Single-molecule Imaging van genregulatie In vivo Met behulp van Cotranslational Activering door splitsing (CoTrAC)
15 maart 2013
We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC), het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode is gebruikt om de expressie stochastische dynamiek van een transcriptiefactor, de λ repressor CI volgen 1.
Het doel van deze procedure is om time-lapse fluorescentiebeelden te verkrijgen van groeiende e coli kolonies, die co track constructen tot expressie brengen om het aantal nieuw geproduceerde eiwitmoleculen te identificeren. Dit wordt bereikt door eerst een monster van cellen te bereiden, die coex een eiwit van belang fuseren met een fluorescent Cora reporter, en een protease die specifiek klieft tussen de Cora reporter en het eiwit van belang. De tweede stap is het bereiden van een gel van laag smelttemperatuur Aris gemaakt met M negen minimaal media.
Vervolgens wordt een AROS gelpad bereid voor gebruik met een temperatuur gecontroleerde steekproefkamer. De e coli cellen worden op het gel geplaatst en de kamer wordt geassembleerd. De laatste stap is om de kamer op een fluorescentiemicroscoop te plaatsen en meerdere groeiende celkolonies met regelmatige intervallen over meerdere generaties te beeldvormen.
Fotobleken van nieuw geproduceerde TRE rapport moleculen bij elk interval van alle uiteindelijk re wordt gebruikt om tijdsverlopen van eiwitproductie in levende cellen met enkele molecuul- en enkele celresolutie te verkrijgen. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van ex enkele celmetingen met behulp van fluorescentie eiwitfusie is dat de productie van elke kanker van eiwitmoleculen kan worden gevolgd met de enkele molecuul procedure en het resultaat dat moleculen functies beïnvloedt. Om de stam insertsequenties te engineeren, coderend voor een membraanlokalisatiesequentie, een snel rijpende fluorescente proteïne en een protease herkenningssequentie en terminaal aan en in frame met een eiwit van belang in dit specifieke geval, een transcriptiefactor of tf.
In deze procedure werd de membraangetargette TSR veneuze reporter gebruikt. De reporter werd gefuseerd met de protease herkenningssequentie ubiquitine om het aantal geëxprimeerde bacteriën Lambda Repressor, C één eiwitmoleculen te tellen. Na incorporatie van het construct in het e coli chromosoom, wordt het plasmide dat codeert voor protease specifiek voor de herkenningssequentie getransformeerd in een stam die de fluorescente reporter en het eiwit van belang in translationele fusie tot expressie brengt.
In dit protocol werd de protease ubiquitine carboxy Hydro één, die onmiddellijk na de C terminale ubiquitine residu klieft, gebruikt. Om dit protocol te beginnen, kies één e coli kolonie van een vers gestreken agar plaat in één milliliter M negen, minimaal medium aangevuld met één x minimale essentiële medium aminozuren en geschikte antibiotica. Incubeer een schudder op de gewenste temperatuur lang genoeg om een optische dichtheid op 600 nanometer of OD 600 groter dan 1,0 te bereiken.
Verdun vervolgens de cultuur in één milliliter vers M negen medium met geschikte antibiotica tot een OD 600 van 0,02. Incubeer een schudder op de juiste temperatuur, initiële cellulaire dichtheid kan worden verhoogd indien nodig voor groei bij lage temperatuur. Wanneer de OD 600 gelijk is aan 0,2 tot 0,3, begin met het bereiden van de ARO gelpad door 10 tot 20 milligram van laag smelttemperatuur aros in 1,5 milliliter microbuisje af te wegen.
Voeg het juiste volume M negen, minimaal medium zonder antibiotica toe om een 3%arose oplossing te maken. Verwarm vervolgens de arose oplossing gedurende 30 minuten bij 70 graden Celsius om te smelten. Draai de buis om te zorgen dat de oplossing volledig gesmolten en homogeen is.
Voor gelpadassemblage, spoel één voorgereinigd dekglas en één micro aquaduct schuif met steriel water. Droog het dekglas en de schuif door met perslucht te blazen. Plaats de rubberen afdichting op de micro aquaduct schuif zodat deze de inlaten en uitlaten bedekt.
Op de glazen kant van de schuif, breng 50 microliters van ARO oplossing aan op het midden van de micro aquaduct. Schuif de ARO oplossing met het schoongemaakte droge dekglas. Laat de agro oplossing 30 minuten op kamertemperatuur staan.
Wanneer de cellen een OD 600 van 0,3 tot 0,4 bereiken, zijn ze klaar voor beeldvorming. Breng één milliliter van de geïncubeerde cultuur over in 1,5 milliliter micro centrifugeerbuisje en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 keer G in een tafelblad micro centrifuge. Na het weggooien van de SUP agent, voeg één milliliter vers M negen medium en resus toe.
Suspendeer het pellet voorzichtig en centrifugeer de suspensie opnieuw gedurende één minuut bij 10.000 keer G. Herhaal vervolgens de resus centrifugatiestap nog een keer, suspendeer het pellet voorzichtig in één milliliter M negen medium. Op dit punt kunnen cellen worden gebruikt voor microscoop beeldvorming of 10 tot 100 keer worden verdund om lage celdichtheden voor time-lapse beeldvorming te garanderen.
Om een monster voor beeldvorming voor te bereiden, trek voorzichtig het dekglas van de bovenkant van de gelpad af. Voeg één microliter van gewassen celcultuur toe aan de bovenkant van de gelpad. Wacht ongeveer twee minuten totdat de cultuur door de gelpad wordt geabsorbeerd.
Het is belangrijk om niet zo lang te wachten dat de gelpad overdroogt. De ideale tijd zal variëren met temperatuur en luchtvochtigheid tijdens het wachten op droog. Een ander voorgereinigd dekglas.
Zodra het monster is gedroogd, bedek het monster met het nieuwe dekglas en zorg ervoor dat het dekglas en het micro aquaduct schuif goed zijn uitgelijnd. Monteer de temperatuur gecontroleerde groeikamerraam volgens de instructies van de fabrikant. Het kan nu worden gebruikt voor beeldvorming op de microscoop.
Om met beeldvorming te beginnen, zet de laser en microscoop aan volgens de instructies van de fabrikant. Vergrendel de geassembleerde kamer aan de stage insert op de microscoop. Stel de temperatuur van de groeikamerraam en de objectiefverwarmer in op 37 graden Celsius of een andere gewenste groeitemperatuur.
Als beeldvorming boven kamertemperatuur plaatsvindt, zal de focus of gel padd meestal gedurende ongeveer 15 minuten na de initiële temperatuurverschuiving aanzienlijk driften. In de praktijk. Gebruik deze tijd om regio's van belang te vinden en beeldvorming scripts zo nodig aan te passen.
Voor een experiment. Pas de laser excitatie intensiteit aan zodat bijna alle fluorescente moleculen binnen zes belichtingen foto verbleken. Vind cellen op de microscoop en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert de Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC)-methode, waarbij fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om eiwitproductie in levende cellen te visualiseren met single-molecule precisie. De techniek maakt het mogelijk om de dynamiek van transcriptiefactoren waar te nemen zonder de functionaliteit van het eiwit te verstoren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Fluorescentiemicroscopie
- Proteïnedynamica
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitproductie is essentieel voor de celbiologie.
- Traditionele methoden kunnen de functionaliteit van eiwitten verstoren.
- CoTrAC biedt een niet-invasieve imagingtechniek.
- Precisie op enkelmolecuulniveau verbetert de studie van eiwitdynamiek.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het visualiseren van eiwitproductie in levende cellen.
- Het volgen van de expressiedynamiek van transcriptiefactoren.
- Het realiseren van hoge-resolutie beeldvorming zonder verstoring.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van E. coli-cellen die co-track-constructen tot expressie brengen.
- Gebruik van een fluorescerende Cora-reporter voor visualisatie.
- Implementatie van een specifiek protease voor klieving.
- Time-lapse imaging van groeiende celkolonies met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van nieuw geproduceerde eiwitmoleculen.
- Observatie van stochastische expressiedynamiek.
- Demonstratie van niet-invasieve tracking van eiwitfunctionaliteit.
- Inzichten in het gedrag van transcriptiefactoren in levende cellen.
Conclusies
- CoTrAC is een waardevolle tool voor het bestuderen van proteïnedynamica.
- De methode maakt gedetailleerde observatie mogelijk zonder cellulaire processen te verstoren.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse proteïnestudies in levende cellen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Single-molecule imaging van genregulatie met behulp van CoTrAC maakt directe kwantificering van de dynamiek van eiwitproductie in levende cellen mogelijk, wat een ongekende resolutie biedt voor targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Deze benadering ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door real-time meting van ruis in genexpressie en heterogeniteit op single-cell niveau mogelijk te maken. De precisie en het niet-perturbatieve karakter maken deze methode zeer relevant voor portfoliobeslissingen waarbij de functionele eiwitoutput een kritiek kantelpunt vormt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe meting van eiwitsynthesesnelheden mogelijk voor functionele targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het kwantificeren van genexpressieruis in individuele cellen.
- Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden via lineage-opgeloste tracking van eiwitproductie.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van targets met dynamische regulatieprofielen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde, kwantitatieve resultaten voor de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays.
- Maakt de preparatie van robuuste biologische systemen mogelijk voor downstream screening-workflows.
- Ondersteunt schaalbaarheid door gemultiplexte imaging van meerdere kolonies of condities toe te staan.
- Levert single-molecule gevoeligheid voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in live-cell contexten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij system-biology-benaderingen voor studies naar ziekterelevante genregulatie.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door de eiwitproductie in real-time te volgen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door expressievariabiliteit over celpopulaties te kwantificeren.
- Biedt mechanistische inzichten die translationele biomarkerstrategieën informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
CoTrAC positioneert zich op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waarbij hypothese-gestuurde targetvalidatie wordt verbonden met de ontwikkeling van kwantitatieve assays voor preklinisch onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door real-time proteïnequantificatie op single-cell niveau mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor assay-validatie en vergelijkende analyse.
- Analytics: Biedt statistische metingen van proteïneproductie en expressieruis voor robuuste, datagestuurde beslissingen.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert preklinische continuïteit door dynamische tracking van genregulatie in levende cellen mogelijk te maken.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform dat aanpasbaar is aan diverse targets en biologische systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert kwantitatieve imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van assets in de ontdekkingsfase.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist toegang tot gevoelige instrumentatie met nauwkeurige temperatuur- en laserbesturing.
- Maakt standaardisatie van beeldvormingsprotocollen en data-analysepijplijnen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende celtypen of eiwitdoelen.
- Fotobleking en achtergrondcorrectie moeten zorgvuldig worden beheerd voor een nauwkeurige kwantificering.
