Name: Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSCs) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Leer hoe je spermatogoniale stam- en progenitorcellen (SSCs) uit volwassen muizen kweekt met behulp van mitotisch geïnactiveerde feeder-cellen. Deze methode ondersteunt langdurige celvernieuwing en expansie voor onderzoek naar mannelijke vruchtbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de New York State Department of Health (C026878). MS was een New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Mede ondersteund door Research Grant No 5-FY11-571 uit de March of Dimes Foundation.

1. Bereiding van voedingscellen Merk op dat alle reagentia hieronder beschreven worden bereid in steriele wijze (zie tabellen 1 en 2). Dit protocol maakt gebruik van de JK1 cellijn (Cell Biolabs, Inc, catalogus # CBA-315) als feeders die een getransformeerde afgeleide van volwassen muis testiculaire somatische cellen en elders is 3 beschreven. Merk ook op dat alle dierlijke procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en voorschriften. <ol><li> JK1 cellen kunnen in cultuur worden gehouden en met succes gebruikt als voeders tot doorgang 39. Cultuur JK1 cellen in een 100 mm celkweekschaal (BD Falcon, catalogus # 353003) met 10 ml filter gesteriliseerd feeder groeimedium (DMEM aangevuld met 10% foetaal bovine serum [FBS], 2 mM L-glutamine en antibiotica). Wanneer de cultuur 95% confluentie bereikt, splitsen de cellen 1:06 -1:10 verhouding. </li><li> Verwijder medium van samenvloeiende JK1 feeder cel monolaag. </li><li> Eenmaal wassen met cellaag PBS zonder calcium en magnesium. </li><li> Voeg voorverwarmde trypsine / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, catalogus nr. 25-051-CI), en incuberen bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. </li><li> Inactiveren trypsine met een gelijk volume van feeder groeimedium. Verzamel cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in feeder groeimedium. </li><li> Grondlaag multi-well platen celkweek door toevoegen van voldoende 0,4% gelatine oplossing te dekken de put en na 5 min bij kamertemperatuur verwijderen. </li><li> Plaat ~ 250 cellen per mm2 in gelatine beklede celkweekplaat (bijv. 48-well of 6-well formaat). Incubeer kweek bij 37 ° C gedurende 16 tot 24 uur. </li><li> Verwijder kweekmedium uit putten. WAARSCHUWING: celgroei inactiveren, voeg een verse oplossing van mitomycine-C bij 10 ug / ml verdund in DMEM aan elk putje (bijv. 200 ul / putje van een 48 well plaat). Mitomycine-C is giftig. Worden gehanteerd en afgevoerd met zorg. Incubeer bij37 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Verwijderen mitomycine-C oplossing van cellen. 3 keer wassen met DMEM vóór plating stamcellen. </li><li> Verwijderen van DMEM voedingscellen putjes en voeg genoeg stamcellen medium (100 ul / putje van een 48 well plaat, zie Tabel 3) om uitdroging van de voedingsdraden te voorkomen tijdens passage. Voeg SSC&#39;s op dezelfde dag, zoals hieronder beschreven in de punten 3.1 en 3.4, met behulp van de aangegeven maten van putjes die feeders. </li></ol> 2. Dissociatie van de muis testis weefsel te Donor Germ cellen te verkrijgen <ol><li> Oogst volwassen muis testes in steriele mode en tijdelijk de testikels op te slaan in een overdekte petrischaal (zonder vloeistof toegevoegd). De schotel moet onmiddellijk op ijs geplaatst om uitdroging te voorkomen en te onderhouden cellevensvatbaarheid. </li><li> Met behulp van steriele fijne tang en een boete schaar in een celkweek kap, maak een dwarse snede in de tunicaalbuginea zonder volledig doorsnijden van de testis (dat wil zeggen, gesneden ~ ½ - ¾ afstand thrdoorgedreven) en gebruik een tang om squeeze out testes in een hoek van de plaat; aflegstapel tunica en een aangrenzende weefsel. Houd plaat op ijs gedurende houden weefsel gekoeld, met behoud van de integriteit en het voorkomen van verdamping. </li><li> Snel gehakt buisjes met fijne lente schaar minstens 3 minuten per testis, terwijl plaat op ijs. </li><li> Verzamel de tubulus fragmenten in een 50 ml conische buis en wassen ~ 40 ml koud PBS / 1% bovine serum albumine. </li><li> Centrifugeer bij 60 xg gedurende 10 min om tubulus fragmenten scheiden van spermatozoa en vuil. Gooi supernatant. </li><li> In een 15 ml conische buis, resuspendeer de pellet in 3 ml per testis van voorverwarmde dissociatie buffer (DMEM, 0,05% trypsine, 0,03% collagenase type I, 80 U / ml DNAse I en 0,5% runderserumalbumine, zie Tabel 2 voor meer specifieke details van dissociatie buffer). </li><li> Horizontale positie de conische buis in een rek in een shaker ingesteld op 150 rpm bij 37 ° C gedurende 15 minuten een maximalegitation. </li><li> Spin down bij 60 xg gedurende 10 min te scheiden afzonderlijke cellen van gedissocieerde brokken. </li><li> Sla de pellet met brokken tot de volgende stap. Verzamel supernatant uit stap 2.8 en 3 ml DMEM/10% foetaal runderserum dissociatie buffer te neutraliseren. Plaats buis op ijs tijdelijk. </li><li> Herhaal stap 2,6 tot 2,7 met de opgeslagen pellet van stap 2,9 tot opnieuw verteren brokken die overblijven na stap 2.8. </li><li> Voeg een gelijk volume van DMEM/10% FBS dissociatie buffer te neutraliseren. </li><li> Recombineren schorsing vanaf stap 2,11 met opgeslagen celsuspensie vanaf stap 2.9. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g. </li><li> Hersuspendeer pellet in stamcellen medium in een volume van 16 ml per paar testes (zie tabel 3). </li></ol> 3. Plating van testiculaire celsuspensie <ol><li> Plaat 2 ml celsuspensie per putje in een 6-wells plaat met voedingscellen mitotisch geïnactiveerd met mitomycine-C en in een celkweek incubator bij 37 &amp;deg; C in 5% CO2. </li><li> Na 48 uur, aspiraat medium, voeg 2 ml vers medium en terug te keren naar incubator. </li><li> Na 48 uur voeg 0,5 ml vers stamcellen medium aan elk putje en de incubator. </li><li> Na 48 uur later voeden cellen drie keer per week daarna als volgt tot grote discreet kolonies (&gt; 50 cellen) lijken (binnen 7 tot 21 dagen). Voor de eerste en tweede voeden elke week (bijv. maandag en woensdag) te verwijderen ~ 50% van de middelgrote en terug 50% toe te voegen door het volume van vers medium. Voor derde voeding (bijv. vrijdag), zuigen alle middelgrote en te vervangen door 2 ml vers medium. Deze benadering is gebaseerd op de gedachte dat het vermijden van compleet medium veranderingen concentratieschommelingen van paracriene signalen die worden uitgescheiden in het kweekmedium 9 minimaliseert. </li></ol> 4. Colony Picking voor First Passage <ol><li> Verwijderen medium uit putjes die kolonies worden gepasseerd door vers medium stamcellen. </li><li> Identificeer kolonies met een 10x objectief. Met de microscoop lichte de-gericht, zal SSC kolonies aan de rand van de put verschijnen als heldere homogene massa&#39;s, uit vele 11-12 urn diameter cellen waarin het moeilijk of onmogelijk om de individuele cel grenzen onderscheiden, omdat de cellen verschijnen samengesmolten (Figuur 1A). Niet-SSC kolonies lijken donkerder, meer gedetailleerde of minder homogeen, met waarneembare grenzen (Figuur 1A, inzet). </li><li> Met een 200 pi pipetpunt met pipetteman ingesteld op 50 ul eerst up medium uit de put en verdrijven de tip bevochtigen. Dan voorzichtig verschuiven de kolonie met de punt voor snel trekken 50 ul medium om de kolonie verdrijven door zuiging in de tip (Figuur 1B). </li><li> Verdrijf het medium dat de kolonie in een putje van een 48-wells plaat met geïnactiveerde feeder cellen met 100 pl stamcellen medium (Figuur 1C). </li><li> Herhaal stap4.3 en maximaal 8 kolonies met dezelfde goed zonder meer dan 500 ul per putje. </li><li> Herhaal de stappen 4,3 tot 4,5 om extra putten van de 48 wells-plaat te bereiden met doorgang een SSC kolonies. </li><li> Wells klaar te splitsen in 7-14 dagen of na grote massa tot 500 cellen ontstaan ​​(Figuur 1D). </li></ol> 5. Latere Uitbreiding en passage van de SSC&#39;s door Trituratie <ol><li> Cellen bij passage men moet worden voortgekweekt op vers na feeders tot 14 dagen bij een split verhouding van 1:2 voor de eerste 3 passages en 1:04-01:06 (elke 7 dagen) daarna als volgt. Voorzichtig vermalen kolonies uit een semi-confluente well (bv. ~ 300.000 SSC / putje 6-well plaat) met een 1 ml pipet door wasmedium over de cellen. Kolonies zichtbaar los. Te veel kracht de vloeistofstroom zal ongewenste feeder cellen te loskomen. </li><li> Verzamel getritureerd cellen in een conische buis en gecentrifugeerd bij 300 g gedurende5 min. Opmerking: Een behandeling met trypsine stap kan hier veilig worden toegevoegd indien gewenst door de onderzoeker. </li><li> Zuig supernatant en in zoet stamcel medium opnieuw te suspenderen door het grondig en neer te pipetteren om kolonies te verstoren. </li><li> Plaat SSC&#39;s op vers bereid feeder cellen geïnactiveerd met mitomycine-C, zoals beschreven in hoofdstuk 1. </li><li> Voeden cellen drie keer per week als volgt. Voor de eerste en tweede voeding (bijv. maandag en woensdag) voeg 50% van het volume van vers medium. Voor derde voeding (bijv. vrijdag), zuigen alle middelgrote en te vervangen door 2 ml vers medium. Platen zullen confluent in 7-10 dagen. Culturen moet bestaan ​​uit&gt; 98% kiemcellen (di &lt;1% contaminerende somatische cellen) na 5-7 passages op basis van immunokleuring (bijv. met gebruik van muriene kiemcel marker GCNA) van geslachtscellen onderscheiden van somatische cellen 10. Opmerking: Deze methoden zijn ontwikkeld in overeenstemming met de voorschriften en vereisten die door de instelling te stellenAl Animal Care en gebruik Comite op Weill Cornell Medical College. </li></ol>

<ol><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li>
<li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125%2B+germline+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li>
<li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li>
<li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li>
<li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li>
<li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li>
<li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li>
<li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li>
<li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li>
<li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li>
<li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545(2012).</li>
<li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%28%2B%29+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li>
<li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li>
</ol>

MS royalty&#39;s ontvangt van Weill Cornell Medical College door middel van een licentie voor Cell Biolabs, Inc te verspreiden JK1 cellen.

Deze methode voor het afleiden van volwassen SSC&#39;s met volwassen testis afgeleide feeder-cellen is robuust en is erin geslaagd om als gemeenschappelijke genetische achtergronden (bv. FVB, C57Bl6 en gemengde 129SV/C57Bl/6) en verschillende mutante stammen werden gebruikt 2,3,7,14. In feite is de micro die door het cultuurstelsel voldoende is om een deel van de genetische belemmeringen handhaven volwassen SSC in vivo (bijvoorbeeld bij plzf - / - dieren) overwinnen 7. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10 tot 013 </td><td> Verdunningsmiddel voor dissociatie buffer </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Stamcellen basismedium (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Vereist suppletie als per Shinohara et al.. (2003) * </td></tr><tr><td> Stamcel medium supplementen </td><td> divers </td><td> zie tabel 3 </td><td> Vereist suppletie als per Shinohara et al.. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 cellen </td><td> Cell Biolabs, Inc </td><td> CBA-315 </td><td> Kan vervangen met volwassen testiculaire stromale cellen per Seandel et al.. (2007) </td></tr><tr><td> mitomycine-C (LET OP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Vergiftig; Handle with care. </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> 0,4% oplossing in water </td></tr><tr><td> EVOS xl digitale omgekeerde microscoop </td><td> Geavanceerde Microscopie Groep </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Specifieke reagentia en apparatuur. * Zie tabel 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10 tot 013 </td><td> Verdunningsmiddel voor dissociatie buffer </td></tr><tr><td> trypsine (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Dissociatie buffer: Final 0,05% gew / vol </td></tr><tr><td> collagenase type I, 235 U / ml </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Dissociatie buffer: Final 0,03% gew / vol </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Dissociatie buffer: Final 80 U / ml </td></tr><tr><td> runderserumalbumine </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Dissociatie buffer: Final 0,5% gew / vol </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 2. Dissociatie buffer </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 voedingssupplement </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Extra toeslagen ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM vitamine oplossing </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> runderserumalbumine </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Antibiotica-Antimycoticum Solution </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml </td></tr><tr><td> β-estradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> progesteron </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> foetaal runderserum </td><td> veranderlijk </td><td> n / a </td><td> 1% </td></tr><tr><td> runderen holo-transferrine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 ug / ml </td></tr><tr><td> insuline </td><td> Tweeling Bio-Products </td><td> 700-112P </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> menselijke GDNF </td><td> Life Technologieën </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> menselijke bFGF </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> muis EGF </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> putrescine </td><td> Onderzoek Organics </td><td> 0778P </td><td> 60 uM </td></tr><tr><td> natriumseleniet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> pyruvinezuur </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 ug / ml </td></tr><tr><td> DL-melkzuur </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 uM </td></tr><tr><td> ascorbinezuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 uM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-biotine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 3. Stamcel medium </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Opmerking: Voeg hieronder supplementen voordat u medium. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Het medium is stabiel gedurende ten minste 2 weken. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Wij hebben gebruik ** verschillende fabrikanten, formuleringen en / of nummers in deze reagentia zonder enige duidelijke nadelige effecten. In het algemeen moet celkweek gehalte reagentia worden gebruikt. </td></tr></tbody></table>

seriële verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (ssc&#39;s) in cultuur voor het afleiden van lange termijn adult mouse ssc lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

SSC en progenitorcellen (SSC) van de testis zijn een klassiek voorbeeld van volwassen zoogdier stamcellen en behouden vruchtbaarheid bijna de levensduur van het dier. Hoewel de precieze mechanismen die zelfvernieuwing en differentiatie regeren in vivo zijn uitdagend om te studeren, zijn er verschillende systemen zijn eerder ontwikkeld voor muriene SSC&#39;s in vitro met behulp van een combinatie van gespecialiseerde cultuurmedia en feeder cellen 1 tot 3 propageren. De meeste in vitro uitstapjes naar de biologie van SSCs zijn afgeleide cellijnen van pasgeborenen, mogelijk vanwege de moeilijkheid om volwassen cellijnen 4. De testis verder te rijpen tot ~ 5 weken oud in de meeste muizenstammen. In de vroege postnatale periode dramatische veranderingen in de architectuur van de testis en de biologie van zowel somatische cellen en spermatogenese, met inbegrip van wijzigingen in expressieniveaus van tal stamcel-gerelateerdegenen. Daarom kan neonataal afgeleide SSC lijnen niet volledig herhalen de biologie van volwassen SSC&#39;s die blijven bestaan ​​na de volwassen testis heeft bereikt een steady state. Verschillende factoren hebben gehinderd de productie van volwassen SSC lijnen historisch. Ten eerste kan de verhouding van functionele stamcellen afnemen in volwassenheid, hetzij door intrinsieke of extrinsieke factoren 5,6. Zoals met andere volwassen stamcellen, was het moeilijk voldoende verrijking van SSCs totale volwassen zaadcellen zonder een combinatie van immunoselectie of sorteren strategieën 7. Gewoonlijk toegepast omvatten het gebruik van cryptorchide muizen als bron van donor cellen door een hogere verhouding van stamcellen om andere celtypen 8. Gebaseerd op de hypothese dat de verwijdering van somatische cellen van het oorspronkelijke kweek interacties met de stamcellen niche die essentieel zijn voor overleving SSC verstoort, we eerder ontwikkelde methoden voor het afleiden volwassen lines die geen immunoselectie of cryptorchide donoren, maar eerder in dienst seriële verrijking van SSC&#39;s in de cultuur, hierna te noemen SESC 2,3. De hieronder beschreven methode brengt een eenvoudige procedure voor het afleiden van volwassen SSC lijnen door dissociëren volwassen donor testes, gevolgd door platen van cellen op feeders bestaat uit een testiculaire stromale cellijn (JK1) 3. Door middel van seriële passage, sterk hechtende, niet-vervuilende kiemcellen worden uitgeput uit de cultuur met bijkomende verrijking van SSC&#39;s. Culturen die op deze wijze een mengsel van spermatogonia in verschillende stadia van differentiatie, die bevatten SSCs, gebaseerd op lange termijn zelfvernieuwing vermogen. De kern van de SESC methode is dat het SSC&#39;s in staat stelt om de moeilijke overgang van zelf-vernieuwing in vivo te maken op de lange termijn zelfvernieuwing in vitro in een radicaal andere micro-omgeving, produceert lange termijn SSC lijnen, vrij van verontreinigendesomatische cellen, en op basis waarvan daaropvolgende experimentele manipulatie van SSC.

Het uiterlijk van passage nul wild type, een volwassene SSC kolonies na 7 dagen figuur 1. Driedimensionale kolonies bestaan ​​uit een laag van platte cellen aan de stroomvoorziening of ondergeschikte extracellulaire matrix afgezet door de feeders met meerdere lagen SSCs groeien geplaatst. Terwijl gezonde SSCs zijn licht en uniform refractiele 11-12 urn diameter, de celranden zijn moeilijk te onderscheiden en de grootte van de kolonies kunnen zeer variabel, zowel binnen de put en tussen wells bereid uit ...

Een eenvoudige methode voor het afleiden van en onderhouden van SSC en stamceltransplantatie lijnen van volwassen muizen wordt hier gepresenteerd. De werkwijze gebruikt voedingscellen afkomstig van de somatische cel compartiment van de volwassen muis testis. Deze techniek is voor het gemeenschappelijk muizenstammen, inclusief transgene, knock-out en knock-in muizen.

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC&#39;s) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Het algemene doel van deze procedure is om langetermijncultures van volwassen muis, spermatogonia, stam- en voorlopercellen of SSC's te genereren. Dit wordt bereikt door eerst tonisch geïnactiveerde feedercellen voor te bereiden. Vervolgens wordt een testiculaire celsuspensie bereid door enzymatische dissociatie van volwassen testisweefsel.Vervolgens worden de testiculaire cellen op feedercellen geplaat om SSC-kolonies te laten vormen. De laatste stap van de procedure is om putatieve SSC-kolonies handmatig te plukken voor subcultuur in kleine cultuurputjes. Uiteindelijk kan langdurige celvernieuwing en expansie van SSC's over vele passages in vitro worden bevestigd door immunokleuring voor breed geëxpresseerde markers van kiemcellen of meer specifiek van SSC's.En door functionele analyse met behulp van SSC-transplantatie in vivo. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de identificatie van kleine SSC-kolonies door fasemicroscopie uiterst uitdagend is. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het plukken van kolonies moeilijk te leren zijn omdat het moeilijk kan zijn om SSC-kolonies te zien tegen een comple

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Deze video toont protocol de toepassing van de neurosphere test voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen van het ganglionisch eminenties van embryonale dag 14-hersenen van muizen.

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Het opzetten van cultuursystemen voor de expansie van volwassen neurale stamcellen (aNSCs) maakt het mogelijk om aNSCs te onderzoeken en toe te passen voor therapie. De subcallosale zone (SCZ) is onlangs herkend als een nieuwe neuroblastvormende regio in volwassen muizen. Hier worden methoden beschreven voor de isolatie, expansie en differentiatie van SCZ-aNSCs.

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.

Muis Ronde Spermatide Injectie

Leer hoe je spermatogoniale stam- en progenitorcellen (SSCs) uit volwassen muizen kweekt met behulp van mitotisch geïnactiveerde feeder-cellen. Deze methode ondersteunt langdurige celvernieuwing en expansie voor onderzoek naar mannelijke vruchtbaarheid.

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSCs) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines (Video) | JoVE Journal

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC's) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Meer video's verkennen