Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering
10 juni 2014
In dit protocol demonstreren we de fabricage van biomimetische hartcelcultuursubstraten gemaakt van twee verschillende polymere materialen met behulp van capillaire krachtlitografie. De beschreven methoden bieden een schaalbare, kosteneffectieve techniek om de structuur en functie van macroscopische hartweefsels voor in vitro en in vivo toepassingen te ontwerpen.
Het algemene doel van deze procedure is om biomimetische celcultuursubstraten te produceren om de structuur en functie van macroschoopse hartweefsels te ontwerpen. Dit wordt bereikt door eerst een siliconen master met de gewenste topografische architectuur te fabriceren door middel van diepe reactieve ionen etching. De tweede stap is om het gewenste topografische patroon over te brengen van de siliconen master naar een PUA-mal met behulp van UV-ondersteunde capillaire kracht lithographie.
Vervolgens wordt de PUA-mal gebruikt als sjabloon om celcultuursubstraten te fabriceren uit verschillende polymere materialen, afhankelijk van de gewenste toepassing, via UV-ondersteunde of oplosmiddel-gemedieerde capillaire kracht lithographie. De laatste stap is om primaire of stamcel-afgeleide cardiomyocyten op de nano patroon celcultuursubstraten te plaatsen voor verdere analyse. Uiteindelijk worden helderveld- en immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om veranderingen in celmorfologie en contractiele eiwitrangschikking binnen de cardiomyocyten te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals micro contact printing, is dat capillaire kracht lithographie nano patroon celcultuursubstraten produceert die structurele uitlijning van hartweefselmonolagen kunnen induceren zonder te vertrouwen op celproliferatie of migratie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te geven in de structuurfuncteverhouding van hartweefsels, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals kanker mechanobiologie. Om de invloed van matrixtopografie op celmigratie te bestuderen, begint u deze procedure door het oppervlak van de siliconen master schoon te maken met 100% ethanol of xyleen en te drogen onder zuurstofstikstofgas.
Plaats vervolgens de siliconen master met het patroon naar boven in een petrischaal voor een siliconen master met een oppervlaktepatroon van twee centimeter bij twee centimeter, en pipet 40 microliters PUA erin. Plaats vervolgens een vel van vier centimeter bij vier centimeter transparant polyesterfolie over de aangebrachte PUA, druk de PET-plaat naar beneden en verspreid de PUA onder de plaat over het patroonoppervlak met behulp van een roller of vlakke randoppervlak zodat het hele patroon wordt bedekt door de PUA-prepolymer. Plaats vervolgens de siliconen master prepolymer en PET ongeveer 10 centimeter onder een 20 watt UV-licht gedurende 50 seconden.
Na het uitsharden verwijdert u de PET-folie langzaam met een pincet. PUA zou zich aan de PET-folie moeten hechten met een negatief van het Silicon Master nanopatroon. Cure vervolgens de P-U-A-P-E-T nanopatronen onder UV gedurende ten minste 12 uur voor gebruik.
Om de Silicon Masters schoon te maken, plaatst u nog een PET-film op de master zonder toevoeging van PUA. Stel het bloot aan UV-licht gedurende 50 seconden en verwijder de PET-film. Spoel vervolgens de siliconen master met 100% ethanol of xyleen en droog onder zuurstofstikstofgas.
In deze procedure behandel je ronde glazen glijbanen van 18 millimeter diameter door ze 10 minuten in een ozonkamer te plaatsen. Plaats vervolgens de glijbanen op blokken PDMS om ze tijdelijk vast te zetten voor eenvoudig hanteren. Breng vervolgens een laag glasprimer aan op het oppervlak van de glazen glijbaan.
Laat de primer 30 minuten aan de lucht drogen. Plaats nu de glazen glijbanen op een stuk printerpapier. Laat 10 microliters polyurethaan prepolymer vallen in het midden van elke glazen glijbaan en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
Plaats vervolgens de PUA-mal met het patroon naar beneden op de glazen glijbaan, verspreid het pu-prepolymer gelijkmatig over het oppervlak van de glazen glijbaan door een rubberen cilinderrol langs de PUA-mal te rollen. Het printerpapier zal de polymere overloop vervolgens absorberen. UV-cure ze gedurende 60 seconden onder een 20 watt UV-lamp. Verwijder vervolgens het monster van de UV-lichtbron en pel voorzichtig de PUA-mal van de PU-gecoate glazen glijbaan. De polymerisatie van de PU wordt als voltooid beschouwd.
Wanneer de PUA-mal zich schoon van het monster afpelt en de PU-glasglijbaan een iriserende uitstraling heeft, plaatst u de monsters dan in een desiccator voor opslag gedurende maximaal een maand. Bevestig nu een NFS-deksel aan een 35 millimeter weefselcultuurpolystyreenschaal, pipet 20 microliters NOA op de bodem van de schaal. Plaats voorzichtig de NPPU-deksel op de NOA en laat de lijm zich verspreiden en de hele bodem van het deksel bedekken. Cure vervolgens NOA door de schaal gedurende 10 minuten aan UV bloot te stellen.
Steriliseer vervolgens de NP SUBSTRATA door het twee keer te spoelen met twee milliliter 70% waterige ethanoloplossing gedurende vijf minuten. Verwijder het ethanol door aspiratie. Laat de A NFS gedurende ongeveer een uur volledig aan de lucht drogen onder de UV-sterilisatielamp in de biologische veiligheidskast.
Om de cellulaire adhesie te verbeteren, bedekt u de A NFS overnacht met fibronectine door de fibronectine eerst in di water te verdunnen tot vijf microgram per milliliter. Pipet vervolgens twee milliliter fibronectine-oplossing in een schaal. Plaats vervolgens de A NFS in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2 overnacht.
Verkrijg NR VM's, HESC CMS of andere hartcellen van belang, centrifugeer het cellenmonster gedurende drie minuten bij 1000 RPM om de cellen te pellen. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. Resuspendeer vervolgens de cellen in kweekmedium tot een concentratie van 4,6 keer 10 tot de zes cellen per milliliter.
Pipet voorzichtig 200 microliters celsuspensie op de gesteriliseerde A NFS en zorg ervoor dat de celsuspensie op het deksel blijft. Plaats vervolgens de cellen in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende vier uur om de cellen aan de A NFS te laten hechten. Voeg vervolgens twee milliliter extra warm kweekmedium toe aan de schaal en plaats de cellen weer in de incubator onder dezelfde omstandigheden.
Verwijder na 24 uur het medium en was met twee milliliter DPBS twee keer om overtollige cellen te verwijderen. Voeg daarna twee milliliter warm kweekmedium toe aan de schaal. Plaats de cellen in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert de fabricage van biomimetische substraten voor hartcelcultuuren met behulp van capillaire krachtlithografie. De beschreven methoden bieden een schaalbare en kosteneffectieve aanpak voor het engineeren van macroscopische hartweefsels voor diverse toepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiale weefseltechnologie
- Celkweektechnieken
- Polymere materialen
Achtergrond
- Biomimetische substraten zijn essentieel voor het bestuderen van hartcellen.
- Capillaire krachtlithografie maakt nauwkeurige patroonvorming mogelijk.
- Het engineeren van hartweefsels kan in vitro- en in vivo-studies verbeteren.
- Het gebruik van verschillende polymere materialen kan toepassingen op maat maken.
Doel van de studie
- Om biomimetische celkweeksubstraten te produceren.
- Om de structuur en functie van hartweefsels te manipuleren.
- Om de analyse van het gedrag van cardiomyocyten te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een siliconen master met behulp van diepe reactieve ionenetsing.
- Overdracht van topografische patronen naar een PUA-vorm via UV-ondersteunde capillaire krachtlithografie.
- Fabricage van celkweeksubstraten van diverse polymere materialen.
- Uitplaten van cardiomyocyten voor analyse met behulp van microscopietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle overdracht van topografische patronen naar celkweeksubstraten.
- Observatie van veranderingen in de celmorfologie.
- Analyse van de arrangementen van contractiele eiwitten in cardiomyocyten.
- Demonstratie van de effectiviteit van de biomimetische substraten.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het creëren van biomimetische substraten.
- Capillaire krachtlithografie is een veelzijdige techniek voor tissue engineering.
- Verdere studies kunnen het begrip van het gedrag van hartcellen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Capillaire krachtlithografie maakt de schaalbare fabricage mogelijk van biomimetische substraten die nanostructurele signalen van de extracellulaire matrix nabootsen, welke cruciaal zijn voor de rijping van hartweefsel. Deze aanpak ondersteunt voorspellende modellering van structuur-functie-relaties van cardiomyocyten, waardoor de afhankelijkheid van empirische screening in de vroege ontdekkingsfase wordt verminderd. Door reproduceerbare, uitlijnings-inducerende platforms te bieden, verhoogt deze methode het vertrouwen in de validatie van targets en de translationele continuïteit in cardiovasculaire R&D-pijplijnen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de effecten van nanotopografie op de uitlijning van cardiomyocyten en de organisatie van contractiele eiwitten.
- Operationele waarde: Biedt kosteneffectieve, schaalbare substraten voor high-throughput analyse van matrix-gemedieerde cellulaire responsen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door topografische variabelen in cardiale rijplingspaden te isoleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare morfologische en cytoskeletale resultaten via brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare nanogestructureerde oppervlakken die compatibel zijn met primaire en uit stamcellen afgeleide cardiomyocyten.
- Klaar voor analyse: Faciliteert gestandaardiseerde evaluatie van effecten van verbindingen op elektromechanische koppeling op weefselniveau.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ECM-nabootsing op nanoschaal en functionele weefselfenotypes die relevant zijn voor ziektemodellering.
- Preklinisch Nut: Maakt risico-gecorrigeerde beoordeling van regeneratieve kandidaten mogelijk met behulp van uitgelijnde cardiomyocyten-monolagen.
- Mechanistisch Inzicht: Verduidelijkt structuur-functierelaties zonder storende effecten van celproliferatie of migratie.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in discovery-workflows door een hypothese-gestuurde evaluatie van de effecten van de matrix-topografie mogelijk te maken voorafgaand aan de fasen van lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt functionele targetvalidatie via gecontroleerde, door nanotopografie geïnduceerde fenotypische modulatie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, uitlijnings-inducerende substraten voor consistente screening van verbindingen in cardiale assays.
- Analytics: Biedt kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde read-outs voor het beoordelen van cytoskeletale uitlijning en sarcomere organisatie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt substraatontwerp op nanoschaal met preklinisch relevante eindpunten van weefselrijping.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor cardiovasculaire targetvalidatie over meerdere therapeutische modaliteiten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in cardiac tissue engineering door topografische signalen te ontkoppelen van biochemische signalen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid tussen batches via UV-ondersteunde en oplosmiddel-gemedieerde capillary force lithografieprocessen.
- Strategische waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van go/no-go-beslissingen door het leveren van voorspellende, mens-relevante in vitro-modellen.
- Impact op portfolio: Maakt risicostratificatie mogelijk bij de verdere ontwikkeling van kandidaten voor cardiale regeneratie op basis van functionele weefselmetrieken.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in nanofabricage, polymeerchemie en celkweektechnieken.
- Is afhankelijk van UV-uithardingsapparatuur, precisiegietinstrumenten en een steriele weefselkweekinfrastructuur.
- Vereist standaardisatie van fibronectine-coating en sterilisatieprotocollen tussen teams.
- Omvat aanpassingen bij uitbreiding naar niet-cardiale celtypen of ziektemodellen.
- Beperkt door de noodzaak van gespecialiseerde masters en mallen, hoewel schaalbaar via replicatie.
