LeafJ: Een ImageJ Plugin voor Semi-automatische bladvorm Meting
21 januari 2013
Demonstratie van de belangrijkste methoden voor hoge doorvoer blad metingen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om blad fenotypering te versnellen bij het bestuderen van veel plant-mutanten of anderszins zeefinstallaties door vleugel fenotype.
Het doel van deze procedure is om de meting van bladvorm te automatiseren voor experimenten met hoge doorvoer. Dit wordt bereikt door eerst de bladeren te dissekeren en ze af te beelden met een flatbedscanner. De tweede stap van de procedure is om de leaf J plugin te gebruiken om de bladeren te detecteren en te meten.
De derde stap is om de bladeren voor te bereiden voor microscopie en ze te fotograferen met behulp van een compound microscoop. De laatste stap is om verkooplijnen op de verkregen afbeeldingen te traceren met behulp van een touchscreen tablet. Uiteindelijk kunnen de resultaten verschillen in bladvorm, celgrootte en celaantal tonen door deze combinatie van beeldanalyse.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is de snelheid. Het is ongeveer zes keer sneller dan handmatige meting. Individuen wisten dat deze methode het moeilijk zou kunnen hebben omdat de juiste plaatsing van bladeren cruciaal is voor downstream-analyse en omdat het plaatsen van bladeren op dia's technisch een uitdaging kan zijn.
Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik me realiseerde dat we ongeveer 15.000 bladeren moesten analyseren, en dat met de hand doen zou vele maanden duren en ongelooflijk saai zijn, waardoor de plantdissectietechniek neuro zue zou veroorzaken. Een onderzoekswetenschapper uit mijn laboratorium begon met het voorbereiden van 8,5 bij 11 inch transparante vellen. Elk blad moet worden opgesplitst in rechthoekige frames, groot genoeg om de bladeren van een plant te herbergen, tweede transparantieblad taps toelopend naar de bedrukte blad om als deksel te dienen om te voorkomen dat de bladeren uitdrogen.
Label met de plant, genotype en groeiconditiegegevens. Dissecteer de bladeren van de 26e dagle plants. Schik de bladeren op de transparantie in tactische volgorde van jongste naar oudste.
Plaats de bladeren verticaal binnen het frame zonder de rand aan te raken of andere bladeren te overlappen. Anders zullen er problemen ontstaan. Tijdens de analyse is het belangrijk om bladeren verticaal te richten, niet aanrakend, frame, niet overlappend Met de bladeren geregeld. Verdeel ze met de tweede lege transparantie en een rek om de bladeren plat te houden.
Genereer vervolgens een afbeelding met behulp van een flatbedscanner met een resolutie van minimaal 600 punten per inch. Begin met het installeren van de plugin. Download image J en sleep het leaf jja-bestand naar de plugins-map van image J. Wanneer image J wordt gebruikt, zal de leaf J plugin nu beschikbaar zijn.
Ga door met het openen van het bladafbeeldingsbestand in image J. Zorg ervoor dat image J versie 1.45 s of later is. Verdeel de afbeelding in drie kleurkanalen, rood, groen en blauw door op afbeeldkleursplitskanalen te klikken. Pas vervolgens een drempel toe op de afbeelding in het blauwe kanaal.
Selecteer nu alle bladeren van één plant met behulp van de rechthoekige selectietool en selecteer vervolgens de leaf J plugin. De plugin opent nu een vak waarin de verschillende omstandigheden van het experiment kunnen worden ingesteld, zoals een experimentele groep en genotype. Bewerk deze opties voordat u doorgaat, selecteer vervolgens de omstandigheden voor geselecteerde bladeren in het gebied van belang en geef een beschrijvende naam.
Druk op doorgaan en leaf J zal automatisch elke blad met een unieke ROI-afbeelding omlijnen. J routines passen in ellips tot de mes en berekenen de grote en kleine assen van die ellips indien nodig. Bewerk de traceerlijnen van het gebruik van het ROI manager-venster.
Een touchscreen-tablet aangesloten als externe monitor kan nuttig zijn voor deze procedure. Met de grenzen correct gedefinieerd, voert u de analyse uit door te drukken. Oké, nu geeft leaf J de bladlengte en verschillende geometrieën van de bladmes uit.
Uiteindelijk exporteert u de meetresultaten en bijbehorende informatie naar een spreadsheet. Na het scannen van de bladeren, fixeer ze in F-A-A-F-A. Een vaste bladeren kan tot zes maanden op vier graden Celsius worden bewaard.
Een uur of twee voor het afbeelden van de bladeren, verhelder de bladeren door de FAA-fixeervloeistof te veranderen in chloorhydraat-oplossing. Eenmaal verhelderd, monteer bladeren op dia's met trichomen omhoog met 40 x vergroting op een compound microscoop afbeelding, de mesil-laag van het midden van elk blad aan weerszijden van de hoofdnerf, cellen vermijden in de buurt van trichomen of aderen. Om moeilijkheden bij de beeldverwerking te voorkomen, is het belangrijk om alle luchtbellen van dia's te verwijderen bij het monteren van bladeren en ook om scherpe afbeeldingen in de volgende stap te krijgen.
Na het verzamelen van de gewenste afbeeldingen, opent u er een in image J en traceert u de celcontouren van de blad door image JROI manager tool met behulp van de touchscreen tablet en een stylus. Dit maakt geen gebruik van de LEAF J plugin. Voordat LEAF J werd gebruikt voor experimenten, werd de nauwkeurigheid en snelheid van de plugin vergeleken met die van een ervaren onderzoeker. Algemeen.
Leaf J finishte 5,7 sneller dan de handmatige berekeningen en het vergelijken van de gegevens van de twee methoden toonde aan dat de resultaten nauw gecorreleerd waren voor alle gemeten parameters van de 3.532 vergeleken. Gegevenspunten 172 waren buitenstaanders. Van deze buitenstaanders werden er 29 veroorzaakt door de LEAF J plugin, veel minder dan de 143 veroorzaakt door menselijke fouten.
Tijdens handmatige meting is leaf J sindsdien bijgewerkt om het aantal fouten verder te verminderen. Met vertrouwen in LEAF J metingen, werd het gebruikt om schaduwbuikgevoel te testen met behulp van een gemengd effectenmodel. Behandeling en bladnummer waren vaste effecten en replicaat was als een willekeurig effect.
Veel parameters werden significant beïnvloed door schaduwbuikgevoel. Anderzijds werden sommige parameters niet significant beïnvloed door schaduw. Met behulp van een tablet geassisteerde beeldanalyse van celparameters, werden 67 genotypen van Arabidopsis ANA onderzocht, in totaal 8.629 cellen van 877 bladeren van 224 planten.
De genotypen werden vervolgens gegroepeerd in zes klassen. De meeste genotypen hebben een normale celgrootte en -aantal. Echter, sommige hadden een grotere celgro
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert belangrijke methoden voor high-throughput bladmetingen, bedoeld om het fenotyperen van bladeren in plantstudies te versnellen. De procedure omvat het afbeelden van gedissecteerde bladeren en het analyseren daarvan om verschillen in bladvorm en cellulaire kenmerken bloot te leggen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Plantenfenotypering
- Beeldanalyse
- Botanisch onderzoek
Achtergrond
- Het meten van de bladvorm is cruciaal voor het begrijpen van plantmutanten.
- High-throughput-methoden kunnen de screeningsefficiëntie verbeteren.
- Geautomatiseerde technieken verminderen de handmatige arbeid en verhogen de nauwkeurigheid.
- Beeldanalyse levert kwantitatieve gegevens over de bladmorfologie.
Doel van de studie
- Om de meting van de bladvorm te automatiseren voor high-throughput experimenten.
- Om de studie van plantmutanten te vergemakkelijken door middel van efficiënte fenotypering.
- Om de nauwkeurigheid van bladmetingen te verbeteren met behulp van geavanceerde imagingtechnieken.
Gebruikte methoden
- Dissectie van bladeren gevolgd door beeldvorming met een flatbedscanner.
- Gebruik van de leaf J-plugin voor detectie en meting.
- Voorbereiding van bladeren voor microscopie en fotografie.
- Het trekken van sellout-lijnen op afbeeldingen met een touchscreen-tablet.
Belangrijkste resultaten
- Verschillen in bladvorm tussen diverse plantmutanten aangetoond.
- Celgrootte en celaantal gekwantificeerd via beeldanalyse.
- Een gestroomlijnde methode geboden voor high-throughput fenotypering van bladeren.
- De effectiviteit van geautomatiseerde technieken in botanisch onderzoek aangetoond.
Conclusies
- High-throughput methoden verbeteren de fenotypering van bladeren aanzienlijk.
- Geautomatiseerde beeldanalyse is een waardevolle tool voor plantonderzoek.
- Toekomstige studies kunnen deze methoden benutten voor bredere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
High-throughput phenotypering versnelt de mapping van gen naar functie in de plantbiologie, wat target-validatie in de agrarische biotechnologie ondersteunt. Geautomatiseerde meting van de bladvorm en bladsteel maakt snelle screening van mutanten mogelijk onder omgevingsfactoren zoals schaduwvermijding. Deze aanpak verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij het koppelen van genotype aan fenotypische uitkomsten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via kwantitatieve analyse van de bladmorfologie.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de standaardisatie van metingen van de bladsteelengte en bladparameters.
- Voorspellende waarde: Verbetert de triage van de portfolio door bladkenmerken te correleren met genetische modificaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows voor compound-screening.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via semi-geautomatiseerde beeldanalyse.
- Schaalbaarheid: Maakt high-throughput evaluatie van bladfenotypen mogelijk over grote mutantpopulaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterellevante systemen door milieugevoelige kenmerken te meten, zoals schaduwgeïnduceerde bladsteelverlenging.
- Operationele waarde: Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via consistente kwantificering van bladkenmerken.
- Risicobeperking: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistische ambiguïteit bij fenotypische screening te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door hypothesetesten mogelijk te maken via geautomatiseerde kwantificatie van de bladmorfologie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door genetische perturbaties te koppelen aan meetbare veranderingen in de bladvorm.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in fenotyperings-screens.
- Analytics: Genereert statistische resultaten over bladsteel lengte, bladareaal en celmorfologie om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door milieu-responsieve bladkenmerken over verschillende genotypen heen te volgen.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor grootschalige bladfenotypering in meerdere projecten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelvalidatie door bladmetingen met een hoge nauwkeurigheid en een lage variantie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid, waardoor de handmatige inspanning met ~6x wordt verminderd in vergelijking met handmatige methoden.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door reproduceerbare fenotypische gegevens te leveren voor genetische screeningscampagnes.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genotypen mogelijk op basis van gekwantificeerde responsen van bladkenmerken.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in beeldanalyse en de voorbereiding van plantmonsters.
- Is afhankelijk van een flatbedscanner (≥600 DPI) en een touchscreen-tablet voor randcorrectie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de protocollen voor bladdissectie en het monteren van preparaten.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende bladafmetingen en modelsystemen buiten Arabidopsis.
- Wordt beperkt door technische uitdagingen bij het plaatsen van bladeren en het monteren van preparaten, wat de kwaliteit van de daaropvolgende analyse beïnvloedt.
