Name: Dichtheidsgradiënt Meerlaagse polymerisatie (dGMP): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, Aanpasbare Steigers for Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Leer hoe je met dGMP meerdere compartimenten maakt voor tissue engineering. Deze kosteneffectieve methode creëert biocompatibele, gelaagde 2D- en 3D-matrices zonder dure instrumenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar voor de steun van New Innovator NIH directeur Awards (1DP2 OD006499-01 naar AA en 1DP2 OD006460-01 tot AJE), en King Abdulaziz Stad voor Wetenschap en Technologie (UC San Diego Center of Excellence in Nanomedicine). We willen mevrouw Jessica Moore bedanken voor haar kritische commentaar op het manuscript.

1. Synthese van fluorescent gemerkte acryloyl-PEG-RGDS <ol><li> Reageren de RGDS peptide met acryloyl-PEG-succinimidyl carboxymethyl ester (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) en NN diisopropylethylamine (DIPEA) in 1.2:1:2 molverhoudingen in dimethylsulfoxide (DMSO) onder argon bij kamertemperatuur &#39;s nachts. </li><li> Bevestigen door conjugatie matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie. Voeg 1 pl aPEG-RGDS reactieoplossing een monster plek op de MALDI target en droog. Bereid een verzadigde oplossing van Universal MALDI Matrix in tetrahydrofuran (THF) en vortex gedurende 1 minuut. Voeg ~ 1 ul van deze oplossing hetzelfde monster plaats. Herhaal de procedure voor aPEG-SCM ter vergelijking. Laden en te analyseren. Het molecuulgewicht van aPEG-RGDS moet groter aPEG-SCM (Figuur 2). </li><li> Het fluorofoor te conjugeren, voeg een equimolaire hoeveelheid Alexa Fluor 350 carbonzuur (succinimydyl ester), opgelostin een minimaal volume DMSO, de aPEG-RGDS reactieoplossing van 1,1 en reageren onder argon bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Zuiveren aPEG-RGDS-350 door dialyse (MW 3500 Da) tegen DI-H 2 O bij 4 ° C gedurende 48 uur bij 1.000:1 volumeverhouding, uitwisseling dialysaat ten minste tweemaal per dag. </li><li> Freeze drogen het gezuiverde aPEG-RGDS-350 in een Labconco Freezone Plus of gelijkwaardig vries droog systeem en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiding van een 2D-Mold en fabricatie van een 2D-PEG Gel met Alternating RGDS-350 Lagen <ol><li> Bereid hydrofoob glas dia&#39;s. Plaats schoon glas dia&#39;s in een glazen schaal in een vacuüm oven. Verwarm tot 80 ° C gedurende 30 minuten volledig drogen van de oppervlakken. Plaats schotel met dia&#39;s in een zuurkast en voeg 250 ul Sigmacote aan elke dia, zachtjes wiegen gedurende 30 seconden de vacht gehele oppervlak. Spoel de gecoate glaasjes met 100% methanol, gevolgd door wassen in gedestilleerd water, weken tweemaal gedurende 5 min in Least 10 ml. </li><li> Snijd siliconen afstandhouders (0,8 mm dik) met 10 mm biopsie punches. </li><li> Autoclaaf de siliconen afstandhouders en Sigmacote behandelde glazen dia&#39;s. </li><li> Formuleren oplossingen voor elke respectieve laag in afzonderlijke microfugebuizen door mengen PEG-diacrylaat (PEGda) precursor (eindconcentratie 15% w / v) met verschillende hoeveelheden iodixanol (60% voorraadoplossing in water) in verschillende eindconcentraties (bijv. 40% opbrengst, 30%, 20% en 10%), aanvulling van het resterende volume met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossingen van graded dichtheden. Op soortgelijke wijze, afwisselende lagen te mengen aPEG-RGDS-350 (eindconcentratie 8 mM) met PBS en iodixanol geven verschillende concentraties (bijv. 35%, 25% en 15%). </li><li> Voeg fotoinitiator (2-hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon, 333mg/ml stock in N-vinylpyrrolidon) aan elke oplossing voor verschillende lagen (10 ul voorraadoplossing per ml van elke laag oplossing). Fotoinitiator is toegevoegd laatste polymerisatie te voorkomen vóór gelaagdheid van de gels in de matrijs, omdat het lichtgevoelig. </li><li> Volgende stappen van dit protocol wordt uitgevoerd in een bioveiligheid kast steriliteit. </li><li> Filter-steriliseer elke oplossing met een steriele spuit van 1 ml en 0,2 um filter. Monteer de mal setup door daartussen de spacer tussen twee Sigmacore behandelde glasplaatjes en veilig klemmen plaatsen zoals in figuur 1. </li><li> Zet de gelaagde gels door toevoeging van de dichtste oplossing (bijvoorbeeld PEGda met 40% iodixanol), gevolgd door een minder dichte oplossing (bijvoorbeeld aPEG-RGDS-350 met 35% iodixanol). Herhaal de alternatieve laagjes om meerdere lagen gewenste samenstelling en dichtheden te bereiken zoals getoond in figuur 1. </li><li> Bestralen de mal met 365 nm licht gedurende 3 min met behulp van een draagbare UVR-9000 lamp. Laat de gepolymeriseerde gels uitharden 5 min. Verwijder de kabels, dan til het bovenste glasdia en de mal, de gelaagde dGMP gels blijven op de dia&#39;s. Met een steriele spatel leg de gels in een 50 ml buis met steriele PBS of het kweekmedium voor de was. </li><li> Was de gepolymeriseerde gels in PBS bij 1.000:1 volumeverhouding, uitwisselen van buffer ten minste tweemaal per dag de dichtheid modifier, fotoinitiator en gereageerd hebbend polymeer te verwijderen. Alternatief kan worden uitgewisseld met PBS celgroei medium. Sla de dGMP gels in PBS of groeimedium voor de celkweek experiment beschreven in stap 3. </li><li> Om afwisselende lagen zichtbaar te maken, te regelen dGMP gel (deze gels zijn niet bruikbaar voor celcultuur) langs een liniaal op het monster plateau van een VersaDoc gel documentatie-eenheid. Bloot gels in 350 nm, de belichtingstijd afhankelijk van de concentratie van de fluorofoor. Afwisselend donkere en blauwe banden in de hydrogel dGMP aantonen vorming van discrete lagen van verschillende chemische samenstelling (figuur 3). </li></ol><ol><li> Voor gels waarin RGDS peptide gebruikt adhesieafhankelijke cellen, zoals myoblasten C2C12. </li><li> Steek dGMP gels (opgeslagen in PBS) in de putjes van 48-well platen celkweek met een steriele celschraper in een bioveiligheid kast. </li><li> Voorverwarmen groeimedium (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium of DMEM aangevuld met 10% v / v foetaal runderserum en 1% v / v 100x penicilline-streptomycine oplossing) en PBS in een waterbad ingesteld op 37 ° C. </li><li> Was een 60% confluente platen (10 mm) van C2C12 cellen drie keer met PBS. Aspireren uit PBS en oogst cellen door toevoeging van 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA en incubatie bij 37 ° C gedurende 2 minuten. Resuspendeer de cellen in groeimedium en tellen cellen. Zaad dGMP gel bevattende celkweek goed met C2C12 myoblasten (20.000 cellen / cm 2). Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 / 95% relatieve vochtigheid. Voorzichtig uitwisselingsmedium na 4 uur, voorzichtig opnieuwbewegen lichtjes aangehouden cellen. </li><li> Na 24 uur wordt de bijlage van C2C12 myoblasten de RGDS-bevattende lagen dGMP gels worden bevestigd door epifluorescentie en fasecontrastmicroscopie (Zeiss Axiovert 200). </li></ol>

<ol><li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li>
<li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li>
<li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li>
<li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly%28ethylene+glycol%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li>
<li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li>
<li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft%2C+Bilayered+Drosophila+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)"> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.

DGMP is een eenvoudige strategie voor het bereiden meerlaagse gels die niet vertrouwen op dure instrumentatie. Dit protocol kan worden aangepast voor het maken van steigers met andere biocompatibele materialen, zoals collageen en hyaluronzuur. Bioactieve kleine moleculen, bijvoorbeeld cel adhesie bevorderende peptide RGDS kan worden gebonden aan de polymere matrix om mengen van signalen tussen de lagen. Eiwitten kunnen worden opgenomen in afzonderlijke lagen zonder chemische conjugatie zij, afhankelijk van de matrix maaswijdte, zijn minder gevoelig voor diffunderen door hydrogels 10. Hier gebruikte iodixanol (Nycoprep), een inert dichtheid modifier, die eerder is gebruikt voor levensvatbare cellen toepassingen. Andere modifiers dichtheid zoals sucrose en dextrose kan ook worden gebruikt. Door het variëren van de afwikkeling van de tijd (t s), kan men afstemmen van de interfaces tussen twee lagen op gladde of scherpe overgangen te produceren als dat nodig is (langere inwerktijd zorgt voor een soepeler overgangen) &lt;sup&gt; 10. Zo zou vloeiender overgangen tussen dGMP gel lagen worden gebruikt om een ​​continue gradiënt van een biologische cue naar cel processen zoals chemotaxis bestuderen genereren. Het effect van de dichtheid op modifier gel stijfheid is getoond in figuur 5 voor een 15% aPEGda gel, een volledige karakterisering van stijfheid en porositeit als functie van PEGda en iodixanol concentraties wordt momenteel geëvalueerd. Terwijl de PEGda concentratie in dit voorbeeld relatief hoog zagen we een 60% grotere elasticiteitsmodulus in gels met 30% vergeleken met gels iodixanol zonder. De verandering in gel stijfheid kan worden aangepast door het moduleren van het macromeer concentratie of verknopingsdichtheid. We hebben ook toegepast dGMP techniek 3D meerlagige gels met polyacrylamide en PEG 10 precursors creëren. Variëren van de concentratie of de mate van verknoping van het prepolymeer kan structurele variatie in descaffolds die gebruikt kan worden om cel gedrag zoals gepolariseerde groei en migratie in 3D onderzoeken. Samengevat, dGMP is een flexibel techniek die kan worden toegepast op 2D en 3D scaffolds fabriceren van verschillende biocompatibele materialen voor een brede waaier van biomedische toepassingen en fundamenteel onderzoek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens of instrument </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Polyethyleenglycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene glycol diacrylaat (PEGda) </td><td> Dajac Labs </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> Arginine-Glycine-Asparaginezuur-Serine (RGDS) </td><td> American Peptide </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - Diisopropylethylamine (DIPEA) </td><td> Sigma </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimethylformamide (DMF) </td><td> Visser </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetrahydrofuran (THF) </td><td> Visser </td><td> T397 </td></tr><tr><td> Dialyse cassette (3500Da) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 carbonzuur ester succinimydyl </td><td> Life Technologies </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> Silicone afstandhouders </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> Biopsie punches </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 mm) P850 (8 mm) </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> Visser </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2-Hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon </td><td> Sigma </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) </td><td> Life Technologies </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Life Technologies </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasten </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> Bio-Rad </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

dichtheidsgradiënt meerlaagse polymerisatie (dgmp): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, aanpasbare steigers for tissue engineering

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Weefselkweek complexe matrices, waarbij typen en concentraties van biologische stimuli (bijvoorbeeld groeifactoren, remmers of kleine moleculen) of matrix structuur (bijvoorbeeld samenstelling, concentratie of stijfheid van de matrix) variëren ruimte kan zorgen diverse onderzoeken over hoe deze variabelen cel differentiatie, migratie en andere fenomenen beïnvloeden. De grote uitdaging in het creëren van gelaagde matrices is het handhaven van de structurele integriteit van de laag-interfaces zonder diffusie van afzonderlijke onderdelen van elke laag 1. Huidige methoden om dit te bereiken zijn onder andere photopatterning 2-3, lithografie 4, sequentiële functionalization5, vriesdrogen 6, microfluidics 7 of centrifugeren 8, waarvan vele vereisen geavanceerde instrumentatie en technische vaardigheden. Anderen vertrouwen op sequentiële bevestiging van afzonderlijke lagen, hetgeen kan leiden tot delaminatie van lagen 9 </sup&gt;. DGMP overwint deze problemen door gebruik van een inert dichtheid modificator zoals iodixanol op lagen van verschillende dichtheden 10 maken. Aangezien de dichtheid modifier kan worden gemengd met een polymeer of bioactieve molecule, dGMP kan elke steiger lagen kunnen worden aangepast. Gewoon variëren van de concentratie van de dichtheid modifier voorkomt vermenging van aangrenzende lagen gedurende het verblijf waterige. Volgende stap polymerisatie leidt tot een structureel continue meerlaagse scaffold, waarbij elke laag verschillende chemische en mechanische eigenschappen. De dichtheid modifier kan gemakkelijk worden verwijderd met voldoende spoelen zonder verstoring van de afzonderlijke lagen of componenten. Deze techniek is daarom zeer geschikt voor het maken van hydrogels van verschillende afmetingen, vormen en materialen. Een protocol voor het vervaardigen van een 2D-polyethyleenglycol (PEG) gel, waarbij afwisselende lagen bevatten RGDS-350, wordt hieronder beschreven. We gebruiken PEG banwege het is biocompatibel en inert. RGDS een celadhesie peptide 11 wordt gebruikt om ruimtelijke beperking van een biologische cue tonen en de conjugatie van een fluorofoor (Alexa Fluor 350) kunnen we visueel onderscheiden verschillende lagen. Deze procedure kan worden aangepast voor andere materialen (bijv. collageen, hyaluronzuur, etc.) en kan worden uitgebreid tot 3D gels fabriceren met enkele wijzigingen 10.

MALDI-TOF analyse bevestigt de conjugatie van peptide RGDS acryloyl-PEG (Figuur 2). Gel imaging onthult afwisselend RGDS-350 (blauw) lagen na fotopolymerisatie (Figuur 3A). Zoals getoond in figuur 3A, kan 2D dGMP gel grootte worden gevarieerd afhankelijk van de diameter van de silicone mallen (10 mm, links, 8 mm, rechts), en zijn daarom gemakkelijk aanpasbaar voor gebruik in meerdere assays - in dit geval een passend 48 well celkweekplaat (Figuur 3B). Epifluorescentie en fasecontrastmicroscopie van C2C12 myoblasten gekweekt op een dGMP gel toont selectieve aanhechting op RGDS-350-bevattende PEG lagen (figuur 4), waaruit compartimentering van de celadhesie peptide (RGDS). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> Figuur 1. Moleculaire Weight analyse door MALDI-TOF vergelijken aPEG-SCM aan aPEG-RGDS verkregen na conjugatie van RGDS peptide. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> Figuur 2. Schematische weergave van dGMP gel fabricage. Nadat de hellingen gestapeld zijn, kunnen ze bezinken gedurende verschillende perioden (t s) graduele interfaces, gevolgd door fotopolymerisatie te maken. Gestratificeerde dGMP gels kan gemakkelijk worden geëxtraheerd uit de mal voor verder gebruik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. A) 2D meerlaags gels verkregen na fotopolymerisatie afgebeeld met behulp van 350 nm en wit licht kanalen van VersaDoc gel documentatie-eenheid. De afbeelding met grijswaarden toont afwisselende lagen bevatten RGDS in het wit. B) Het inbrengen van dGMP gel in 48-well celkweek gerechten. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Samengevoegd fase contrast en epifluorescentie beeld van C2C12 myoblasten gegroeid op dGMP gels (schaalbalk 50 pm). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Effect van iodixanol op gel oppervlak elasticiteit. Atomic force microscopie metingen van statische monsters van verknoopt PEG substraten met behulp van eerder vastgestelde methoden met een 2 nN kracht trekker 12. * P &lt;0,05 en ** p &lt;0,01.

Hier beschrijven we een unieke strategie voor het maken van biocompatibele, gelaagde matrices met continue interfaces tussen verschillende lagen van tissue engineering. Een dergelijke steiger kan een ideale aanpasbare omgeving te moduleren cel gedrag van verschillende biologische, chemische of mechanische signalen

Dichtheidsgradiënt Meerlaagse polymerisatie (dGMP): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, Aanpasbare Steigers for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Het algemene doel van deze procedure is om een meerlagig celcultuurscaffold te creëren. Deze video zal laten zien hoe je een 2D-celcultuurmatrix produceert, waarbij het adhesiepeptide RGDS in afwisselende lagen wordt opgenomen om regio's van C two C 12-cellen te scheiden. Dit wordt bereikt door eerst het RGDS-peptide aan een acro loyal macro te bevestigen.De macro peptidecombinatie wordt vervolgens getagd met de LOR-kleurstof om visualisatie van de peptidbevattende lagen van de meerlagige gels mogelijk te maken. De tweede stap is om de mallen te vormen door ze uit een siliconenplaat te snijden en ze tussen twee glasplaatjes te plaatsen, na het vooraf mengen van de afzonderlijke componenten van elke laag. Oplossingen van peg di acrl en peg di acrl met PEG RGDS Alexa drie 50 worden afwisselend gelaagd binnen de mallen.Gels worden gepolymeriseerd door UV-bestraling. De laatste stap is om C two C 12-cellen op 2D-meerlaagse gels te zaaien om te onderzoeken hoe de samenstelling van de matrix de groei en hechting van de cellen beïnvloedt. Uiteindelijk worden brightfield- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de selectieve groei van C two C 12-cellen op de scaffolds te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat het een eenvoudige en kosteneffectieve methode is voor het creëren van meerlaagse 2D- en 3D-celcultuurmatrices. Het is niet afhankelijk van dure instrumentatie. Terwijl de interfaces tussen de lagen aaneengesloten en structureel integraal zijn.Er is geen vermenging tussen componenten van individuele lagen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, zoals hoe cellen migreren en polariseren in reactie op gepatroneerde biologische, chemische en mechanische signalen. Deze methode kan zachte inzichten geven in celmigratie en differentiatie en kan worden toegepast op andere systemen, zoals het richten van nieuwe rechtuitgroei en synaptogenese van neurale stamcellen.Om deze procedure te beginnen, combineer RGDS-peptide en acro olie peg succinyl carbo methyl ester in een één op twee op één molaire verhouding in droog DMSO onder Argonne. Voeg vervolgens NN diop, propyl methylamine of D-I-P-E-A toe in een twee op één molaire verhouding ten opzichte van de aquilo PEG SCM om de reactie te vergemakkelijken, bevestig de conjugatie van het aquilo PEG RGDS-molecuul met behulp van moldy TOF-massaspectrometrie. Hiervoor apart, voeg één microliter van de AQUILO PEG RGDS-reactieoplossing en één microliter van onreagerend aquilo PEG SCM toe aan verschillende plekken op het moldy doelwit.Laat ze beide drogen. Bereid vervolgens een verzadigde oplossing van universele moldy matrix in THF voor en voeg één microliter toe aan dezelfde twee plekken. Laat ze beiden drogen.Laad vervolgens de monsters. Voer moldy tough-analyse uit met een 60 hertz-laser bij ongeveer 19% vermogen met behulp van SAVIS gole smoothing top hat baseline subtraction en OID peak detection-algoritmen. Het molecuulgewicht van acro PEG RGDS zou naar rechts moeten verschuiven, overeenkomend met de verandering in massa als gevolg van covalent gebonden peptide.De volgende stap is om de Fluor te conjugeren door een ekvimolaire hoeveelheid van LOR drie 50 carboxylzuur in een midal-ester toe te voegen ten opzichte van de aquilo PEG SCM opgelost in een minimale hoeveelheid DMSO aan de aquilo PEG RGDS-reactieoplossing. Onder argon incuberen overnacht bij kamertemperatuur. Zuiver vervolgens de acro olie peg RGD S3 50 door dialyse tegen verfwater bij vier graden Celsius met behulp van een 3.500 DAU molecuulgewicht cut-off dialysecassette. Ga door met dialyseren gedurende 48 uur met een 1001 volumeverhouding, waarbij koud dialysaat minstens twee keer per dag wordt ververst.Het product wordt verder gezuiverd door filtersterilisatie door een 0,22 micrometer-spuitfilter. Ten slotte, in een steriele omgeving, verdeel de steriele gezuiverde acro olie peg RGD S3 50 in steriele voorgewogen microcentrifugebuisjes. Sluit de open microcentrifugebuisjes af met steriele ademhalingsbuisjes.Vriesdroog de monsters en bewaar ze met paraffinefolie afgesloten bij min 20 graden Celsius. Was de plaatjes vooraf in 100% methanol en droog ze in een oven bij 80 graden Celsius totdat de vloeistof is verdampt. Plaats vervolgens een schaal met de glasplaatjes in een afzuigkap en voeg 250 microliter sigma coat toe aan elke plaat.Schud de plaatjes voorzichtig gedurende 30 seconden om het hele oppervlak te bedekken. Spoel vervolgens de beklede plaatjes grondig met 100% methanol, gevolgd door wassen en gedistilleerd water, door ze twee keer gedurende vijf minuten in ten minste 10 milliliter water te laten weken. Laat de plaatjes vervolgens aan de lucht drogen.Maak siliconen ruimtes van 0,8 millimeter dik door een blad siliconen tot dezelfde afmetingen als de glasplaatjes bij te snijden. Maak vervolgens met biopsiepunches 10 millimeter of acht millimeter gaten in de siliconen om de scaffolds te houden met behulp van een scheermes. Maak kanalen van ongeveer twee millimeter aan de bovenkant van de mal om de toevoeging van het scaffoldmateriaal mogelijk te maken.Autoclaveer vervolgens de siliconen ruimtes en de met sigma coat behandelde glasplaatjes om ze te steriliseren. Steriliseer ook aanvullende materialen voor het gieten van de gels, zoals einorbuisjes en pincetten. In een weefselkweekkap steriliseer een voorraadoplossing van Peg di aquil met behulp van een steriele 1 milliliter spuit en een 0,2 micron filter.Begin met het formuleren van PEG-prepolymeeroplossingen bij een gewicht-volumeverhouding van 15% voor elke respectieve laag in afzonderlijke amberkleurige microafvalbuisjes door de 50%PEG D acrl te combineren met verschillende hoeveelheden steriele 60%IO DAL-voorraadoplossing, PBS en foto-initiator om verschillende eindconcentraties van 10% 20% 30% en 40% I oal te verkrijgen. Meng de oplossingen grondig om de fluorescent gelabelde 15%

density-gradient-multilayered-polymerization-dgmp-novel-technique-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid...

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Synthese en de fabricage van electrospun lange vezels verspreid over een grotere storting gebied via een nieuw ontworpen verzamelaar uit een roman biologisch afbreekbaar polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) werd gemeld. De vezels waren in staat de groei van cellen afkomstig van muizen pluripotente stamcellen ondersteunen.

Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen

Scaffolds voor weefselengineering moeten het complexe biochemische en biofysische micro-omgeving van de cellulaire niche nabootsen. Hier laten we het gebruik van interfaciale polyelektrolytcomplexatievezels zien als een platform om samengestelde, meercomponenten polymeer scaffolds met aanhoudende biochemische afgifte te creëren.

Composiet Steigers van Interfacial Polyelectrolyte vezels voor stoffelijk Controlled Release van biomoleculen

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

In dit werk werden poly(melkzuur)/polyethyleenglycol (PLA/PEG) scaffolds bereid door gebruik te maken van een combinatie van smeltmengen en selectieve uitloging. De hier besproken methode maakte het mogelijk om drie-laags scaffolds te ontwikkelen door zowel de porositeit als de poriëngrootte nauwkeurig te beheersen. De mechanische eigenschappen werden ook geëvalueerd in een fysiologische omgeving.

Een Facile en Eco-vriendelijke Route naar Poly (melkzuur) Steigers met Graded Pore Size Fabriceer

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Actuele modellen van de cultuur van de dubbelgelaagde toegestaan niet voor functionele in vitro studies die in vivo microenvironments na te bootsen. Met behulp van polyethyleenglycol en een methode van zinkoxide templating, beschrijft dit protocol de ontwikkeling van een uiterst dunne biomimetische kelder membraan met afstembare stijfheid, porositeit en biochemische samenstelling die nauw samen van de Nabootsers van in vivo extracellulaire matrices.

Uiterst dunne Porated elastisch Hydrogels als biomimetische kelder membraan voor Dual cel cultuur

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Leer hoe je met dGMP meerdere compartimenten maakt voor tissue engineering. Deze kosteneffectieve methode creëert biocompatibele, gelaagde 2D- en 3D-matrices zonder dure instrumenten.

Dichtheidsgradiënt Meerlaagse polymerisatie (dGMP): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, Aanpasbare Steigers for Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal

Dichtheidsgradiënt Meerlaagse polymerisatie (dGMP): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, Aanpasbare Steigers for Tissue Engineering

Meer video's verkennen