Name: Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Leer capillaire force lithografie voor het fabriceren van biomimetische substraten voor hartweefselengineering. Deze schaalbare methode maakt precieze patroonoverdracht mogelijk voor cardiomyocytcultuur en gedragsanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

D. H. Kim bedankt zich bij het Department of Bioengineering van de University of Washington voor de nieuwe start-up fondsen voor faculteit. D. H. Kim wordt ook ondersteund door de Perkins Coie Award for Discovery, de Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, de Washington State Life Science Discovery Fund en de American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang en A. Jiao danken de ondersteuning van de NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship.  Aanvullende steun voor dit werk komt van de National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 aan M. Regnier.

Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (~ 23 ° C), tenzij anders vermeld. 1. Fabricage van Silicon Master <ol><li> Schoon silicium wafer met 100% ethanol of xyleen en droog onder O 2 / N 2 gas. </li><li> Plaats silicium wafer in spin-coater bij rotatiesnelheden van 2.000-4.000 tpm tot een 0,3-0,5 um dikke film te produceren. </li><li> Patroon de fotolaklaag met de juiste afmetingen met behulp van een fotolithografie-systeem </li><li> Volledig onderdompelen de gestructureerde fotolak beklede silicium wafers in een geschikt volume van fotoresist ontwikkeloplossing. </li><li> Spoel de ontwikkelde-lichtgevoelige laag silicium wafers met gedemineraliseerd water. </li><li> Arrays van sub-micron schaal ruggen met bijna verticale zijwanden, diepe reactief ion etsen de blootgestelde silicium met behulp van een ets-systeem vormen. </li><li> Verwijder het resterende fotoresist door het plaatsen van de siliciumwafel in een plasma Asher systeem. </li><li> Snijd het silicium wafers met een gediamanteerde snijder in de juiste maat siliconen matrijzen voor latere replica gieten. </li></ol> 2. Fabricage van PUA Mold van Silicon Master OPMERKING: Volume silicium meester worden toegevoegd nanofabricage zal variëren afhankelijk van het gebied van de nanopatterned kapitein ook worden gerepliceerd als de viscositeit van het polyurethaan acrylaat (PUA) oplossing. <ol><li> Schoon silicium meester oppervlak met 100% ethanol of xyleen en droog onder O 2 / N 2 gas. </li><li> Plaats silicium meester patroon naar boven in een petrischaal. </li><li> Voor een silicium master met een 2 cm x 2 cm oppervlak patroon, pipet 40 ul van PUA om het patroon oppervlak. </li><li> Leg een vel van 4 cm x 4 cm transparant polyester (PET) folie over de afgegeven PUA. </li><li> Druk op de PET-blad en verspreid het PUA onder het vel over de patroon gezicht met behulp van een roller of platte randen oppervlak (zoals een kaart), zodat de helepatroon wordt gedekt door de PUA prepolymeer. </li><li> Plaats silicium meester, prepolymeer, en PET ongeveer 10 cm onder een 20 Watt (115 V) UV-licht (λ = 365 nm) gedurende 50 sec. Om effectief te zijn, kan het UV-licht golflengte ergens tussen 310-400 nm. De intensiteit van het licht is 10-15 mW / cm 2 aan het oppervlak van het substraat. </li><li> Na uitharding verwijderen PET-folie langzaam met een pincet. PUA moeten hechten aan de PET-film met een negatief van het silicium meester nanopattern. </li><li> Cure PUA / PET nanopatronen onder UV gedurende ten minste 12 uur vóór gebruik. Overbelichting is geen probleem. </li><li> Om silicium meesters reinigen, plaatst u een andere film van PET op de top van de master zonder de toevoeging van PUA en bloot te stellen aan UV-licht (λ = 365 nm) voor 50 seconden en verwijder PET-folie. Dit zal alle niet-gereageerde monomeren te verwijderen. </li><li> Spoel silicium master met 100% ethanol of xyleen en droog onder O 2 / N 2 gas. </li></ol> 3a. Nanopatronen polyurethaanpolymeer </p&gt; <ol><li> Bereid 25 mm ronde glazen objectglaasjes door in een ozonbehandeling kamer gedurende 10 minuten. </li><li> Plaats-ozon behandelde glasplaatjes op kleine PDMS blok voor eenvoudig gebruik. </li><li> Breng dunne laag van het oppervlak adhesiepromotor met penseel te glasplaatjes. Droging glasplaatjes gedurende 30 minuten. </li><li> Plaats het glaasje op een stuk printerpapier. </li><li> Drop afzien 10 ul van polyurethaan (PU) pre-polymeer (NOA 76) naar het centrum van glasplaatje. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn na toevoeging. </li><li> Plaats PUA mal, patroon gezicht naar beneden, op het glaasje. De verspreiding van de PU gelijkmatig over het oppervlak van het glaasje door het werpen van een rubberen cilinder roller langs de PUA mal. Printerpapier zal polymeer overflow absorberen. </li><li> Watt UV-lamp. Polymerisatietijd van de PU is afhankelijk kracht van UV-bron. </li><li> Neem het monster uit UV-lichtbron en zorgvuldig verwijderen van de PUA mal van PU gecoat glasplaatje. Polymerisatie van de PU wordt beschouwd complete wanneer de PUA mal schillen netjes weg van het monster en de PU glaasje heeft een iriserende uitstraling. </li><li> Plaats afgewerkt monsters exsiccator opslag zolang een maand. </li></ol> 3b. Nanopatronen Poly (lactide-co-Glycolide) Hydrogel <ol><li> Maak een platte PDMS mal door krachtig mengen siliconen elastomeer basis en siliconen elastomeer verharder in een 10:01 verhouding. </li><li> Giet gemengde PDMS precursor oplossing in een petrischaal, zodat de PDMS precursor bereikt 5 mm tot de rand van de schaal (dat wil zeggen zodat het PDMS is 5 mm dik). </li><li> Plaats petrischaal en PDMS voorloper in een exsiccator gedurende 1 uur te ontgassen. </li><li> Beweeg petrischaaltje PDMS precursor in een 65 ° C oven gedurende ten minste 2 uur uitharden. </li><li> Na PDMS is uitgehard, gebruik dan een scheermes aan de platte PDMS gesneden in 3 cm x 3 cm vierkante secties. Dit zullen de vlakke PDMS mallen later in de patroonvorming proces gebruikt. </li><li> Clean diameter 25 mm ronde glazen dia&#39;s door placing in isopropylalcohol gedurende 30 minuten in een water sonicator. </li><li> Droog gereinigd glasplaatjes onder O 2 / N 2 gas. </li><li> Drop afzien 100 pl PLGA-oplossing (15% w / v PLGA in chloroform) op glasplaatje. </li><li> Plaats een plat PDMS mal bovenop de gedoseerde PLGA het oplosmiddel absorberen en een met PLGA vlakke ondergrond. Breng een lichte druk (-10 kPa) door een 200 g gewicht bovenop de PDMS gedurende 5 minuten. </li><li> Langzaam afpellen plat PDMS mal en plaats de deksel glas op een voorverwarmde plaat (120 ° C) gedurende 5 minuten om de resterende oplosmiddel te verwijderen en verhogen hechting tussen de PLGA en het dekglas. </li><li> Plaats de NP PUA mal bovenop de vlakke PLGA en constante druk (~ 100 kPa) en warmte (120 ° C) toegepast door een 1 kg gewicht bovenop de PUA mal terwijl de verwarmingsplaat gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder het gewicht van PLGA dekglaasje en laat het substraat afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder geen PUA schimmel totdat de ondergrond zijn geweestafgekoeld. </li><li> Zodra de ondergrond voldoende zijn afgekoeld, voorzichtig afpellen de NP PUA mal, het openbaren van de NP PLGA ondergrond. De NP PLGA ondergrond dient een iriserende uitzien. </li><li> Plaats afgewerkt monsters exsiccator opslag zolang een maand. </li></ol> 4. Cel zaaien en cultuur OPMERKING: Dit protocol beschrijft de cultuur van de neonatale rat hartspiercellen (NRVMs) en H7 menselijke embryonale stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hESC-CMS), maar andere mobiele bronnen kunnen worden gebruikt. <ol><li> Bevestig de ANF&#39;s dekglaasjes (PU of PLGA) een 35 mm weefselkweek polystyreen schotel. Pipetteer 20 ul van Norland Optical Adhesive (NOA83H) naar de bodem van de schaal en plaats voorzichtig het ANF dekglaasje bovenop de NOA. Laat de lijm verspreid en bedek hele dekglaasje bodem. Cure NOA door blootstelling aan UV-schotel gedurende 10 minuten. </li><li> Steriliseer ANF door spoelen met 2 ml 70% waterige ethanol oplossing gedurende 5 min, tweemaal. Verwijder eThanol door aspiratie. Laat ANF&#39;s volledig de lucht drogen voor ~ 1 uur onder de UV-lamp sterilisatie (λ = 200-290 nm) in de biologische veiligheid kabinet. </li><li> Cellulaire adhesie wordt versterkt door het bekleden van de ANF&#39;s in fibronectine overnachten. Verdunnen fibronectine in DI water tot 5 ug / ml. Pipetteer 2 ml van fibronectine oplossing in de schotel. Plaats in incubator bij 37 ° C en 5% CO2 overnacht (ten minste 6 uur). </li><li> Verkrijgen NRVMs, hESC-CMS, of andere cardiale cellen van belang volgens eerdere protocollen 22. </li><li> Centrifugeer celmonster bij 1000 rpm gedurende 3 minuten om de cellen te pelleteren. </li><li> De bovenstaande vloeistof voorzichtig door aspiratie. Controleer de pellet te verstoren. </li><li> Resuspendeer cellen in geschikte kweekmedia tot een concentratie van 4,6 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Pipet zorgvuldig 200 ul van celsuspensie op gesteriliseerd ANF&#39;s. Zorg ervoor celsuspensie blijft op het dekglaasje. </li><li> Plaats cellen in de broedstoof bij 37 ° C en 5%CO2 gedurende 4 uur om cellen te hechten aan ANF. </li><li> Voeg 2 ml warm voedingsbodems voor te schotelen en te vervangen cellen in incubator onder dezelfde omstandigheden. </li><li> Na 24 uur, verwijder media en wassen met 2 ml DPBS tweemaal om overtollige cellen te verwijderen. </li><li> Voeg 2 ml warm voedingsbodems voor te schotelen en te vervangen cellen in incubator onder dezelfde omstandigheden. Kweek van de cellen tot confluentie. Vervang de media om de andere dag. </li></ol>

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Engineered+Human+Myocardium+With+Mechanical+Loading+and+Vascular+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture.</a> Circulation Research. 109, 47-59 (2011).</li>
<li>Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Cultures+With+Controlled+Macroscopic+Anisotropy%3A+A+Model+for+Functional+Electrophysiological+Studies+of+Cardiac+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle.</a> Circulation Research. 91, (2002).</li>
<li>Fink, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).</li>
<li>Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+Engineering+the+Cell+Surface+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploring and Engineering the Cell Surface Interface.</a> Science. 310, (2005).</li>
<li>Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+engineering+of+biomimetic+surfaces%3A+cues+from+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix.</a> Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).</li>
<li>Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+research+and+clinical+applications+of+PLGA-based+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+nanotopography+as+a+regulator+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix nanotopography as a regulator of cell function.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).</li>
<li>Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Combined+Effect+of+Substrate+Rigidity+and+Topographic+Guidance+on+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology.</a> IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Nanopatterns+as+Enabling+Tools+for+Analysis+and+Control+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells.</a> Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).</li>
<li>Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+Platforms+for+Cell+Mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopatterned+cardiac+cell+patches+promote+stem+cell+niche+formation+and+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration.</a> Integr Biol. 4, 1019 (2012).</li>
<li>Kim, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanostructures+of+polyethylene+glycol+for+applications+to+protein+adsorption+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion.</a> Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).</li>
<li>Hwang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Assays+of+Endothelial+Cells+on+Nanopatterned+Surfaces+within+a+Microfluidic+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel.</a> Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).</li>
<li>Heidenreich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forecasting+the+Future+of+Cardiovascular+Disease+in+the+United+States%3A+A+Policy+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, 933-944 (2011).</li>
<li>Legrice, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+structure+of+the+heart%3A+ventricular+myocyte+arrangement+and+connective+tissue+architecture+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).</li>
<li>Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+MR+tractography+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Diffusion MR tractography of the heart.</a> J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Fluxes+Involved+in+Control+of+Cardiac+Myocyte+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction.</a> Circulation Research. 87, 275-281 (2000).</li>
<li>Mohrman, D. E., Heller, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohrman%2C+DE+%22Cardiovascular+Physiology%22">Cardiovascular Physiology</a>. , McGraw Hill Medical. (2010).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+De+Novo+Cardiomyocytes%3A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation+and+Direct+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming.</a> Stem Cell. 10, 16-28 (2012).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cardiomyocytes+Derived+From+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Circulation Research. 104, (2009).</li>
<li>Qian, J. -Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytosolic+Ca2%2B+dynamics+in+cultured+Guinea+pig+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+to+identify+potential+cardiotoxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants.</a> Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).</li>
<li>You, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistically+Enhanced+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+by+Culture+on+Nanostructured+Surfaces+with+Induction+Media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media.</a> Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotopography-guided+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).</li>
<li>Mannix, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomagnetic+actuation+of+receptor-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction.</a> Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).</li>
<li>Karuri, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+length+scale+topography+enhances+cell-substratum+adhesion+of+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells.</a> J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).</li>
<li>Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+cell+adhesion+by+nanoscale+RGD+organization+and+mechanical+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus.</a> J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).</li>
<li>Yim, E. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).</li>
<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+human+mesenchymal+cell+differentiation+using+nanoscale+symmetry+and+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder.</a> Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).</li>
<li>Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosize+and+Vitality%3A+TiO+2Nanotube+Diameter+Directs+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate.</a> Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).</li>
<li>Tung, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in tissue culture.</a> Journal of Electrocardiology. 39, (2006).</li>
<li>Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+the+cardiomyocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer.</a> Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).</li>
<li>Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+dynamic+in+vivo+environments+with+stimuli-responsive+materials+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture.</a> Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).</li>
<li>Henderson, D. J., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+and+Structure+of+the+Ventricles+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart.</a> Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).</li>
<li>Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Micropatterned+Cardiac+Cell+Cultures+with+Realistic+Ventricular+Microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysj%22%5BJournal%5D)">Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure.</a> Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).</li>
<li>Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+Assembly+by+Rotary+Jet-Spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning.</a> Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).</li>
<li>Rao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microgrooved+culture+substrates+on+calcium+cycling+of+cardiac+myocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Functioneel volwassen hartweefsel ontbreken zowel in vivo als in vitro toepassingen van cardiale tissue engineering. De CFL nanofabricage hier beschreven methoden zijn robuust technieken voor het bereiken van cellulaire aanpassing en beïnvloeding macroscopische weefselfunctie vanwege de schaalbaarheid van het systeem. Grote gebieden kunnen gemakkelijk worden gevormd en gebruikt voor celkweek. Macroscopische cellulaire uitlijning is belangrijk in hartweefsel techniek om biomimetische, functionele weefse...

Hart-en vaatziekten is de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de wereld en vormen een zware socio-economische last op een reeds gespannen globale gezondheidssysteem 1,17. Cardiale tissue engineering heeft twee verschillende doelen: (1) om beschadigde hartspier te regenereren na ischemische ziekte of cardiomyopathie of (2) een high fidelity model van het hart voor in vitro screening van geneesmiddelen of ziekte modellering creëren. Het hart is een complex orgaan die voortdurend moeten werken om bloed naar het lichaam. Dicht op elkaar gepakte laminaire structuren van hartspiercellen en ondersteunende weefsels zijn gerangschikt in spiraalvormige patronen in de hartwand 18,19. Het hart is ook elektromechanisch gekoppeld 20 in een sterk gecoördineerde manier om het bloed efficiënt te werpen op het lichaam 21. Verschillende grote hindernissen die moeten worden aangepakt, maar voordat de natuur ingewikkelde ontwerp betrouwbaar kan worden samengevat in vitro.Eerste, hoewel robuuste hartspierceldifferentiatie methoden verder worden ontwikkeld 22 HPSC-CMs vertonen nog vrij onvolwassen fenotypes. Hun elektromechanische eigenschappen en morfologie meest overeenkomen met foetale niveaus 23. Ten tweede, wanneer bewaard in de traditionele cultuur omstandigheden, zowel stamcellen afgeleide en primaire cardiomyocyten niet samenvoegen tot inheemse, weefsel-achtige structuren. Integendeel, cellen willekeurig georiënteerd en niet vertonen de gestreepte staafvormige uiterlijk van volwassen myocard 24. De extracellulaire matrix (ECM) omgeving waarmee cellen interageren speelt een belangrijke rol in talrijke cellulaire processen 11,13,25. De ECM bestaat uit complexe, goed gedefinieerde moleculaire en topografische signalen die aanzienlijk beïnvloeden de structuur en functie van cellen 6,26. In het hart, cellulaire uitlijning volgt de onderliggende nanometerschaal ECM vezels 2. De impact van deze nanotopographsche signalen op cellen en weefsels functie echter verre van volledig begrepen. Voorstudies van nanometerschaal cel-biomateriaal interactie geven het potentiële belang en de impact van sub-micron topografische aanwijzingen voor celsignalerende 27, adhesie 28-30, groei 31, en ​​differentiatie 32,33. Vanwege de moeilijkheden bij het ​​ontwikkelen reproduceerbare en schaalbare nanofabricated substraten, deze studies konden de meerschalige cellulaire effecten van de in vivo omgeving ECM reproduceren. In dit protocol wordt een eenvoudige en kosteneffectieve nanofabricage techniek om celkweek steigers nabootsen inheemse cardiale ECM vezeluitlijnblok produceren beschreven, waardoor een breed scala van nieuwe onderzoeken van cardiomyocyte-biomateriaal interacties. Begrijpen hoe hartspiercellen interactie met de nanoschaal ECM-omgeving kan zorgen voor de mogelijkheid om cellulaire gedrag te controleren nauwer mimic inheemse weefsel functie. Bovendien celmonolagen zijn een vereenvoudigde experimenteel systeem in vergelijking met 3D-structuren, maar toch vertonen complexe multi-cellulaire gedrag voor inzichtelijke onderzoeken en functionele screening 2,34-36. Tenslotte kunnen dergelijke steigers worden gebruikt om cellulaire transplantaatfunctie verbeteren wanneer geïmplanteerd in het hart voor regeneratieve doeleinden 37.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>NOA 76</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>7606B</td><td></td></tr><tr><td>Surface Adhesion Promotor (Glass Primer)</td><td>Minuta Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PUA</td><td>Minuta Tech</td><td>MINS-311RM</td><td></td></tr><tr><td>Soft Rubber Roller</td><td>Speedball</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafers</td><td>NOVA Electronic Materials</td><td>FA01-9900</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Shipley</td><td>SPRT510</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist Developer</td><td>Shipley</td><td>MF320</td><td></td></tr><tr><td>Electron-Beam Lithography System</td><td>JEOL</td><td>JBX-9300FS</td><td></td></tr><tr><td>Etching System</td><td>Surface Technology Systems</td><td>NP10 8UJ</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher System</td><td>BMR Technology Co.</td><td>DSF-200</td><td></td></tr><tr><td>Ozone Cure System</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-O- 08</td><td></td></tr><tr><td>Fusion Cure System</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-A 11</td><td></td></tr><tr><td>NOA 83H</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Laurel Technology</td><td>WS-400-6NPP</td><td></td></tr><tr><td>Skyrol PET Film</td><td>SKC Co., Ltd.</td><td>23038-59-9</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Glass Slides</td><td>Corning</td><td>2948</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>6/5/2553</td><td></td></tr><tr><td>Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978-1L</td><td></td></tr><tr><td>500 g Weights</td><td>Global Insustrial</td><td>T9FB503120</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr></tbody></table>

capillaire force lithografie voor cardiac tissue engineering

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Hart-en vaatziekten nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd 1. Cardiale tissue engineering houdt veel belofte om baanbrekende medische ontdekkingen te leveren aan de doelstellingen van het ontwikkelen van functionele weefsels voor cardiale regeneratie evenals in vitro screeningstesten. Toch heeft de mogelijkheid om high-fidelity modellen van hartweefsel te creëren moeilijk gebleken. Het hart van extracellulaire matrix (ECM) is een complexe structuur die bestaat uit zowel biochemische en biomechanische signalen variërend van de micro-tot op de nanometer schaal 2. Lokale mechanische belasting voorwaarden en cel-ECM interacties zijn onlangs erkend als vitale onderdelen van de cardiale tissue engineering 3-5. Een groot deel van het cardiale ECM bestaat uitgelijnde collageenvezels met nano-schaal diameter die aanzienlijk beïnvloedt weefselarchitectuur en elektromechanische koppeling 2. Helaas, weinig methoden have in staat geweest om de organisatie van ECM vezels na te bootsen naar beneden tot op de nanometer schaal. Recente ontwikkelingen in nanofabricage technieken, echter, hebben het ontwerp en de fabricage van schaalbare steigers die de in vivo structurele en substraat stijfheid signalen van de ECM in het hart 6-9 nabootsen ingeschakeld. Hier presenteren we de ontwikkeling van twee reproduceerbare, kosteneffectieve en schaalbare nanopatronen werkwijzen voor de functionele aanpassing van hartcellen met het biocompatibele polymeer poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 en een polyurethaan (PU) gebaseerd polymeer. Deze anisotroop nanofabricated substraat (ANF) bootsen de onderliggende ECM goed-georganiseerde, uitgelijnd weefsels en kan worden gebruikt om de rol van nanotopography op celmorfologie en functie 10-14 onderzoeken. Met behulp van een nanopatterned (NP) silicium meester als een sjabloon, wordt een polyurethaan acrylaat (PUA) mal gefabriceerd. Deze PUA mal wordt vervolgens gebruikt om pattern de PU of PLGA hydrogel via UV-ondersteunde of-oplosmiddel gemedieerde capillaire kracht lithografie (CFL), respectievelijk 15,16. In het kort, PU of PLGA pre-polymeer druppel aangebracht op een glazen dekglaasje en de PUA mal is bovenaan geplaatst. Voor UV-geassisteerde CFL, wordt de PU vervolgens blootgesteld aan UV-straling (λ = 250-400 nm) voor de genezing. Voor oplosmiddel gemedieerde CFL, wordt de PLGA reliëf met warmte (120 ° C) en druk (100 kPa). Na uitharding wordt de PUA mal afgepeld, met achterlating van een ANF&#39;s voor celkweek. Primaire cellen, zoals neonatale rat ventriculaire myocyten, alsook menselijke pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten, kan worden gehandhaafd op de ANF 2.

Figuur 1 is een schematisch overzicht van het productieproces voor de twee fabricagemethoden. Door de diffractie van licht door nanoschaal topografie, moet nanopatronen resulteren in een iriserende oppervlak om de ANF. Figuur 2 toont deze iriserende oppervlak een goed gevormde 25 mm NP-PU dekglaasje (Figuur 2A) met 800 nm nok en groef breedte (Figuur 2B). De iriserende uiterlijk van de ANF&#39;s zal enigszins variëren, afhankelijk van de nok en groef br...

In dit protocol demonstreren we de fabricage van biomimetische hartcelcultuursubstraten gemaakt van twee verschillende polymere materialen met behulp van capillaire krachtlitografie. De beschreven methoden bieden een schaalbare, kosteneffectieve techniek om de structuur en functie van macroscopische hartweefsels voor in vitro en in vivo toepassingen te ontwerpen.

Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van biomimetische celcultuursubstraten om de structuur en functie van macroscopisch hartweefsel te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst een siliciummaster met de gewenste topografische architectuur te vervaardigen middels deep reactive ion etching. De tweede stap bestaat uit het overbrengen van het gewenste topografische patroon van de siliciummaster naar een PUA-mal met behulp van UV-ondersteunde capillaire krachtlithografie.Vervolgens wordt de PUA-mal gebruikt als sjabloon voor het vervaardigen van celkweeksubstraten uit diverse polymere materialen, afhankelijk van de gewenste toepassing, via UV-ondersteunde of oplosmiddel-gemedieerde capillaire krachtlithografie. De laatste stap is het uitplaten van primaire of uit stamcellen afgeleide cardiomyocyten op de nanopatroon celkweeksubstraten voor daaropvolgende analyse. Uiteindelijk worden brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om veranderingen in de celmorfologie en de rangschikking van contractiele eiwitten binnen de cardiomyocyten aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microcontactprinten, is d

capillary-force-lithography-for-cardiac-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.

Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken

We presenteren een methode voor microfluïdische depositie van genipine en fibronectine met een patroon op PDMS-substraten, waardoor een langere levensvatbaarheid van weefsels met een hoge dichtheid aan vasculaire gladde spiercellen mogelijk wordt. Deze weefselfabricagemethode wordt gecombineerd met eerdere technologie voor dunne vaatwandfilms om de vasculaire contractiliteit te meten gedurende tijdsverlopen die relevant zijn voor ziekten.

Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Dit protocol beschrijft 3D bioprinting van hartweefsel zonder het gebruik van biomaterialen. 3D bioprinted cardiac patches vertonen mechanische integratie van component sferoïden en zijn zeer veelbelovend in hartweefselregeneratie en als 3D-modellen van hart-en vaatziekten.

Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.

Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils

Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

Driedimensionale hartweefsels die bio-engineered zijn met behulp van van stamcellen afgeleide cardiomyocyten zijn naar voren gekomen als veelbelovende modellen voor het bestuderen van gezond en ziek menselijk myocardium in vitro , terwijl ze de belangrijkste aspecten van de inheemse cardiale niche recapituleren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het vervaardigen en analyseren van gemanipuleerde hartweefsels met een hoog gehalte die zijn gegenereerd uit door de mens geïnduceerde...

Ontwerp van een bioreactor om de data-acquisitie en modeldoorvoer van gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer capillaire force lithografie voor het fabriceren van biomimetische substraten voor hartweefselengineering. Deze schaalbare methode maakt precieze patroonoverdracht mogelijk voor cardiomyocytcultuur en gedragsanalyse.

Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

Meer video's verkennen