Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering
June 10th, 2014
In dit protocol demonstreren we de fabricage van biomimetische hartcelcultuursubstraten gemaakt van twee verschillende polymere materialen met behulp van capillaire krachtlitografie. De beschreven methoden bieden een schaalbare, kosteneffectieve techniek om de structuur en functie van macroscopische hartweefsels voor in vitro en in vivo toepassingen te ontwerpen.
Het algemene doel van deze procedure is om biomimetische celcultuursubstraten te produceren om de structuur en functie van macroschoopse hartweefsels te ontwerpen. Dit wordt bereikt door eerst een siliconen master met de gewenste topografische architectuur te fabriceren door middel van diepe reactieve ionen etching. De tweede stap is om het gewenste topografische patroon over te brengen van de siliconen master naar een PUA-mal met behulp van UV-ondersteunde capillaire kracht lithographie.
Vervolgens wordt de PUA-mal gebruikt als sjabloon om celcultuursubstraten te fabriceren uit verschillende polymere materialen, afhankelijk van de gewenste toepassing, via UV-ondersteunde of oplosmiddel-gemedieerde capillaire kracht lithographie. De laatste stap is om primaire of stamcel-afgeleide cardiomyocyten op de nano patroon celcultuursubstraten te plaatsen voor verdere analyse. Uiteindelijk worden helderveld- en immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om veranderingen in celmorfologie en contractiele eiwitrangschikking binnen de cardiomyocyten te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals micro contact printing, is dat capillaire kracht lithographie nano patroon celcultuursubstraten produceert die structurele uitlijning van hartweefselmonolagen kunnen induceren zonder te vertrouwen op celproliferatie of migratie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te geven in de structuurfuncteverhouding van hartweefsels, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals kanker mechanobiologie. Om de invloed van matrixtopografie op celmigratie te bestuderen, begint u deze procedure door het oppervlak van de siliconen master schoon te maken met 100% ethanol of xyleen en te drogen onder zuurstofstikstofgas.
Plaats vervolgens de siliconen master met het patroon naar boven in een petrischaal voor een siliconen master met een oppervlaktepatroon van twee centimeter bij twee centimeter, en pipet 40 microliters PUA erin. Plaats vervolgens een vel van vier centimeter bij vier centimeter transparant polyesterfolie over de aangebrachte PUA, druk de PET-plaat naar beneden en verspreid de PUA onder de plaat over het patroonoppervlak met behulp van een roller of vlakke randoppervlak zodat het hele patroon wordt bedekt door de PUA-prepolymer. Plaats vervolgens de siliconen master prepolymer en PET ongeveer 10 centimeter onder een 20 watt UV-licht gedurende 50 seconden.
Na het uitsharden verwijdert u de PET-folie langzaam met een pincet. PUA zou zich aan de PET-folie moeten hechten met een negatief van het Silicon Master nanopatroon. Cure vervolgens de P-U-A-P-E-T nanopatronen onder UV gedurende ten minste 12 uur voor gebruik.
Om de Silicon Masters schoon te maken, plaatst u nog een PET-film op de master zonder toevoeging van PUA. Stel het bloot aan UV-licht gedurende 50 seconden en verwijder de PET-film. Spoel vervolgens de siliconen master met 100% ethanol of xyleen en droog onder zuurstofstikstofgas.
In deze procedure behandel je ronde glazen glijbanen van 18 millimeter diameter door ze 10 minuten in een ozonkamer te plaatsen. Plaats vervolgens de glijbanen op blokken PDMS om ze tijdelijk vast te zetten voor eenvoudig hanteren. Breng vervolgens een laag glasprimer aan op het oppervlak van de glazen glijbaan.
Laat de primer 30 minuten aan de lucht drogen. Plaats nu de glazen glijbanen op een stuk printerpapier. Laat 10 microliters polyurethaan prepolymer vallen in het midden van elke glazen glijbaan en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
Plaats vervolgens de PUA-mal met het patroon naar beneden op de glazen glijbaan, verspreid het pu-prepolymer gelijkmatig over het oppervlak van de glazen glijbaan door een rubberen cilinderrol langs de PUA-mal te rollen. Het printerpapier zal de polymere overloop vervolgens absorberen. UV-cure ze gedurende 60 seconden onder een 20 watt UV-lamp. Verwijder vervolgens het monster van de UV-lichtbron en pel voorzichtig de PUA-mal van de PU-gecoate glazen glijbaan. De polymerisatie van de PU wordt als voltooid beschouwd.
Wanneer de PUA-mal zich schoon van het monster afpelt en de PU-glasglijbaan een iriserende uitstraling heeft, plaatst u de monsters dan in een desiccator voor opslag gedurende maximaal een maand. Bevestig nu een NFS-deksel aan een 35 millimeter weefselcultuurpolystyreenschaal, pipet 20 microliters NOA op de bodem van de schaal. Plaats voorzichtig de NPPU-deksel op de NOA en laat de lijm zich verspreiden en de hele bodem van het deksel bedekken. Cure vervolgens NOA door de schaal gedurende 10 minuten aan UV bloot te stellen.
Steriliseer vervolgens de NP SUBSTRATA door het twee keer te spoelen met twee milliliter 70% waterige ethanoloplossing gedurende vijf minuten. Verwijder het ethanol door aspiratie. Laat de A NFS gedurende ongeveer een uur volledig aan de lucht drogen onder de UV-sterilisatielamp in de biologische veiligheidskast.
Om de cellulaire adhesie te verbeteren, bedekt u de A NFS overnacht met fibronectine door de fibronectine eerst in di water te verdunnen tot vijf microgram per milliliter. Pipet vervolgens twee milliliter fibronectine-oplossing in een schaal. Plaats vervolgens de A NFS in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2 overnacht.
Verkrijg NR VM's, HESC CMS of andere hartcellen van belang, centrifugeer het cellenmonster gedurende drie minuten bij 1000 RPM om de cellen te pellen. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. Resuspendeer vervolgens de cellen in kweekmedium tot een concentratie van 4,6 keer 10 tot de zes cellen per milliliter.
Pipet voorzichtig 200 microliters celsuspensie op de gesteriliseerde A NFS en zorg ervoor dat de celsuspensie op het deksel blijft. Plaats vervolgens de cellen in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende vier uur om de cellen aan de A NFS te laten hechten. Voeg vervolgens twee milliliter extra warm kweekmedium toe aan de schaal en plaats de cellen weer in de incubator onder dezelfde omstandigheden.
Verwijder na 24 uur het medium en was met twee milliliter DPBS twee keer om overtollige cellen te verwijderen. Voeg daarna twee milliliter warm kweekmedium toe aan de schaal. Plaats de cellen in
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol demonstreert de fabricage van biomimetische hartcelcultuursubstraten met behulp van capillaire kracht litografie. De beschreven methoden bieden een schaalbare en kosteneffectieve aanpak om macroscopische hartweefsels voor verschillende toepassingen te ontwerpen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Hartweefsel engineering
- Celcultuurtechnieken
- Polymere materialen
Achtergrond
- Biomimetische substraten zijn essentieel voor het bestuderen van hartcellen.
- Capillaire kracht litografie maakt nauwkeurige patterning mogelijk.
- Het ontwerpen van hartweefsels kan in vitro en in vivo studies verbeteren.
- Het gebruik van verschillende polymere materialen kan toepassingen op maat maken.
Doel van het onderzoek
- Om biomimetische celcultuursubstraten te produceren.
- Om de structuur en functie van hartweefsels te ontwerpen.
- Om de analyse van cardiomyocyte gedrag te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een siliconen master met behulp van deep reactive ion etching.
- Overdracht van topografische patronen naar een PUA mal via UV-ondersteunde capillaire kracht litografie.
- Fabricage van celcultuursubstraten uit verschillende polymere materialen.
- Bedekking van cardiomyocyten voor analyse met behulp van microscopietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle overdracht van topografische patronen naar celcultuursubstraten.
- Observatie van veranderingen in celmorfologie.
- Analyse van contractuele eiwitschikking in cardiomyocyten.
- Demonstratie van de effectiviteit van de biomimetische substraten.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het creëren van biomimetische substraten.
- Capillaire kracht litografie is een veelzijdige techniek voor weefselengineering.
- Verdere studies kunnen het begrip van hartcelgedrag verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
