Name: Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer hoe je lokale geneesmiddeltoepassing combineert met patch clamp-opnamen om ligand-gated ionkanalen in neuronen van acute muizenhersensnedes te bestuderen. Deze methode onthult biophysische eigenschappen van native receptoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie ​​DA030396. Dankzij de leden van de Drenan lab voor nuttige discussie en kritiek op het manuscript. Speciale dank aan Mi Ran Kim voor technische bijstand en Jonathan Thomas Ting voor advies met betrekking tot volwassen hersenen van muizen plakjes.

1. Bereiding van oplossingen voor Brain Slice Voorbereiding en Elektrofysiologie <ol><li> Oplossingen voor bereiding van hersencoupes werden eerder beschreven 3, 4. Voorbereiden N-methyl-D glucamine (NMDG) gebaseerde snijden en herstel oplossing van de volgende samenstelling (in mM): 93 n-methyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na + ascorbaat, 2 thioureum, 3 Na + pyruvaat, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl2 • 2H 2 O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met NMDG. Breng de pH op 7,3-7,4 met 10 N HCl. <ol class="lalpha"><li> Los MgSO 4 • 7H 2 O en CaCl 2 • 2H 2 O in Millipore water tot 2 M voorraadoplossingen van elk merk. </li><li> Afgewogen andere componenten in de aangegeven volgorde en aan een maatkolf gedeeltelijk gevuld met Millipore water onder roeren op te lossen. Zodra alles is toegevoegd, vulmaatkolf met Millipore water. </li><li> Meet de pH en pas met 10 N HCl. </li><li> Meet de osmolariteit en stel met NMDG indien nodig. </li></ol></li><li> Bereid HEPES dat kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met de volgende samenstelling (in mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na + ascorbaat, 2 thioureum, 3 Na + pyruvaat, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met sucrose. Breng de pH op 7,3-7,4 met 1 N HCl of NaOH. <ol class="lalpha"><li> Afgewogen componenten in de aangegeven volgorde en aan een maatkolf gedeeltelijk gevuld met Millipore water onder roeren op te lossen. Zodra alles is toegevoegd, vul maatkolf met Millipore water. </li><li> Meet de pH en stel met NaOH of HCl, indien nodig. </li><li> Meet de osmolariteit en stel met sucrose indien nodig. </li></ol></li><li> Standaardformulieren aCSF opname oplossing van de volgende samenstelling (in mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 24 NaHCO3, 12,5 glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl2 • 2H 2 O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met sucrose. Breng de pH op 7,3-7,4 met 1 N HCl of NaOH. </li></ol> 2. Voorbereiding van Acute Brain Slices <ol><li> Brain slicen en terugwinning uitgevoerd zoals eerder beschreven 3, 4. Bubble twee kristallen schalen gevuld met NMDG recovery-oplossing met 95% zuurstof / 5% CO 2-gas (carbogen), een schotel op het ijs, de andere op 33 ° C. </li><li> Bubble een kristal schaal gevuld met HEPES houden aCSF met carbogen bij kamertemperatuur. </li><li> Verdoven volwassen muizen (2 tot 12 maanden) met Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip). Ga verder met procedure bij het dier heeft geen reactie op een teen-snuifje. </li><li> Indien nodig, knip een staart weefselmonster voor later genotypIng van het dier. </li><li> Open de borstholte, bloot te leggen het hart, en klem de aorta descendens. Verscheuren het rechter atrium. </li><li> Transcardiaal perfuseren dier met 5-10 ml van 0-4 ° C NMDG-recovery oplossing. </li><li> Onthoofden dier, de hersenen verwijderd en plaats het in 4 ° C NMDG-recovery oplossing gedurende 1 min. </li><li> Op een ijs-gekoeld metalen plaat, trim de hersenen in de gewenste richting (coronaal, parasagittal, horizontaal, enz.) om het gebied in de omgeving zijn. </li><li> Bevestig de hersenen blok met superlijm aan de droge fase oppervlak van een trillende snijmachine (DSK-Zero 1, Dosaka), dompel de hersenen blok in 4 ° C NMDG-recovery-oplossing, en continu zeepbel van de oplossing met carbogen. </li><li> Snijd plakjes van de hersenen gebied van belang. Plakdikte is 200-400 urn, afhankelijk van de specifieke hersengebied plaats, dierlijke leeftijd en experiment uit te voeren. </li><li> Onmiddellijk na het snijden, incubeer gewenste plakjes in carbogenated, 33 ° C NMDG-herstel Solutiop precies 12 minuten, vervolgens over te dragen aan carbogenated, kamertemperatuur HEPES houdt oplossing voor een eerste periode van 60 minuten. Na deze 60 min incubatie, kunnen segmenten gebruikt worden voor opname. Plakjes worden gehandhaafd HEPES oplossing die gedurende de dag tot ze worden gebruikt voor opname. </li></ol> 3. Patch Clamp Opnemen vanaf Neuronen in Brain Slices <ol><li> Trek een standaard patch micropipet met een programmeerbare Flaming-Brown trekker (Sutter P-97 of gelijkwaardig verticale trekker). Pipetten die optimaal zijn voor giga-ohm seal vorming gewoonlijk een weerstand van 4-6 MQ </li><li> Overdracht een schijfje naar de opname kamer (RC-27L; Warner Instruments) op het podium van een rechtopstaande microscoop (Nikon FN-1). Continu superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) het segment met carbogenated, standaardoptekenmodus aCSF verwarmd en op 32 ° C. Als alternatief kunnen segmenten worden op kamertemperatuur gehouden. </li><li> Zoek en het centrum van de hersenen gebied van belang met behulp vaneen 10X lucht doelstelling (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0,3; WD: 16 mm). </li><li> Visualiseer individuele neuronen met behulp van een 40x nabij-infrarood (IR) water immersie objectief (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) aangesloten op de IR-differentieel interferentie contrast (DIC) optiek en een high-speed nabij-infrarood Charged Coupled Device (CCD) videocamera (Hamamatsu C-7500). Onder IR-DIC observatie, gezonde neuronen vertonen een gladde, lichtgrijze plasmamembraan. </li><li> Vul een micropipet met een geschikte intracellulaire opnameoplossing. Voor de meeste toepassingen gebruiken we de volgende oplossing (in mM): 135 kalium gluconaat, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP en 0,1 (pH ingesteld op 7,25 met Tris base, osmolariteit aangepast tot 290 mOsm met sucrose). Opzetten van een whole-cell opname van een gevisualiseerd neuron. </li></ol> 4. Lokale toepassing van geneesmiddelen te Neuronen in Slices <ol><li> Trek een standaard patch clamp micropipet zoals hierboven beschreven. Gebruikeen pipet trekker zoals een Sutter P-97 dat twee identieke &quot;zuster&quot; tips uit hetzelfde stuk glas produceert is voordelig als multiple drug oplossingen worden gebruikt op dezelfde cel. Tipformaten dat een weerstand van ~ 5 MQ zouden hebben indien zij werden gevuld met het intracellulaire oplossing hierboven beschreven optimaal. </li><li> Backfill de micropipet met een oplossing van verdund geneesmiddel in carbogenated, standaardoptekenmodus aCSF. Naar beneden Richt de tip, en flick de drug gevulde micropipet om eventuele luchtbellen gevangen in de kolom van de oplossing te verwijderen. </li><li> Monteer het geneesmiddel gevulde micropipet in een pipethouder verbonden met een buis op een geschikte spanning uitwerpsysteem, zoals een Picospritzer III (General Valve Co.) De pipet houder wordt gemonteerd op een micromanipulator met dezelfde resolutie als manipulators gebruikt voor patch clamp-opname (bijvoorbeeld Sutter MP-285). Bovendien moet de manipulator mogelijk een diagonale beweging in en uit het segment. Manhandmatig uitwerpen druk 3 tot 4 keer in de micropipet om te bouwen voldoende druk achter de kolom van vloeistof. </li><li> Met behulp van de micromanipulator controles, laat het medicijn pipet in de plak, terwijl het visualiseren van de tip onder IR-DIC optiek. Idealiter zou een visueel herkennen en midden een neuron worden geregistreerd uit, gevolgd door plaatsing van het geneesmiddel pipet bij de cel voorafgaand aan het verlagen van de opname micropipet in de plak. Positioneren van de drug pipet kan beweging van weefsel in de nabijheid van de opgenomen cel die de opname kunnen verstoren als het geneesmiddel pipet wordt gebracht nadat een gigaohm afdichting. </li><li> IR met video, plaats het geneesmiddel micropipet op het bovenoppervlak van het weefsel slice. Voeren en een druk uitwerpen monitor 1) nabij de tip voor beweging van vuil over het uitwerpen, en 2) de micropipet tip op tekenen de punt verstopt of geblokkeerd. Als de tip verstopt is / verstopt, trek de pipette en vervang deze door een nieuwe. </li><li> Diagonaal benaderen opgenomen cel van de top van het segment zodanig dat wanneer de laatste plaats, de punt van het geneesmiddel gevulde pipet 1) in hetzelfde brandpuntvlak (of iets onder) de geregistreerde cel en de punt van de registratie-elektrode en 2) 10 tot 40 urn van de cel opgenomen. Als de drug gevulde pipet boven de cel opgenomen, kan de kracht van de druk uitwerpen verstoren gigaohm afdichting. </li><li> Noteer de gewenste cellulaire respons terwijl u de cel in spanning klem modus of stroomtang modus. We routinematig vastleggen acetylcholine en / of nicotine-opgewekt cellulaire stromen terwijl neuronen in spanningsklem modus. Hoewel druk uitwerpen kunnen handmatig worden geactiveerd wanneer een Picospritzer III, meer reproduceerbare resultaten verdient het aanbeveling de druk activeren uitwerpen met het meetsysteem (Axon Digidata 1440 en pClamp 10.3) met een digitale TTL pulse. </li></ol> 5. Controllingde Drug gevulde Micropipet met een piëzo-elektrische Vertaler <ol><li> Indien mogelijk dient het geneesmiddel gevulde pipethouder een eendimensionale piëzo vertaler (bijv. Piezojena PA-100 of Burleigh PZM-150) die in staat is het aanvaarden van een analoge ingangsspanning (weer van het acquisitiesysteem), die dan gemonteerd op de hoge-precisie micromanipulator (Sutter MP-285). Een piëzo-elektrisch vertaler is nuttig omdat de beweging van het geneesmiddel gevulde pipet in en uit het segment, zoals de timing en de snelheid van binnenkomst / uitgang, gemakkelijker worden gecontroleerd en gereproduceerd van experiment tot experiment. Bij het bestuderen nAChRs, de effecten van nicotine ongevoelig lekkage van het geneesmiddel gevulde pipet, moeten zij ooit voorkomen, worden geminimaliseerd wanneer de pipet wordt alleen verplaatst nabij de cel met een piëzo vertaler moment van uitwerpen druk. </li><li> Met behulp van de handmatig bestuurde potentiometer op de piëzo-elektrische spanning regelversterker, kiest u het voltagezijn maximale waarde. </li><li> Met de micromanipulator Plaats de drug gevulde pipet in het segment waar de pipet wordt de inhoud werpen op de gemaakte cel en trekken de pipet door handmatig reduceren van de spanning op nul piëzo spanning regelversterker. </li><li> Met een analoog uitgangssignaal van de opname acquisitiesysteem Verplaats de drug gevulde pipet in de plak gedurende 250 msec vanaf 300 msec voordat de druk uitstoten TTL pulse optreedt. Trek de pipet gedurende 250 msec, beginnend 50 msec na de TTL signaal eindigt. </li></ol>

<ol><li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activation+of+%3F4%2A+receptors%3A+sufficient+for+reward%2C+tolerance%2C+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized%2C+high-affinity+%3F6%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li>
<li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li>
<li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li>
<li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li>
<li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li>
<li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%3F4%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+selectively+enhances+%3F4%3F2%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li>
<li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+%CE%B16%CE%B24%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li>
<li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+%CE%B14%CE%B22%2A-%2C+%CE%B16%CE%B22%2A-%2C+%CE%B13%CE%B24%2A-+and+%CE%B17-nicotine+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+%CE%B16+and+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li>
<li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li>
<li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222(2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+tegmental+area+revisited%3A+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li>
<li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li>
<li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li>
<li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li>
<li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Paris%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li>
</ol>

De methode die in dit artikel is in grote lijnen bruikbaar voor het bestuderen van ligand-gated ionkanalen functie in de hersenen slice preparaat. Er zijn echter een aantal factoren die een belangrijke invloed op de kwaliteit en reproduceerbaarheid van experimentele gegevens die voortkomen uit het gebruik van deze methode. Bijvoorbeeld opgeroepen stromen erg gevoelig voor de diameter van de punt van het geneesmiddel gevulde pipet. Kleine tips zal leiden tot moeite met het uitwerpen van de drug oplossing, en grote tips m...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Naam van het reagens</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogusnummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-Methyl D-glucamine</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbaat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thioureum</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pyruvaat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech Pharmaceuticals</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kalium gluconaat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 Vibrating snijmachine</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown micropipet trekker</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27 Opnemen kamer</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344b Perfusie verwarming controller</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B Solution verwarming</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon FN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCD-Video-camera</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; Algemeen Valve Co</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 micromanipulator</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 Piëzo-elektrische vertaler</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 piëzo-versterker</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen slices studie

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Het gebruik van tabak leidt tot tal van gezondheidsproblemen, zoals kanker, hart-en vaatziekten, longemfyseem, en beroerte. Verslaving aan het roken van sigaretten is een wijdverspreide neuropsychiatrische aandoening die voortkomt uit de biofysische en cellulaire acties van nicotine op nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) in het hele centrale zenuwstelsel. Inzicht in de verschillende nAChR subtypes die bestaan ​​in hersengebieden die relevant zijn voor nicotine verslaving is een belangrijke prioriteit. Experimenten die elektrofysiologie technieken zoals whole-cell patch clamp of twee-elektrode spanningsklem opnames in dienst zijn nuttig voor farmacologische karakterisering van nAChRs van belang. Cellen die nAChRs, zoals zoogdieren weefselkweek cellen of Xenopus laevis oöcyten, zijn fysiek geïsoleerd en zijn dus gemakkelijk bestudeerd met behulp van de instrumenten van de moderne farmacologie. Er is veel vooruitgang gemaakt met behulp van deze technieken, in het bijzonder wanneer het doel-receptor werd al bekend eennd ectopische expressie werd gemakkelijk bereikt. Vaak echter moet nAChRs in hun oorspronkelijke omgeving studeren: in neuronen in hersencoupes acuut geoogst laboratorium muizen of ratten. Bijvoorbeeld, muizen die &quot;overgevoelig&quot; nAChR subunits zoals α4 L9&#39;A muizen 1 en α6 L9 MICE 2, zorgen voor eenduidige identificatie van neuronen basis van hun functionele expressie van een specifieke nAChR subeenheid. Hoewel whole-cell patch clamp opnamen van neuronen in de hersenen plakjes wordt routinematig gedaan door de deskundige elektrofysioloog, is het een uitdaging om lokaal toe te passen geneesmiddelen zoals acetylcholine of nicotine om de opgenomen cel binnen een brein slice. Verdunning van drugs in de superfusate (bad toepassing) is niet snel omkeerbaar, en U-buis systemen zijn niet gemakkelijk worden aangepast om te werken met de hersenen plakjes. In dit artikel beschrijven we een methode voor het snel aanbrengen nAChR-activerende drugs aan neuronen die in volwassen mOuse hersenen plakjes. Standaard whole-cell opnamen zijn gemaakt van neuronen in plakjes, en een tweede micropipet gevuld met een medicijn plaats wordt gemanoeuvreerd positie nabij de opgenomen cel. Een injectie van perslucht of stikstof inert in de drug gevulde pipet veroorzaakt een kleine hoeveelheid geneesmiddel oplossing wordt uitgestoten uit de pipet op de gemaakte cel. Met behulp van deze methode, nAChR-gemedieerde stromen kunnen worden opgelost op de milliseconde nauwkeurig. Drug Application tijden kunnen gemakkelijk worden gevarieerd, en het medicijn gevulde pipet kan worden teruggetrokken en vervangen door een nieuwe pipet, waardoor concentratie-reactiekrommen te creëren voor een neuron. Hoewel beschreven in de context van nAChR neurobiologie zou deze techniek nuttig voor het bestuderen van vele soorten ligand-gated ionkanalen of receptoren in neuronen van hersencoupes.

In onze experimenten hebben we routinematig opnemen van dopamine (DA)-producerende neuronen van de ventrale tegmentale gebied (VTA) en de substantia nigra pars compacta (SNC). In voltage-clamp mode zal de druk toepassing van acetylcholine nicotine of deze cellen typisch resulteren in een snel, binnen kation stroom die piek bereikt binnen 100-200 msec (Figuur 1A-B). Verval van de stroom grotendeels bepaald door diffusie van het geneesmiddel uit de plaats van werking en of enzymen in het segment aanwezig ...

In dit artikel beschrijven we een bruikbare methode om ligand-gated ionkanalen functie te bestuderen in neuronen van acuut geïsoleerd hersenen plakjes. Deze methode omvat het gebruik van een geneesmiddel gevulde micropipet voor lokale toepassing van geneesmiddelen voor neuronen opgenomen met standaard patch-clamp technieken.

Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van ligand-gebonden ionkanalen in neuronen te bestuderen vanuit hersenslices die acuut zijn bereid uit de hersenen van volwassen muizen. Dit wordt bereikt door eerst een intacte hersenen te extraheren uit een volwassen muis die is trans Cardi geperfundeerd met gespecialiseerde kunstmatige hersenvloeistof. De tweede stap is het bereiden van hersenslices uit de hersengebied van belang in de gewenste oriëntatie.Vervolgens worden individuele hersenslices onder de microscoop in een opnamekamer geplaatst en individuele neuronen binnen de slice worden geïdentificeerd voor opname. De laatste stap is whole cell patch clamp opname van een neuron gevolgd door lokale toediening van geneesmiddelen om de ligand-gebonden ionkanalen te activeren met behulp van een tweede glazen micropipet. Uiteindelijk wordt deze methode voor het bestuderen van ligand-gebonden ionkanalen gebruikt om de biofysische eigenschappen van inheemse receptoren op levende neuronen te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals badtoediening of YouTube-geneesmiddeltoediening, is dat de geneesmiddeltoediening aan het opgenomen neuron erg snel en gelokaliseerd is. Kleine hoeveelheden geneesmiddel kunnen worden afgegeven en meerdere neuronen kunnen worden bestudeerd vanuit een enkele slice. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het nicotiner acetylcholine receptorveld te beantwoorden, zoals het bepalen van de inheemse nicotiner receptoren die betrokken zijn bij de biofysische cel, biologische en gedragsreacties op nicotine.Bij deze procedure, na het opofferen van een volwassen muis en het verkrijgen van de hersenen, trimt u de hersenen in de gewenste oriëntatie om het gebied van belang te omvatten op een ijsgekoelde metalen plaat. Vervolgens bevestigt u het hersenblok met superlijm op het droge oppervlak van een vibrerende slicer. Dompel vervolgens het hersenblok onder in een NMDG-hersteloplossing van vier graden Celsius en beluucht de oplossing continu met carbogen.Snijd vervolgens de slices van elk 250 micrometer dikte uit het gewenste hersengebied. Trek vervolgens een standaard patch micropipet met een weerstand van vier tot zes mega ohms met behulp van de programmeerbare flaming brown puller. Vul de micropipet met een geschikte intracellulaire opnameoplossing.Breng vervolgens een slice over naar de opnamekamer op het podium van een rechtopstaande microscoop en super fuseer de slice continu met koolzuurhoudend 32 graden Celsius Standard opname A CSF bij 1,5 tot 2,0 milliliter per minuut. Onder de microscoop, lokaliseert en centreert u het hersengebied van belang met behulp van een 10 x luchtobjectief. Daarna visualiseert u de individuele neuronen met behulp van een 40 x nabij-infrarood waterimmersie objectief verbonden met de IR differentiële interferentie contrast optiek, en een hogesnelheid nabij-infrarood charged coupled device of CCD videocamera Onder IR DIC observatie vertonen gezonde neuronen een gladde lichtgrijze plasmamembraan na celvisualisatie.Voer een volledige celopname uit met behulp van conventionele technieken. Trek nu nog een standaard patch clamp micropipet zoals voorheen om twee identieke zustertips te produceren uit hetzelfde stuk glas met een optimale weerstand van ongeveer vijf mega ohms. Vul een van de micropipetten met de oplossing van het geneesmiddel verdund in koolzuurhoudend standaard opname A CSF, richt de tip naar beneden en tik het met geneesmiddel gevulde micropipet om eventuele luchtbellen die in de micropipet zijn vastgehouden te verwijderen.Monteer vervolgens het met geneesmiddel gevulde micropipet in een pipetholde die is bevestigd aan de microm manipulator. De pipetholde moet met slangen zijn verbonden met een geschikt drukuitwerpingssysteem. Handmatig druk drie tot vier keer uit naar de micropipet om voldoende druk op te bouwen achter de vloeistofkolom.Laat vervolgens de geneesmiddelpipet in de slice zakken met behulp van de microm manipulator met behulp van I-R-D-I-C.Observatie. Positioneer de geneesmiddelmicropipet op het oppervlak van de weefselslice. Voer een drukuitwerping uit en controleer de omgeving van de tip op beweging van puin gerelateerd aan de uitwerping en de tip van de micropipet.Voor eventuele tekenen dat de tip verstopt of geblokkeerd is, als de tip verstopt is, trekt u de pipet terug en vervangt u deze door een nieuwe. Benader de opgenomen cel diagonaal vanaf de bovenkant van de slice. Wanneer deze in de uiteindelijke positie is, bevindt de tip van de met geneesmiddel gevulde pipet zich in hetzelfde focale vlak als de opgenomen cel en de tip van de opname-elektrode, en het is ongeveer 10 tot 40 micrometer van de opgenomen cel verwijderd.Als de tip van de met geneesmiddel gevulde pipet boven de opgenomen cel is, zou de kracht van de drukuitwerping de giga seal van de cel kunnen verstoren, neem dan de acetylcholine en/of nicotine geïnduceerde cellulaire stromingen op terwijl de neuronen in voltage clamp modus worden gehouden. Hoewel drukrejetie handmatig kan worden geactiveerd bij gebruik van een pico spritzer drie voor meer reproduceerbare resultaten, is het raadzaam om de drukrejetie te activeren met behulp van het acquisitiesysteem en een digitale TTL-puls. Om het experiment te verbeteren, kan de met geneesmiddel gevulde pipetholde worden gemonteerd op een enkeldimensionaal pizo elektrische translator die in staat is om een analoog voltage-input te accepteren, die vervolgens wordt gemonteerd op de hoogprecieze micro manipulator.Een pizo elektrische translator is nuttig omdat de beweging van de met geneesmiddel gevulde pipet in en uit de slice, inclusief de timing en snelheid van binnenkomst/uitgang, gemakkelijker kan worden gecontroleerd en gerepliceerd van experiment tot experiment. Pas vervolgens de spanning aan op zijn maximale waarde met de handmatig bediende potentiometer op de pizo elektrische spanningsgestuurde versterker. Gebruik de micro manipulator om de met geneesmiddel gevulde pipet in de slice te positioneren.Trek de pipet terug door de spanning handmatig te verlagen tot nul op de pazo elektrische spanningsgestuurde versterker met behulp van een analoog uitgangssignaal van het opname-acquisitiesysteem. Beweeg de met geneesmiddel gevulde pipet in de slice voordat de drukrejetie TTL-puls plaatsvindt. Nadat de puls heeft plaatsgevonden, trekt u de pipet terug.Deze figuur toont de represent

local-application-drugs-to-study-nicotinic-acetylcholine-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een nieuwe techniek van het kwantificeren van nicotine acetylcholine receptor veranderingen binnen subcellulaire regio's van specifieke subtypes van CNS neuronen beter de mechanismen van de nicotine verslaving te begrijpen met behulp van een combinatie van benaderingen waaronder fluorescerend eiwit tagging van de receptor met behulp van de knock-in aanpak en spectrale confocale beeldvorming.

Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

We ontwikkelden een gen-chimerische voorbereiding van de ventrale hippocampale - accumbens-circuit in vitro die direct live beeldvorming mogelijk maakt om presynaptische mechanismen van nicotinische acetylcholine receptoren (nAChR's) gemedieerde synaptische transmissie te analyseren. Deze voorbereiding biedt ook een informatieve aanpak om de pre- en post-sygnatische mechanismen van synaptische plasticiteit te bestuderen.

Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Een gevalideerde geautomatiseerde batterij van neuropsychologische en neurofysiologische tests wordt gebruikt voor het bestuderen van farmacodynamische effecten op het centrale zenuwstelsel van nieuw ontwikkelde geneesmiddelen in vroege fase ontwikkeling. Om aan te tonen van de testbatterij, worden de acute effecten van mecamylamine en de omkering van deze effecten door twee agonist drugs beschreven.

Een geautomatiseerde testbatterij farmacodynamische effecten op het centrale zenuwstelsel van cholinerge Drugs in vroege fase geneesmiddelenontwikkeling te bestuderen

Presenteren we een methode die kan nadere inzichten in de vroege gebeurtenissen onderliggende neurodegeneratie en gebaseerd op de gevestigde ex-vivo hersenen techniek, combineren de voordelen van in vivo en in vitro experimenten. Bovendien heeft het een unieke kans voor directe vergelijking van behandelde en onbehandelde groep in hetzelfde anatomische vlak vertegenwoordigt.

Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

Dit artikel presenteert een methode voor het bestuderen van nicotinerge acetylcholine-receptoren (nAChRs) in muis hersenen plakjes door nicotine uncaging. Wanneer in combinatie met de gelijktijdige patch klem opname en 2-foton laser scanning microscopie, verbindt nicotine uncaging nicotinerge receptor functie met cellulaire morfologie, bieden een dieper begrip van cholinerge neurobiologie.

Indringende nicotinerge Acetylcholine Receptor functie in muis segmenten van de hersenen via Laser Flash fotolyse van Photoactivatable Nicotine

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

Dit protocol beschrijft expressie en kwantificatie van neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van de zoogdier-Neuro-2a-cellijn. pH-gevoelige fluorescentielabels en confocale microscopie maken een nauwkeurige evaluatie mogelijk van receptorlokalisatie bij het plasmamembraan ten opzichte van die in pH-neutrale intracellulaire compartimenten, wat de studie van nAChR-transport en farmacologische modulatie vergemakkelijkt.

Lokalisatie van plasmamembraan en intracellulaire neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van kwantitatieve beeldvorming in zoogdiercellen

Leer hoe je lokale geneesmiddeltoepassing combineert met patch clamp-opnamen om ligand-gated ionkanalen in neuronen van acute muizenhersensnedes te bestuderen. Deze methode onthult biophysische eigenschappen van native receptoren.

Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie

Meer video's verkennen