Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Het algemene doel van deze procedure is om dunne weefselsneden voor te bereiden uit de retina van een aquatische tijger salamander, en deze te gebruiken voor gelijktijdige voltage clamp opnames van hele cellen van fotoreceptoren en tweede orde horizontale en bipolaire cellen. Dit wordt bereikt door eerst een salamanderoog te disseceren en de retina op een stuk nitrocellulosemembraan te isoleren. De tweede stap is het snijden van dunne retinasneden en deze in het opnamekamertje te plaatsen.

Vervolgens wordt het kamertje op een rechtopstaande microscoop met vaste standaard geplaatst en patch pipetten worden boven de retinale sneden gepositioneerd. De laatste stap is het verkrijgen van opnames van hele cellen van een presynaptische, fotoreceptor, en postsynaptische horizontale of bipolaire cel. Uiteindelijk kunnen gepaarde opnames van hele cellen worden gebruikt om synaptische afgifte te manipuleren en de interacties tussen cellen in de retina te bestuderen.

De preparatie van retinale sneden werd oorspronkelijk ontwikkeld in de laboratoria van Frank Werblin en Sam Wu. In tegenstelling tot preparaten van enkele cellen behouden snedenpreparaten intacte contacten, en in tegenstelling tot gehele montage-retinapreparaten, sneden van de retina stelt verschillende retinale lagen bloot, waardoor gemakkelijk toegang tot alle verschillende celtypen mogelijk is. In de Retina Slice. Preparaten kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames, inclusief gelijktijdige opnames voor meerdere cellen en voor beeldvormingsexperimenten.

Deze bereiding heeft zich uiterst waardevol betoond voor het bestuderen van synaptische interacties tussen retinale neuronen. In deze video beschrijven we de voorbereiding van sneden met behulp van de retina van een tijger salamander, en benadrukken we enkele van de kleine details die het verschil kunnen maken tussen succes en falen. Begin deze procedure door de kamer te assembleren.

Plaats twee bolletjes vacuümvet met een afstand van acht tot 10 millimeter over de opnamekamer om een kanaal te vormen voor super fase en om de retinol sneden op een tweede bolletje vet te bevestigen, een paar millimeter verder dan elk van deze twee bolletjes vet om als dijk te dienen en overloop te beperken. Plaats vervolgens een klein driehoekig stukje Kimdoek aan het einde van de kamer om vloeistofbevattend contact met de referentie-elektrode te garanderen. Druk vervolgens een stuk nitrocellulosemembraan plat tegen het glazen microscoop.

Schuif op twee kleine bolletjes vacuümvet. Om de weefselsnijder voor te bereiden. Breek een dubbelzijdig scheermesje in vier stukken.

Bevestig vervolgens een van deze aan de snijarm. Zorg ervoor dat de snijkant van het scheermesje plat tegen de opnamekamer ligt door een dunne plak nitrocellulosefilterpapier te snijden. Vervolgens, nadat een salamander geëuthanaseerd is door onthoofding, nucleeer het oog met een paar kleine Venetiaanse schaar onder de microscoop, snijd de huid die het oog met de omringende baan verbindt.

Trek vervolgens het oog naar voren en schuif de schaar eronder om door de oogspieren en de oogzenuw te snijden. Plaats vervolgens het uitgeholde oog op een bed van katoen op een linoleumblok. Maak nu een kleine insnijding in het midden van het hoornvlies met een scherp chirurgisch mes.

Verwijder het hoornvlies door de fijne Venetiaanse schaar in de insnijding te schuiven en de snede radiaal naar de aura Serrata uit te breiden. Snijd vervolgens cirkelvormig rond de aura serrata door de linoleumblok of het katoen tussen de sneden te draaien. Nadat u helemaal rond het oog gesneden hebt, verwijdert u het hoornvlies en de lens door ze uit de zijkant van de oogcup te trekken.

Breng de resterende oogcup over op een hard oppervlak van het linoleumblok dat bevochtigd is met amfibische zoutoplossing. Snijd het in drieën met een scherp scheermesje in een fijn zaagbeweging om ervoor te zorgen dat het helemaal door de sclera snijdt. Plaats vervolgens een of twee stukken IUP op het nitrocellulosemembraan met de retinale oppervlakte naar beneden gericht.

Dompel de resterende stukken onder in aanvullende zoutoplossing. Plaats ze daarna in een koelkast voor het geval er later nog extra sneden worden gesneden. Druk nu voorzichtig het stuk IUP met een paar fijne tang tegen het nitrocellulosemembraan.

Dompel het nitrocellulosemembraan en het IUP-stuk onder in verschillende druppels koude amfibische zoutoplossing. Laat vervolgens de zoutoplossing wegvloeien door een stuk Kimdoek aan de randen van het nitrocellulosemembraan en iup aan te raken. Dompel vervolgens de IUP onder in nitrocellulosemembraan met verschillende druppels koude amfibische zoutoplossing.

Schilder vervolgens de sclera choroïde retinale pigmentepitheel af om de retina te isoleren. Als de retina niet stevig heeft gehecht, laat dan de zoutoplossing wegvloeien met een Kimdoek. Om de retina steviger op het nitrocellulosemembraan te trekken, vervangt u de zoutoplossing en herhaalt u de procedure indien nodig.

Vul vervolgens de kamer met koude amfibische zoutoplossing. Breng het over naar de standaard van de weefselsnijder. Snijd vervolgens de retina en het nitrocellulosemembraan in 125 micron dunne stroken door de scheermesjes voorzichtig maar stevig door ze heen te drukken.

Nadat de hele retina in sneden is gesneden, brengt u de retinale sneden een voor een over naar het hoofdkanaal van de opnamekamer. Om een snede over te brengen, houdt u een strook membraan op zijn plaats terwijl u de kamer eronder schuift. Zorg ervoor dat de snede ondergedompeld blijft wanneer deze boven het centrale deel van de kamer is.

Bevestig de randen van het nitrocellulosemembraan in de stroken vacuümvet en draai het 90 graden. Om de retinale lagen te bekijken, drukt u het nitrocellulosemembraan plat tegen het glazen oppervlak, zelfs als er geen retina op elk stuk is. Plaats stroken nitrocellulosemembraan op ongeveer millimeter regelmatige intervallen om de oppervlaktespanning te helpen breken en daardoor de vloeistomloop te verbeteren.

Ga door met het overbrengen van de sneden een voor een totdat de sneden over de hele