nitrocellulosemembraan in de stroken van vacuüm vet, wentelen 90 graden retinale lagen geven. </li><li> Druk op de nitrocellulose membraan plat tegen het glasoppervlak. Zelfs als er geen retina op elk stuk, plaats stroken nitrocellulose membraan regelmatig (~ 1 mm uit elkaar) langs de gehele lengte van de perfusie kanaal te breken de oppervlaktespanning verbeteren fluïdumstroom. </li></ol> 2. Gepaarde Whole-cell Recordings <ol><li> Nadat alle segmenten zijn overgedragen, verplaatst u de opname kamer op het podium van een rechte, vastestadium microscoop en bevestig de referentie-elektrode lood. Focus op de plakjes met behulp van een lange-werkafstand, onderdompeling in water, 40-60X objectief. De microscoop moet op een lucht tafel om trillingen te dempen worden geplaatst en opgesloten in een kooi van Faraday om elektrische interferentie te verminderen. </li><li> Superfuse de plakjes continu met een snelheid van 1 ml / min met amfibie zoutoplossing geborreld 100% O 2. Sluit de zuig-, zorg ervoor dat de in-en uitstroom in balans zijn. Uitstroom kan worden geregeld door rotatie van de afgeschuinde uiteinde van de naald afzuiging en bewegende KimWipe het eind van de kamer dichterbij of verder van de uitstroom naald. Het preparaat kan bij kamertemperatuur worden bewaard of koelen met een Peltier apparaat of om eenvoudigweg een pak ijs op de microscoop podium. </li><li> Onderzoeken schijfjes onder gedimd of infra-rood licht en identificeren van een paar cellen - een photoreceptor (staaf of kegel) en omgeving horizontale of bipolaire cel - tot doelwit voor whole-cell opname. Staven kan worden identified door hun grote cellichamen en prominente staafvormige buitenste segmenten (Figuur 2A). Kegels zijn kleiner dan hengels en hebben kleine taps toelopende buitenste segmenten. Bipolaire cel en horizontale cel SOMA zijn in de buitenste rij van cellichamen in de binnenste nucleaire laag (INL; figuren 2B en 2C). </li><li> Alvorens plakken, gebruik dan een pipet trekker te micropipetten vervaardigen van borosilicaatglas (1,2 mm buitendiameter, 0,95 mm binnendiameter met een glas gloeidraad). Het uiteinde van elke micropipet moet -1-2 micron in diameter. </li><li> Een niet-metalen vulling naald (bijvoorbeeld een vervaardigd van een 1 cc spuit of een microfilter), vul pipetten met het intracellulaire oplossing (tabel 1) en hechten aan de elektrodehouder. </li><li> De microscoop doelstelling enigszins verheffen. Plaats de photoreceptor pipet onder de doelstelling en dan zakken zodat het uiteinde is geplaatst net boven de plakjes. Herhaal dit met thij tweede pipet. </li><li> Pas enige compensatie in de basislijn huidige niveau op de versterker. Controleer de pipet weerstand met een 5-10 mV depolariserende puls. We gebruiken meestal pipetten die variëren 10-15 MQ, het resultaat van de lange tapsheid van de as en lage osmolariteit van de oplossingen amfibieën pipet. Met hogere osmolariteit zoogdieren oplossingen, deze zelfde pipetten vertonen weerstand waarden van ~ 8-12 MQ. Hoewel we hebben gebruikt grotere tip diameters met weerstandswaarden van 3-4 MQ in amfibie oplossingen, zijn de voordelen van een lagere toegang weerstand gecompenseerd door een grotere moeilijkheid in het afdichten op celmembranen en een snellere afbouw van calcium stromingen en andere second messenger -gevoelige reacties. </li><li> Terwijl het toepassen van lichte positieve druk, de positie van de post-synaptische pipet, zodat deze de horizontale of bipolaire cel lichaam. Vervolgens de presynaptische pipet, zodat deze de cel lichaam van een staaf of kegel fotoreceptoren. Opnames Appear stabieler te zijn bij pipetpunten contact binnenste segment dan de soma, vooral kegels. </li><li> Terwijl het toezicht op de weerstand, laat de positieve druk op de post-synaptische pipet. Soms is de publicatie van positieve druk voldoende om een ​​gigaohm afdichting. Zo niet, zachtjes zuig met een 1 ml spuit of via de mond. Na de tip weerstand gegroeid tot&gt; 100 MQ, breng dan een bedrijf potentieel van -60 mV. Na het behalen van een gigaohm zegel, null uit elke pipet capacitieve transiënten en herhaal de afdichting procedure voor de photoreceptor pipet, het aanbrengen van een bedrijf potentieel van -70 mV. </li><li> Rupture de patch met behulp van uw mond of een spuit te zuigen gelden voor elke cel in de beurt. Staafjes, kegels, en bipolaire cellen zullen doorgaans breuk met zachte zuigkracht. Verkrijgen whole-cell configuratie met een horizontale cel grotere zuigkracht (dwz met een 3 cc injectiespuit) in combinatie met sterke lijst spanningspulsen geleverd met &quot;zap&quot; f vereiseneature van de patch-clamp versterker. Breuk van het membraan en vestiging van hele-cel configuratie zal duidelijk zijn door de verschijning van hele-cel capaciteit transiënten. </li><li> Bevestig de identiteit van de postsynaptische cel fysiologisch door een lichtflits en met een reeks stappen spanning van -120 tot +40 mV in stappen van 20 mV (figuren 3 en 4). </li><li> Te beoordelen of het paar cellen synaptisch verbonden, leveren een korte (25-100 msec), 60 mV depolarisatie stap naar de fotoreceptor (tot -10 mV, bij de piek van het L-type voltage-gated calcium stroom) en kijk voor post-synaptische stromen in de tweede orde neuronen (Figuur 5). Een sterke depolariserende stap moet een snelle, voorbijgaande actieve postsynaptische stroom roepen in de postsynaptische horizontale of OFF bipolaire cel door een uitbarsting van blaasjes afgifte uit de conus (figuur 5). </li></ol>

<ol><li>Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B2n+y+Cajal%2C+S+%22The+Structure+of+the+Retina%22">The Structure of the Retina</a>. , Charles C Thomas. Springfield, IL USA. (1972).</li>
<li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+and+the+retina%3A+a+100-year+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li>
<li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li>
<li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li>
<li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li>
<li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM1%3A+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li>
<li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li>
<li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2%2B+imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345(2012).</li>
<li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li>
<li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina%3A+general+principles+and+species-specific+variations%3A+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li>
<li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li>
<li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li>
<li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells%3A+current+vs.+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li>
<li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li>
<li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li>
<li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li>
<li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het netvlies slice voorbereiding is zeer nuttig gebleken voor het analyseren van de circuits en mechanismen in dienst van het netvlies om visuele informatie te verwerken. Het vermogen om hele cellen opnamen gelijktijdig verkrijgen van pre-en post-synaptische neuronen is bijzonder nuttig in dit streven. Gepaarde whole cell opnames zijn veel gemakkelijker te bereiken met plakjes dan met een flatscreen-mount netvlies voorbereidingen omdat de verschillende netvlies lagen worden blootgesteld. Bovendien, vanwege hun grote retinale neuronen, salamanders hebben een lange geschiedenis als een netvlies voorbereiding en dus zorgen voor een bijzonder goed gekarakteriseerd modelsysteem. Met de praktijk, kunnen gezonde sneetjes salamander netvlies regelmatig worden voorbereid. Een paar belangrijke stappen kunnen het verschil tussen succes en mislukking. 1) Zorg ervoor dat het scheermesje wordt op het weefsel snijmachine gemonteerd, zodat het vlak ligt tegen het glasoppervlak en plakken netjes hoewel zowel het weefsel en underlying nitrocellulose membraan. Als u een schone snede hebben gemaakt door het nitrocellulose membraan, moet u een zachte klik hoort als het scheermes het oppervlak van het glasplaatje slaat. 2) Zorg ervoor dat het netvlies heeft gehandeld op grond van het nitrocellulose membraan. Anders kan het netvlies weg te drijven van het membraan tijdens elke stap van de procedure. 3) Gebruik geen gesneden plakjes bloot aan de lucht, omdat dit veel van de oppervlakkige cellen beschadigen. 4) Zorg ervoor dat de plakjes en nitrocellulose membraan liggen plat tegen het glaasje zodat de retinale lagen zijn duidelijk zichtbaar onder de microscoop ontleden. 5) De balans van de tarieven van superfusate-en uitstroom in om te voorkomen dat overloopt de opname kamer. Dit voorkomt plotselinge oplossing niveaus, die abrupte bewegingen weefsel kan veroorzaken. 6) Kies gezonde paar cellen dicht bij elkaar. Cellen met gladde cytoplasma gezonder zijn dan cellen met korrelig cytoplasma. Cellen dieper in de slice hebben meer kans op intacte synaptische con behoudencontacten. 7) Zorg ervoor dat de pipet tip is niet gebroken of geborsteld tegen andere weefsel of puin op de weg naar beneden naar de cellen. 8) Controleer de pipet weerstand zodat deze niet verstopt met vuil of een bel, die beide kunnen het moeilijk een kwalitatief whole-cell opname te verkrijgen. Inplaats van de retina op nitrocellulose filterpapier, sommige onderzoekers insluiten retina in een blok van agar en gebruik een vibratome om retinale plakjes. Hoewel we deze aanpak niet geprobeerd, Kim et al.. 11 bespreken voordelen van beide benaderingen. In hun ervaring, de agar-gebaseerde benadering zorgt voor een meer consistente opbrengst van platte schijfjes met goed afgebakende retinale lagen, maar het filter papier gebaseerde aanpak levert gezondere fotoreceptoren. Staafjes en kegeltjes zijn verantwoordelijk voor transducing licht in veranderingen in de membraanpotentiaal. Met gepaarde opnames, kan de membraanpotentiaal van staven of kegels MANIPUL zijndirect en zo ated het vermogen om licht reacties genereren, terwijl nuttig voor het identificeren van celtypen, kan niet essentieel zijn. We bereiden daarom vaak segmenten in wit licht. Echter, zelfs wanneer bereid onder felle verlichting, salamander retinale neuronen kunnen grote licht responsen genereren zoals blijkt uit de reacties in Fig. 3. Dit is deels te wijten aan een relatief groot reservoir van chromofoor in de grote buitenste segment van volume, maar kan ook een uiting van het vermogen van Müller cellen tot 11-cis-retinal regenereren voor kegels 12. Om volledig donker aangepaste licht reacties te verkrijgen, kan men de plakjes bereiden onder infrarood verlichting. Voor dissecties onder infrarood licht, hechten we GenIII beeldversterkers (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) om de lenzen van de microscoop ontleden en verlichten het weefsel met een infrarood LED-zaklamp. Voor het snijden en andere procedures die niet zijn uitgevoerd onder de microscoop ontleden, maken we gebruik van een head-mounted image versterker. Voor de plaatsing van de patch pipetten, visualiseren we plakken met behulp van een infrarood-gevoelige CCD-camera (bv. Watec 502H, Watec Inc, Middletown, NY) gemonteerd aan de staander, vaste-fase microscoop. Met deze voorzorgsmaatregelen, kan een hengel reacties vertoont enkel foton gevoeligheid 6, 13 te verkrijgen. Een beperking van het werken in het netvlies plakken is dat lang cellulaire processen van groot veld retinale neuronen tijdens het snijden procedure veel van hun dendrieten kunnen verliezen. Retinale slice preparaten zijn daarom bruikbaar voor de fysiologie van cellen waarin het synaptische contacten betrokken processen dichtbij het cellichaam. Amfibieën en zoogdieren netvliezen delen veel van dezelfde celtypen en gebruik maken van soortgelijke fysiologische mechanismen 14-16. Terwijl salamander netvlies is een goed model voor veel aspecten van zoogdierretina blijkt een belangrijk verschil met de aanwezigheid van een specifieke staaf route in zoogdieren die involves contacten van gespecialiseerde staf bipolaire cellen op AII amacrinecellen 14. Een extra beperking van de salamander netvlies is het kleine aantal genetische instrumenten die specifiek ontwikkeld voor deze soort. Echter, antilichamen en reagentia die shRNA doel goed geconserveerde gebieden in andere species met succes kan worden gebruikt salamander, evenals vele kleine molecule inhibitoren en peptide reagentia. Bovendien, met enkele wijzigingen in techniek netvlies plakjes kunnen worden bereid uit andere soorten waarbij sommige van deze instrumenten zijn beschikbaar. Naast zijn bruikbaarheid voor gepaarde whole-cell opname, de salamander netvlies slice voorbereiding is vatbaar voor een aantal andere benaderingen. Zoals hierboven besproken kan netvlies segmenten worden gebruikt om licht reacties in combinatie met diverse onderzoeken voltage clamp protocollen 17. Retinale neuronen kunnen geladen worden met fluorescerende kleurstoffen gevoelig voor Ca2 +, Cl - of Na+ Geïntroduceerd door de patch pipet of door bad-applicatie 15,18-20. Een fluorescent peptide dat bindt aan de synaptische lint 21 kan worden ingevoerd via de patch pipet en gebruikt voor beeldvorming van het lint 10 of, wanneer geconjugeerd aan fluoresceïne, voor acuut en selectief beschadiging van de band 22. We hebben ook netvlies segmenten in combinatie met quantum dots op de bewegingen van afzonderlijke calciumkanalen in staafjes en kegeltjes synaptische terminals 23 volgen. Dus de verticale netvlies slice is een veelzijdige experimentele voorbereiding bestuderen basic synaptische mechanismen en unieke verwerkingsfuncties uitgevoerd bij de eerste synaps in de signalisatie pathway.

<table><tbody><tr><td>Tissuse slicer</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Dubbelzijdige scheermessen</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membranen</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>Type AAWP 0,8 mm porie</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas pipetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>1,2 mm OD 0,95 mm ID</td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet</td><td>Warner</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>34 ga. Vulnaald, 67 mm lang</td></tr></tbody></table>

gelijktijdige whole-cell opnames van photoreceptors en tweede-orde neuronen in amfibievliegtuig netvlies slice voorbereiding

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Een van de centrale taken in retinale neurologie is de schakeling van retinale neuronen en hoe deze verbindingen zijn verantwoordelijk voor de vormgeving de aan de hersenen signalen begrijpen. Fotonen worden gedetecteerd in de retina van staafjes en kegeltjes fotoreceptoren, die deze energie omzetten in een elektrisch signaal, verzenden naar andere retinale neuronen, waar het wordt verwerkt en doorgegeven aan de doelen in de hersenen via de oogzenuw. Belangrijke vroege inzichten in retinale circuits en visuele verwerking kwam uit de histologische studies van Cajal 1,2 en, later, van elektrofysiologische opnames van de spiking activiteit van retinale ganglioncellen - de uitgang cellen van de retina 3,4. Het begrijpen van visuele verwerking in het netvlies vereist begrip van het signaal bij elke stap in de route van fotoreceptor tot retinale ganglioncellen. Echter, veel retinale celtypen zijn buried diep in het weefsel en dus relatief ontoegankelijk voor elektrofysiologische opname. Deze beperking kan worden overwonnen door te werken met verticale segmenten, waarbij cellen die binnen elk van de retinale lagen zijn duidelijk zichtbaar en toegankelijk voor elektrofysiologische opnames. Hier beschrijven we een methode voor het maken van verticale secties van de netvliezen van larvale tijger salamanders (Ambystoma tigrinum). Hoewel dit preparaat werd oorspronkelijk ontwikkeld voor opnames met scherpe micro-elektroden 5,6, beschrijven we een methode voor dual whole-cell voltage clamp opnamen van fotoreceptoren en tweede-orde horizontale en bipolaire cellen waarin membraanpotentiaal de afdrukband te manipuleren we tijdens het gelijktijdig opnemen van post- synaptische reacties in horizontale of bipolaire cellen. De fotoreceptoren van de tijger salamander zijn aanzienlijk groter dan die van zoogdieren, waardoor dit een ideale voorbereiding in te voeren tzijn technisch uitdagend experimentele benadering. Deze experimenten worden beschreven met een oog naar het sonderen signaleringseigenschappen van de synaptische ribbon - een gespecialiseerde synaptische structuur die in een slechts een handvol neuronen, zoals staafjes en kegeltjes fotoreceptoren, die goed geschikt is voor het handhaven van een hoog percentage tonische neurotransmitters 7 , 8 - en hoe het bijdraagt ​​aan de unieke signalering eigenschappen van deze eerste retinale synaps.

Representatieve sporen van licht antwoorden van neuronen in verticale plakjes salamander netvlies afgebeeld in figuur 3. De kegel, horizontale cel en UIT bipolaire cel al weer een buitenwaartse stroom in reactie op licht ontstaan. De prominente innerlijke stroom na de lichtflits in de horizontale en bipolaire cel opnames wordt veroorzaakt door de verhoogde afgifte van glutamaat uit fotoreceptoren als ze depolariseren op licht te compenseren. De OP bipolaire cel reageert met een innerlijke stroom bij het ​​aanzetten van licht als gevolg van een teken-omkeren metabotrope glutamaat receptor signalering cascade en activering van TRPM1 kanalen 9. Horizontale cellen en bipolaire cellen kunnen worden onderscheiden van elkaar door de verhoudingen IV (Figuur 4). Horizontale cellen hebben meestal een lineaire of innerlijk rectificeren IV en lage input weerstand (&lt;500 MQ; figuur 4A), terwijl bipolaire cellen hebben een hoge input weerstand(0.5-2 GQ) en buiten-rectificatie van I - V (figuur 4B) Figuur 5 toont representatieve resultaten uit opnames van een kegel-horizontale cel pair (figuur 5A) en kegel-OFF bipolaire cel pair (Figuur 5B).. In elk, depolariserend de kegel tot -10 mV van een bedrijf potentieel van -70 mV opgeroepen een voltage-gated calcium stroom in de kegel en snel naar binnen EPSC in de horizontale of bipolaire cel. Deze sterke stimulans is voldoende om de direct-afgeefbare pool van ~ 20 blaasjes uit elke synaptische lint, resulterend in een EPSC van ~ 47 pA / lint 10 legen. De horizontale cel EPSC in figuur 5A was 232 pA, wat suggereert dat het ontvangen 5 lint contacten uit de presynaptische kegel. Een soortgelijke schatting van de 178 pA EPSC in de off bipolaire cel (Figuur 5B) suggereert dat het ontvangen 4 lint contacten uit de presynaptische kegel. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Amfibie zoutoplossing </td><td> Presynaptische pipet </td><td> Postsynaptische pipet </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1.8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutamaat * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconaat ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Tetraethylammoniumchloride </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mM </td><td> 9 mM </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolariteit **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamaat door neutraliseren 40 mM L-glutaminezuur met 40 mM CsOH in de pipetoplossing. ** A 1 M voorraadoplossing van Cs-gluconaat wordt door neutraliseren van een oplossing van CsOH met 45-50% D-gluconzuur. *** De pH moet worden bijgesteld met NaOH voor de extracellulaire oplossing en CsOH de pipet oplossingen. **** Houd de osmolariteit van de oplossingen pipet net onder die van de extracellulaire oplossing voorkomt cel zwelling en verhoogt de levensduur van de opname. Tafel1. Onderdelen en parameters voor de standaard intracellulaire en extracellulaire oplossingen die in dit protocol. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figuur 1. Opname kamer ontwerp. (AC) Top, kant en opengewerkte uitzicht op de opname kamer met afmetingen. De kamer wordt vervaardigd uit een 2 mm dik stuk acryl. (D) Gemonteerd kamer. Superfusate komt in de kamer door een 10 cm lengte van Teflon buis (kolf; soort 24LW). Superfusate wordt verwijderd door toepassing van een geringe zuigdruk een schuine 20 metalen buis aan de andere zijde van de kamer. Grenzend aan deze uitgang buis is een Ag / AgCl pellet referentie-elektrode. De leiding van de referentie-elektrode is verbonden met de referentie-ingang van de headstage. Een kleine driehoek van KimWipewordt geplaatst over de referentie-elektrode te houden in contact met de oplossing en reguleren vloeistoftoevoer naar de uitlaatbuis. De basis van de kamer wordt gevormd door een microscoopglaasje in de verzonken randen van de kamer. De dia wordt op zijn plaats gehouden met een kraal van vacuüm vet. Stroken nitrocellulose membraan met retinale plakjes worden ingebed in kralen van vacuüm vet dat een kanaal voor oplossing stromen te vormen. Voorafgaand aan het maken van plakjes, wordt een 5 x 10 mm stukje nitrocellulose membraan aangebracht op de kamer met twee kleine kralen van vacuüm vet. Een stuk van de oogschelp is om geplaatst vitreale kant op deze nitrocellulose membraan en tilde weg zodra het netvlies kleeft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figuur 2. Kleurstof gevulde cel paren in vertical slice voorbereiding. A) Beelden van een staaf en synaptically-gekoppelde horizontale cel die waren gevuld met contrasterende fluorescente kleurstoffen ingebracht via de patch pipet tijdens simultane whole-cell opname. Lucifer geel (2 mg / ml) werd opgenomen in de staaf pipetoplossing (geel) en sulfarhodamine B (1 mg / ml) werd opgenomen in de horizontale cel pipetoplossing (paars). Fluorescerende beelden werden opgenomen met een draaiende schijf confocale microscoop (Perkin Elmer Ultraview LCI) uitgerust met een gekoelde CCD-camera (Orca ER) en gemonteerd aan de vaste fase microscoop (Nikon E600 FN met 60X, 1.0 NA water immersie objectief). Deze beelden werden geplaatst op een helder veld beelden van de overeenkomstige netvlies plakken met behulp van Adobe Photoshop. B) afbeeldingen van een kegel en synaptically-gekoppelde OFF bipolaire cel. De bipolaire cel axon terminal vertakt zich in de buitenste (S1) sublamina van de binnenste plexiform laag in de buurt van de grens met de binnenste nucleaire laag. <strong&gt; C) Beelden van een kegel en synaptically-gekoppelde horizontale cel. Merk op dat de kegel terminals zijn aanzienlijk groter dan de axon terminal van de staaf. Hoewel horizontale cellen kunnen worden geïdentificeerd door de langwerpige vorm van hun cellichamen, cellichamen van de ON-en OFF-soort bipolaire cellen in de INL niet gemakkelijk worden voorafgaand aan de opname onderscheiden. Echter, een doel verplaatst kegel aangedreven OFF bipolaire cellen die cel organen in de ONL kan worden onderscheiden uit kegels door de afwezigheid van binnenste en buitenste segmenten. De schaal bar is 20 micrometer. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figuur 3. Licht-opgewekte stromen opgenomen onder spanning klem uit vier verschillende retinale neuronen in reactie op een heldere 500 msec flits van wit licht. De conus (A), horizontale cel <strong&gt; (B), en uit bipolaire cellen (C) al gereageerd op het licht met een buitenwaartse stroom. (D) De op bipolaire cellen reageerden op hetzelfde licht stimulus met een innerlijke stroom. De basislijnruis tentoongesteld door de off bipolaire cel (C) geeft een continue afgifte van synaptische blaasjes in de duisternis die verdwijnt wanneer fotoreceptoren hyperpolariseren in licht. Reacties van deze vier cellen werden verkregen in afzonderlijke opnamen met plakjes bereid onder wit licht. De intensiteit van het witte licht stimulus die in deze voorbeelden geproduceerd reacties in horizontale en bipolaire cellen gelijk aan 580 nm foton flux van 1 x 10 5 fotonen / sec / um 2. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Figuur 4. Stroom-spanning (IV) relaties van horizontal en uit bipolaire cellen. (A) Bovenpaneel, membraan stromen opgewekt door een reeks 150 msec spanning stappen van -120 tot +40 mV toegepast in stappen 20 mV (onderste paneel) een horizontale cel. Horizontale cellen hebben typisch een lage ingangsweerstand en lineaire of binnenwaarts rectificeren IV verhoudingen. (B) IV relatie van een off bipolaire cel in reactie op een aantal spanningsstappen. Bipolaire cellen een hogere ingangsweerstand en een buitenwaarts rectificeren IV, op de activering van voltage-gated kalium stromen. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figuur 5. Voorbeelden van gepaarde opnamegegevens. (A) Opname van de kegel voltage-gated calcium stroom (Cone I Ca </sub&gt;) in reactie op een 100 msec stap naar -10 mV met een potentiaal van -70 mV (Cone Vm). Lek en capaciteit transiënten werden afgetrokken met een P / 8 lek aftrekken protocol. Een snelle prikkelende postsynaptische stroom (EPSC, HC PSC) werd gelijktijdig opgenomen van een horizontale cel, waaruit blijkt dat deze twee cellen synaptisch gekoppeld (B) een EPSC werd opgenomen in een off bipolaire cel in reactie op dezelfde stimulus in de andere. kegel.

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) En leg uit hoe we deze schijfjes te synaptische verwerking in het netvlies te bestuderen door het verkrijgen van dual whole-cell voltage clamp opnamen van fotoreceptoren en tweede-orde horizontale en bipolaire cellen.

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Het algemene doel van deze procedure is om dunne weefselsneden voor te bereiden uit de retina van een aquatische tijger salamander, en deze te gebruiken voor gelijktijdige voltage clamp opnames van hele cellen van fotoreceptoren en tweede orde horizontale en bipolaire cellen. Dit wordt bereikt door eerst een salamanderoog te disseceren en de retina op een stuk nitrocellulosemembraan te isoleren. De tweede stap is het snijden van dunne retinasneden en deze in het opnamekamertje te plaatsen.Vervolgens wordt het kamertje op een rechtopstaande microscoop met vaste standaard geplaatst en patch pipetten worden boven de retinale sneden gepositioneerd. De laatste stap is het verkrijgen van opnames van hele cellen van een presynaptische, fotoreceptor, en postsynaptische horizontale of bipolaire cel. Uiteindelijk kunnen gepaarde opnames van hele cellen worden gebruikt om synaptische afgifte te manipuleren en de interacties tussen cellen in de retina te bestuderen.De preparatie van retinale sneden werd oorspronkelijk ontwikkeld in de laboratoria van Frank Werblin en Sam Wu. In tegenstelling tot preparaten van enkele cellen behouden snedenpreparaten intacte contacten, en in tegenstelling tot gehele montage-retinapreparaten, sneden van de retina stelt verschillende retinale lagen bloot, waardoor gemakkelijk toegang tot alle verschillende celtypen mogelijk is. In de Retina Slice. Preparaten kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames, inclusief gelijktijdige opnames voor meerdere cellen en voor beeldvormingsexperimenten.Deze bereiding heeft zich uiterst waardevol betoond voor het bestuderen van synaptische interacties tussen retinale neuronen. In deze video beschrijven we de voorbereiding van sneden met behulp van de retina van een tijger salamander, en benadrukken we enkele van de kleine details die het verschil kunnen maken tussen succes en falen. Begin deze procedure door de kamer te assembleren.Plaats twee bolletjes vacuümvet met een afstand van acht tot 10 millimeter over de opnamekamer om een kanaal te vormen voor super fase en om de retinol sneden op een tweede bolletje vet te bevestigen, een paar millimeter verder dan elk van deze twee bolletjes vet om als dijk te dienen en overloop te beperken. Plaats vervolgens een klein driehoekig stukje Kimdoek aan het einde van de kamer om vloeistofbevattend contact met de referentie-elektrode te garanderen. Druk vervolgens een stuk nitrocellulosemembraan plat tegen het glazen microscoop.Schuif op twee kleine bolletjes vacuümvet. Om de weefselsnijder voor te bereiden. Breek een dubbelzijdig scheermesje in vier stukken.Bevestig vervolgens een van deze aan de snijarm. Zorg ervoor dat de snijkant van het scheermesje plat tegen de opnamekamer ligt door een dunne plak nitrocellulosefilterpapier te snijden. Vervolgens, nadat een salamander geëuthanaseerd is door onthoofding, nucleeer het oog met een paar kleine Venetiaanse schaar onder de microscoop, snijd de huid die het oog met de omringende baan verbindt.Trek vervolgens het oog naar voren en schuif de schaar eronder om door de oogspieren en de oogzenuw te snijden. Plaats vervolgens het uitgeholde oog op een bed van katoen op een linoleumblok. Maak nu een kleine insnijding in het midden van het hoornvlies met een scherp chirurgisch mes.Verwijder het hoornvlies door de fijne Venetiaanse schaar in de insnijding te schuiven en de snede radiaal naar de aura Serrata uit te breiden. Snijd vervolgens cirkelvormig rond de aura serrata door de linoleumblok of het katoen tussen de sneden te draaien. Nadat u helemaal rond het oog gesneden hebt, verwijdert u het hoornvlies en de lens door ze uit de zijkant van de oogcup te trekken.Breng de resterende oogcup over op een hard oppervlak van het linoleumblok dat bevochtigd is met amfibische zoutoplossing. Snijd het in drieën met een scherp scheermesje in een fijn zaagbeweging om ervoor te zorgen dat het helemaal door de sclera snijdt. Plaats vervolgens een of twee stukken IUP op het nitrocellulosemembraan met de retinale oppervlakte naar beneden gericht.Dompel de resterende stukken onder in aanvullende zoutoplossing. Plaats ze daarna in een koelkast voor het geval er later nog extra sneden worden gesneden. Druk nu voorzichtig het stuk IUP met een paar fijne tang tegen het nitrocellulosemembraan.Dompel het nitrocellulosemembraan en het IUP-stuk onder in verschillende druppels koude amfibische zoutoplossing. Laat vervolgens de zoutoplossing wegvloeien door een stuk Kimdoek aan de randen van het nitrocellulosemembraan en iup aan te raken. Dompel vervolgens de IUP onder in nitrocellulosemembraan met verschillende druppels koude amfibische zoutoplossing.Schilder vervolgens de sclera choroïde retinale pigmentepitheel af om de retina te isoleren. Als de retina niet stevig heeft gehecht, laat dan de zoutoplossing wegvloeien met een Kimdoek. Om de retina steviger op het nitrocellulosemembraan te trekken, vervangt u de zoutoplossing en herhaalt u de procedure indien nodig.Vul vervolgens de kamer met koude amfibische zoutoplossing. Breng het over naar de standaard van de weefselsnijder. Snijd vervolgens de retina en het nitrocellulosemembraan in 125 micron dunne stroken door de scheermesjes voorzichtig maar stevig door ze heen te drukken.Nadat de hele retina in sneden is gesneden, brengt u de retinale sneden een voor een over naar het hoofdkanaal van de opnamekamer. Om een snede over te brengen, houdt u een strook membraan op zijn plaats terwijl u de kamer eronder schuift. Zorg ervoor dat de snede ondergedompeld blijft wanneer deze boven het centrale deel van de kamer is.Bevestig de randen van het nitrocellulosemembraan in de stroken vacuümvet en draai het 90 graden. Om de retinale lagen te bekijken, drukt u het nitrocellulosemembraan plat tegen het glazen oppervlak, zelfs als er geen retina op elk stuk is. Plaats stroken nitrocellulosemembraan op ongeveer millimeter regelmatige intervallen om de oppervlaktespanning te helpen breken en daardoor de vloeistomloop te verbeteren.Ga door met het overbrengen van de sneden een voor een totdat de sneden over de hele

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Leer de retinale snijpreparatie van Ambystoma tigrinum voor gelijktijdige whole-cell opnames van fotoreceptoren en tweede-orde neuronen. Deze methode behoudt intacte synaptische contacten voor elektrofysiologisch onderzoek.

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Meer video's verkennen