Dichtheidsgradiënt Meerlaagse polymerisatie (dGMP): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, Aanpasbare Steigers for Tissue Engineering

Het algemene doel van deze procedure is om een meerlagig celcultuurscaffold te creëren. Deze video zal laten zien hoe je een 2D-celcultuurmatrix produceert, waarbij het adhesiepeptide RGDS in afwisselende lagen wordt opgenomen om regio's van C two C 12-cellen te scheiden. Dit wordt bereikt door eerst het RGDS-peptide aan een acro loyal macro te bevestigen.

De macro peptidecombinatie wordt vervolgens getagd met de LOR-kleurstof om visualisatie van de peptidbevattende lagen van de meerlagige gels mogelijk te maken. De tweede stap is om de mallen te vormen door ze uit een siliconenplaat te snijden en ze tussen twee glasplaatjes te plaatsen, na het vooraf mengen van de afzonderlijke componenten van elke laag. Oplossingen van peg di acrl en peg di acrl met PEG RGDS Alexa drie 50 worden afwisselend gelaagd binnen de mallen.

Gels worden gepolymeriseerd door UV-bestraling. De laatste stap is om C two C 12-cellen op 2D-meerlaagse gels te zaaien om te onderzoeken hoe de samenstelling van de matrix de groei en hechting van de cellen beïnvloedt. Uiteindelijk worden brightfield- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de selectieve groei van C two C 12-cellen op de scaffolds te visualiseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat het een eenvoudige en kosteneffectieve methode is voor het creëren van meerlaagse 2D- en 3D-celcultuurmatrices. Het is niet afhankelijk van dure instrumentatie. Terwijl de interfaces tussen de lagen aaneengesloten en structureel integraal zijn.

Er is geen vermenging tussen componenten van individuele lagen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, zoals hoe cellen migreren en polariseren in reactie op gepatroneerde biologische, chemische en mechanische signalen. Deze methode kan zachte inzichten geven in celmigratie en differentiatie en kan worden toegepast op andere systemen, zoals het richten van nieuwe rechtuitgroei en synaptogenese van neurale stamcellen.

Om deze procedure te beginnen, combineer RGDS-peptide en acro olie peg succinyl carbo methyl ester in een één op twee op één molaire verhouding in droog DMSO onder Argonne. Voeg vervolgens NN diop, propyl methylamine of D-I-P-E-A toe in een twee op één molaire verhouding ten opzichte van de aquilo PEG SCM om de reactie te vergemakkelijken, bevestig de conjugatie van het aquilo PEG RGDS-molecuul met behulp van moldy TOF-massaspectrometrie. Hiervoor apart, voeg één microliter van de AQUILO PEG RGDS-reactieoplossing en één microliter van onreagerend aquilo PEG SCM toe aan verschillende plekken op het moldy doelwit.

Laat ze beide drogen. Bereid vervolgens een verzadigde oplossing van universele moldy matrix in THF voor en voeg één microliter toe aan dezelfde twee plekken. Laat ze beiden drogen.

Laad vervolgens de monsters. Voer moldy tough-analyse uit met een 60 hertz-laser bij ongeveer 19% vermogen met behulp van SAVIS gole smoothing top hat baseline subtraction en OID peak detection-algoritmen. Het molecuulgewicht van acro PEG RGDS zou naar rechts moeten verschuiven, overeenkomend met de verandering in massa als gevolg van covalent gebonden peptide.

De volgende stap is om de Fluor te conjugeren door een ekvimolaire hoeveelheid van LOR drie 50 carboxylzuur in een midal-ester toe te voegen ten opzichte van de aquilo PEG SCM opgelost in een minimale hoeveelheid DMSO aan de aquilo PEG RGDS-reactieoplossing. Onder argon incuberen overnacht bij kamertemperatuur. Zuiver vervolgens de acro olie peg RGD S3 50 door dialyse tegen verfwater bij vier graden Celsius met behulp van een 3.500 DAU molecuulgewicht cut-off dialysecassette. Ga door met dialyseren gedurende 48 uur met een 1001 volumeverhouding, waarbij koud dialysaat minstens twee keer per dag wordt ververst.

Het product wordt verder gezuiverd door filtersterilisatie door een 0,22 micrometer-spuitfilter. Ten slotte, in een steriele omgeving, verdeel de steriele gezuiverde acro olie peg RGD S3 50 in steriele voorgewogen microcentrifugebuisjes. Sluit de open microcentrifugebuisjes af met steriele ademhalingsbuisjes.

Vriesdroog de monsters en bewaar ze met paraffinefolie afgesloten bij min 20 graden Celsius. Was de plaatjes vooraf in 100% methanol en droog ze in een oven bij 80 graden Celsius totdat de vloeistof is verdampt. Plaats vervolgens een schaal met de glasplaatjes in een afzuigkap en voeg 250 microliter sigma coat toe aan elke plaat.

Schud de plaatjes voorzichtig gedurende 30 seconden om het hele oppervlak te bedekken. Spoel vervolgens de beklede plaatjes grondig met 100% methanol, gevolgd door wassen en gedistilleerd water, door ze twee keer gedurende vijf minuten in ten minste 10 milliliter water te laten weken. Laat de plaatjes vervolgens aan de lucht drogen.

Maak siliconen ruimtes van 0,8 millimeter dik door een blad siliconen tot dezelfde afmetingen als de glasplaatjes bij te snijden. Maak vervolgens met biopsiepunches 10 millimeter of acht millimeter gaten in de siliconen om de scaffolds te houden met behulp van een scheermes. Maak kanalen van ongeveer twee millimeter aan de bovenkant van de mal om de toevoeging van het scaffoldmateriaal mogelijk te maken.

Autoclaveer vervolgens de siliconen ruimtes en de met sigma coat behandelde glasplaatjes om ze te steriliseren. Steriliseer ook aanvullende materialen voor het gieten van de gels, zoals einorbuisjes en pincetten. In een weefselkweekkap steriliseer een voorraadoplossing van Peg di aquil met behulp van een steriele 1 milliliter spuit en een 0,2 micron filter.

Begin met het formuleren van PEG-prepolymeeroplossingen bij een gewicht-volumeverhouding van 15% voor elke respectieve laag in afzonderlijke amberkleurige microafvalbuisjes door de 50%PEG D acrl te combineren met verschillende hoeveelheden steriele 60%IO DAL-voorraadoplossing, PBS en foto-initiator om verschillende eindconcentraties van 10% 20% 30% en 40% I oal te verkrijgen. Meng de oplossingen grondig om de fluorescent gelabelde 15%