Name: Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer super-resolutiebeeldvorming met PALM-microscopie om de FtsZ-ringstructuur in levende E. coli te visualiseren. Deze methode biedt nanometerprecisie voor kwantitatieve analyse van bacteriële celdelingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Inoculeren LB media met een enkele kolonie van stam JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Groeien overnacht in een shaker bij 37 ° C. </li><li> Verdun de kweek 1:1.000 in M9 minimaal medium + [M9 zouten, 0,4% glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, MEM aminozuren en vitaminen] en groeien tot mid-log fase (OD600 = 0.2 tot +0,3) in aanwezigheid van chlooramfenicol (150 ug / ml) bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Laten cultuur met 20 uM IPTG gedurende 2 uur (zie opmerking # 1). </li><li> Korrelkweek in microcentrifuge (8.000 rpm, 1 min) en resuspendeer in een gelijk volume M9 +; repeat. Na de tweede resuspensie verder groei bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Fix geïnduceerde cultuur met 4% paraformaldehyde in PBS (pH = 7,4) bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Korrelkweek en resuspendeer in een gelijk volume PBS; repeat. Als beeldvorming levende cellen, sla fixatie, pellet cultuur, en resuspendeer met een gelijk volumevan M9 - [M9 zouten, 0,4% glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, MEM Amino Acids]; herhalen. </li><li> Verdun gouden kralen 1:10 met geresuspendeerde cultuur. Breng monster aan geprepareerde beeldvorming kamer (zie stap 2.4). </li></ol> [1] Opmerking: De bovenstaande inductie-protocol (stappen 1.1 tot 1.3) is geoptimaliseerd voor de expressie systeem van stam JB281. Gedetailleerde inductie voorwaarden kunnen verschillen voor andere expressiesystemen of eiwitten van belang. 2. Vergadering van de Imaging Kamer <ol><li> Een 3% (w / v) agarose oplossing M9 -. Smelt agarose bij 70 ° C in een bench-top warmte blok voor 40min. Store gesmolten agarose bij 50 ° C gedurende 5 uur. </li><li> Een schone microaqueduct dia in de bovenste helft van de beeldkamer met de elektroden naar beneden. Lijn de onderste pakking op de dia microaqueduct teneinde de perfusie kanalen omvatten. </li><li> Toepassing ~ 50 pi van het gesmolten agarose aan het midden van de ruitglijbaan. Onmiddellijk boven de agarosegel druppeltje met een schone, droge dekglaasje aan. Laat de gel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten stollen. <ol><li> Om coverslips reinigen: regelen dekglaasjes in een keramische houder en ultrasone trillingen gedurende 20 min in roterende baden aceton, ethanol en 1M KOH in glazen potten. Herhalingscyclus drie keer voor een totaal van 9 sonications, gevolgd door een sonicatie in dH 2 O. Bewaar de gereinigde dekglaasjes in verse dH 2 O. Voor gebruik föhnen dekglaasjes met gefilterde lucht. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig het dekglaasje en laat gel pad op de microaqueduct dia. Voeg onmiddellijk 1 ul celkweek monster (zie stap 1.6) naar de top van het gelkussen. Wacht tot 2 minuten, waardoor oplossing worden geabsorbeerd door het gelkussen. Top gel pad met een nieuwe, schone, droge dekglaasje aan. Monteer het geheel beeldkamer volgens instructies van de fabrikant. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Zet de microscoop, camera en lasers. Open Metamorph zachtesoftware (Molecular Devices). </li><li> Passende excitatie / emissie filters in de beeldvormende baan volgen (figuur 1). </li><li> Dienovereenkomstig instellen laser bevoegdheden en overname-instellingen. <ol><li> 488-nm laser = 15 mW (zie opmerking # 2) </li><li> 561-nm laser = 75 mW </li><li> 405-nm laser = 2 mW ± grijsfilter (Zie noot # 3) </li></ol></li><li> Vergrendel beeldvorming kamer in het stadium via de complementaire fase adapter. </li><li> Een passende beeldvorming regio (100x100 pixel) die homogeen wordt verlicht door alle drie lasers. </li><li> Identificeer een monster gebied dat zowel cellen en de vaste markers (goud kralen) in de nabijheid, maar niet overlappen bevat. </li><li> Richten op het oppervlak van cellen het dichtst bij het dekglaasje. Een aan te schaffen helderveld beeld met 50 ms integratietijd en de focus 0,5 micrometer in het monster (figuur 3Ai). </li><li> Acquire ensemble groene fluorescentie beeld met excitatie van het 488-n<html> m laser met behulp van een 50 ms integratietijd (Figuur 3Aii). </li><li> Acquire streaming video in rode kanaal met continue verlichting van 405-nm en 561-nm lasers. Voor vaste cellen, wordt een 50 ms frame rate gebruikt voor een totaal van 20.000 frames (~ 17 min in totaal) met de 405-nm laser vermogen opgevoerd met ~ 10% per 1.000 frames (zie noot # 4). Voor levende cellen wordt een 10 ms frame rate voor een totaal van 3000 frames (~ 30 s totaal) bij een constante 405-nm laservermogen. </li><li> Verplaats de focus naar het ondervlak van de cellen en verkrijgen een helderveld beeld als in stap 3.7. </li></ol> [2] Opmerking: de geïntegreerde intensiteit van de groene fluorescentie van een cel is recht evenredig met het totale aantal FtsZ-mEos2 moleculen die in de cel. De 488-nm excitatie vermogen en ensemble fluorescentie verkrijging instellingen moeten worden constant gehouden voor alle cellen zodat de relatieve FtsZ-mEos2 expressieniveaus in verschillende cellen kunnen worden vergeleken. NHOUD &quot;&gt; [3] Opmerking:. gefixeerde cellen worden afgebeeld met de neutrale densiteit (ND) filter (figuur 1, optische component # 5) in plaats om een langzame activering snelheid zodat elk molecuul nauwkeurig worden geïdentificeerd bereiken The ND filter wordt verwijderd bij beeldvorming levende cellen om de activering te verhogen met behoud van een lage waarschijnlijkheid van twee moleculen gelijktijdig geactiveerd in een buigingsbegrensde gebied. Hoe sneller tarief voor levende cellen beeldvorming nodig om de totale acquisitietijd verminderen, waarbij &quot;bevriezen&quot; van de Z-ring in tijd en beperken van het effect van zonbeschadigde de cel. [4] Opmerking: Het aantal verkregen frames geoptimaliseerd voor ons systeem en zijn afhankelijk van de specifieke celstructuur, etikettering dichtheid activeringscijfer en of uitputting van de gehele pool van fluoroforen is belangrijk voor de analyse. In levende cellen, is het belangrijk om een ​​voldoende aantal gelokaliseerde verkrijgen als korte periode van time mogelijk aan de vervaging van het beeld door beweging van de celstructuur voorkomen. 4. PALM Afbeelding Bouw <ol><li> Bepaal zwaartepunt positie van elke gedetecteerde plek. <ol><li> Laad de afbeelding stapel in Matlab (MathWorks, Inc). </li><li> Snijd de afbeelding stapel om een ​​gebied rond een cel die alle de vaste kralen uitsluit. </li><li> Selecteer een intensiteitdrempel voor spot detectie die boven het achtergrondniveau, maar minder dan de gemiddelde intensiteit spot. We vertegenwoordigen de variatie in achtergrondniveau gedurende een experiment door berekening van het lopende gemiddelde van de maximale intensiteit met een 150 framevenster. De intensiteitdrempel voor elk frame wordt dan geïnterpoleerd uit de lopende gemiddelde waarden. </li><li> Trek de drempel van elk frame. Toekomstige spots worden geïdentificeerd als drie aangrenzende pixels met intensiteit boven de drempel. </li><li> Plaats de fluorescentie-intensiteit van elke potentiële plek voor een tweedimensionale Gaussian functie [Equation # 1] met een niet-lineaire kleinste kwadraten-algoritme (Figuur 2). De lokalisatie nauwkeurigheid van elke spot wordt berekend volgens het aantal gedetecteerde fotonen [Equation # 2]. Een slecht-fit spot met een lokalisatie nauwkeurigheid groter dan 20 nm (gefixeerde cellen) of 45 nm (levende cellen) wordt verwijderd (zie Note # 5). Elke vlek met een intensiteit groter dan twee maal de gemiddelde intensiteit, mogelijk als gevolg van overlappende emitters, ook weggegooid. </li><li> Voor gefixeerde cellen verwijderen herhaalde waarnemingen van hetzelfde molecuul door zonder enige vlek waarvan zwaartepunt positie binnen 45 nm van andere plek die voorafgegaan door 6 frames of minder. Voor levende cellen zijn alle spots behouden. </li></ol></li><li> Kalibreer monster drift met referentiemerkteken beweging. <ol><li> Snijd een 10x10 pixel regio rond een referentiemerkteken. </li><li> Trek de drempel bepaald in 4.1.3 van elk frame. </li><li> Plaats de intensiteit profiel in elkeframe via kleinste kwadraten fitting algoritme uitgaande van een tweedimensionale Gauss vorm. </li><li> Bereken verplaatsing tussen zwaartepunt posities ten opzichte van frame 1. </li></ol></li><li> Corrigeer het zwaartepunt positie van elke unieke molecuul geïdentificeerd in 4.1 met de juiste sample drift berekend in 4.2. Vergelijk de helderveld beelden verkregen in 3.7 en 3.10. Als cellen worden waargenomen ten opzichte van het referentiemerkteken markers, worden de gegevens weggegooid. </li><li> Lijn alle gecorrigeerde zwaartepunt posities op een enkel beeld bestaat uit 15x15 pixels nm. Teken de unieke molecule als eenheid-gebied tweedimensionale Gaussische profiel gecentreerd op de centroïde positie met een standaarddeviatie gelijk aan de lokalisatie precisie [Equation # 2]. Dit resulteert in een waarschijnlijkheidsdichtheid kaart, waarbij een pixel intensiteit evenredig is het waarschijnlijk dat een molecuul dat pixel (figuur 3Aiv). </li><li> Vergelijken PALM beelden naar ensemble beelden. <ol><li> Replot het centroid posities in 4.4, maar op een vliegtuig met 150x150 pixels nm en een standaarddeviatie gelijk aan 250 nm. Dit genereert een PALM beeld dat een buigingsbegrensd beeldveld dat kan worden gebruikt om te vergelijken met de buigingsbegrensde, ensemble beeld verkregen in 3.8 (figuur 3Aiii) nabootst. </li><li> Om te bevestigen dat de gedetecteerde moleculen representatief zijn voor de hele bevolking, vergelijk de gereconstrueerde ensemble (Figuur 3Aiii, stap 4.5.1) met de experimentele ensemble fluorescentie beeld (Figuur 3Aii, stap 3,8) om te bevestigen dat de beide beelden structuren met een soortgelijke vorm geven , oriëntatie en relatieve intensiteit. </li></ol></li></ol> [5] Opmerking: De minimaal vereiste nauwkeurigheid lokalisatie werd empirisch bepaald voor elke beeldvormingswerkwijze getrokken waarbij de precisie van alle moleculen van een gegeven monster en selecteren van een geschikt cutoff. 5. PALM Beeldanalyse <ol><li> Het meten van Z-Ring Width en diameter. <ol><li> Draai de PALM beeld om verticaal oriënteren van de lengteas van de cel (Figuur 4A). </li><li> Snijd de cellulaire gebied dat de Z-ring. </li><li> Bereken de cumulatieve intensiteit door het projecteren van een intensiteit profiel langs lang de cel as. </li><li> Monteer de intensiteit profiel naar een Gaussische verdeling. De ring breedte wordt gedefinieerd als de volle breedte half maximum (FWHM) van de gemonteerde Gaussische verdeling (figuur 4B). </li><li> Project de cumulatieve intensiteit profiel van 5.1.2 langs korte van de cel-as. De ring diameter wordt gedefinieerd als de volledige lengte van het intensiteitsprofiel (Figuur 4C). </li></ol></li><li> Plotten FtsZ Dichtheid (zie noot # 6). <ol><li> Replot het zwaartepunt posities zoals in (4.4), maar zonder de Gaussian profiel zodat elke unieke molecule wordt een waarde van 1 gegeven en aan een enkele pixel op de centroïde positie. Op deze manier de intensiteit van elkepixel is het totale aantal moleculen ontdekt dat pixel. De Density PALM afbeelding kan ook worden gevisualiseerd als een contour plot (Figuur 5E). </li></ol></li><li> Het bepalen van Ruimtelijke resolutie. <ol><li> Theoretisch haalbare ruimtelijke resolutie: een vertegenwoordiger PSF voor het gehele monster met de gemiddelde precisie bepaald lokalisatie van alle ontdekte moleculen en bereken de FWHM (vergelijking # 3). </li><li> Experimenteel ruimtelijke resolutie verkregen: bereken het gemiddelde verplaatsing tussen herhaalde waarnemingen van hetzelfde molecuul. </li></ol></li></ol> [6] Opmerking: Wij gebruikten totale interne reflectie PALM (TIR-PALM figuur 1 en 5) om de activering en excitatie een dunne laag (~ 200 nm) boven de cel / glas-interface beperken. zodat alleen FtsZ moleculen geassocieerd met de membraan die het dichtst bij het dekglaasje worden gedetecteerd.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
<li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li>
<li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+%28ftsZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li>
<li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings%2C+structural+homologs+of+tubulin+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+%28PALM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li>
<li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers%3A+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li>
<li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li>
<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

PALM beelden bevatten informatie over molecule telt en posities binnen een cel, waardoor gedetailleerde analyse van de verdeling en plaatsing van doeleiwit moleculen die moeilijk te bereiken met andere middelen. Hieronder geven we een overzicht van voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen om accurate kwantitatieve informatie halen met behoud van de biologische relevantie van PALM beelden. We verkennen ook de informatie die het best kan worden verkregen met behulp van live vs vaste cellen. Tot slot raden we mogelij...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 50 x MEM Amino Acids </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM vitamines </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102 RF- </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> Electron Micrsocopy Wetenschappen </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG Agarose </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Goud Kralen </td><td> Microspheres-nanosferen </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imaging Kamer </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stage-adapter </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde microscoop </td><td> Olympus </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x Doelstelling </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Camera </td><td> Andor Technology </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Sapphire Laser </td><td> Samenhangend </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Sapphire Laser </td><td> Samenhangend </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Laser </td><td> Samenhangend </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging van de bacteriële division machinery

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacteriële celdeling vereist de gecoördineerde verzameling van meer dan tien essentiële eiwitten op midcell 1,2. Centraal in dit proces is de vorming van een ringvormige suprastructuur (Z-ring) van de FtsZ eiwit op perceelsgrenzen 3,4. De Z-ring uit meerdere enkelstrengs FtsZ protofilamenten en begrijpen van de opstelling van de protofilamenten in de Z-ring inzicht in het mechanisme van Z-ringarmatuur en zijn functie als krachtgenerator 5,6. Deze informatie is moeilijk te realiseren vanwege huidige beperkingen in conventionele fluorescentie microscopie en elektronenmicroscopie. Conventionele fluorescentiemicroscopie staat is een hoge resolutie van de Z-ring door de diffractielimiet van licht (~ 200 nm) te verschaffen. Electron cryotomographic beeldvorming heeft gedetecteerd verspreid FtsZ protofilamenten in kleine C. crescentus cellen 7, maar is moeilijk toepasbaar op grotere cellen zoalsE. coli of B. subtilis. Hier de toepassing van een super-resolutie fluorescentie microscopie methode beschrijven, fotogeactiveerde Localization Microscopy (PALM) kwantitatief kenmerken de structurele organisatie van de E. coli Z-ring 8. PALM beeldvorming biedt zowel een hoge ruimtelijke resolutie (~ 35 nm) en specifieke etiketteringsvoorschriften om eenduidige identificatie van doeleiwitten mogelijk te maken. We gelabeld FtsZ de fotoactiveerbare fluorescerend eiwit mEos2, die van groene fluorescentie (excitatie = 488 nm) schakelt rode fluorescentie (excitatie = 561 nm) bij activering bij 405 nm 9. Tijdens een PALM experiment, worden enkele FtsZ-mEos2 moleculen stochastisch geactiveerd en de bijbehorende zwaartepunt posities van de individuele moleculen worden bepaald met &lt;20 nm precisie. Een super-resolutie afbeelding van de Z-ring wordt vervolgens gereconstrueerd door superpositie van het zwaartepunt posities van alle gedetecteerde FtsZ-mEos2 moleculen. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Met deze methode is dat de Z-ring een vaste breedte van ~ 100 nm heeft en bestaat uit een losse bundel FtsZ protofilamenten die met elkaar overlappen in drie dimensies. Deze gegevens fungeren als aanknopingspunten voor verder onderzoek van de celcyclus afhankelijke veranderingen van de Z-ring 10 en kan worden toegepast op andere eiwitten van belang.

In figuur 3Aiv een tweedimensionale superresolutie weergave van de Z-ring gegenereerd uit de PALM imaging hierboven beschreven werkwijze. Hieronder vatten we kwalitatieve en kwantitatieve informatie die kan worden verkregen van hen. Kwalitatief we vast dat de Z-ring is een onregelmatige structuur die verscheidene configuraties (een band of spiraalvormige boog) die niet te onderscheiden in conventionele fluorescentiebeelden (vergelijk Figuur 3A-Dii en <strong...

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om kwantitatieve structurele informatie te verkrijgen over de celdelingsproteïnen van e coli in hun natuurlijke omgeving. Dit wordt bereikt door een foto-activiteit fluorescerende fusieproteïne te gaan tonen in levende cellen en deze cellen te immobiliseren op een acrogelpad. De cellen worden vervolgens geïmagerd via streaming video.Terwijl excitatie- en activeringslasers worden toegepast om locatie van enkele moleculen te visualiseren, worden de resulterende films computationeel geanalyseerd om de molecuulposities met nanometernauwkeurigheid te extraheren en deze te superponeren om een superresolutie-afbeelding te genereren. Deze afbeelding kan vervolgens worden geanalyseerd door verschillende kwantitatieve metingen die de structuur van belang beschrijven, inclusief de dimensies en molecuuldichtheid. Fotogeactiveerde lokalisatie, microscopie of PALM is een gemakkelijk te implementeren superresolutie-fluorescentiemicroscopietechniek.De instrumentatie is eenvoudig, maar zorgvuldige optimalisatie van dataverwerving en analyse is vereist om betrouwbare resultaten te genereren. Een andere cruciale stap is de mate van karakterisering van uw fusieproteïne en expressieniveau om ervoor te zorgen dat uw resultaten biologisch relevant zijn. Het volgende protocol werd geoptimaliseerd voor het FTSZ-proteïne gefuseerd met Muse twee en moet worden aangepast aan uw proteïne van belang.Begin met het inoculeren van LB-media met een enkele kolonie van de stam van belang die een fluorescerend getakte proteïne bevat, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Laat deze video vergezellen, groei een nacht in een shaker bij 37 graden Celsius de volgende dag. Verdun de cultuur één op 1000 in M negen plus minimaal media.Groei tot midden logfase in de aanwezigheid van geschikt antibioticum bij kamertemperatuur en induceer vervolgens de cultuur om proteïne te produceren met 20 micromolair IPTG gedurende twee uur. Verzamel ondertussen de beeldvormingskamer door een 3%agro-oplossing in M negen minus media te maken. Smelt de agro's bij 70 graden Celsius in een benchtop-hitteblok gedurende 40 minuten.Bewaar de gesmolten agro's bij 50 graden Celsius gedurende maximaal vijf uur. Plaats een schone micro-aqueductslide in de bovenste helft van de beeldvormingskamer met de elektroden naar beneden gericht. Lijn de onderste afdichting op de micro-aqueductslide uit om de perfusiekanalen te bedekken.Breng ongeveer 50 microliter van de gesmolten aros aan op het midden van het glas. Schuif onmiddellijk de geldroplet van de Agros met een schone, droge dekschuif aan. Laat de gel gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur stollen na de proteïne-inductie.Pellet de cultuur in een microcentrifuge. Susp. Suspendeer de pellet in een gelijk volume M negen plus, herhaal centrifugatie en suspensie na de tweede suspensie. Vervolg de groei bij kamertemperatuur gedurende twee uur.Fixeer vervolgens de geïnduceerde cultuur door paraform-aldehyde in PBS toe te voegen om een ​​eindconcentratie van 4% paraform-aldehyde te bereiken. Als u levende cellen beeldt, zie het schriftelijke protocol dat deze video vergezelt voor variaties in de procedure, laat de cultuur gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Pellet de cultuur en resuspendeer in een gelijk volume PBS.Verdun vervolgens 50 nanometer gouden korrels, één op 10 met Resuspendeerde cultuur. Om het monster toe te passen op de voorbereide beeldvormingskamer, verwijdert u voorzichtig de dekschuif en laat u het gelpad op de micro-aqueductslide. Voeg onmiddellijk één microliter van het cellencultuurmonster toe aan de bovenkant van het gelpad.Laat ongeveer twee minuten voor de oplossing door het gelpad wordt geabsorbeerd en bedek het gelpad met een nieuwe schone, droge dekschuif. Ga door met het samenstellen van de hele beeldvormingskamer volgens de instructies van de fabrikant voor beeldacquisitie. Schakel de microscoopcamera en lasers in.Open metamorfosesoftware van moleculaire apparaten. Plaats geschikte excitatie- en emissiefilters in de beeldvormingsroute zoals afgebeeld in dit microscoopschema, dat te vinden is in de geschreven procedure die deze video vergezelt. Stel vervolgens de laserkrachten en acquisitie-instellingen in.Vergrendel de beeldvormingskamer op de juiste manier in de stage via de complementaire stageadapter. Focus op het oppervlak van cellen het dichtst bij de dekschuiflip. Bepaal een geschikt beeldvormingsgebied dat homogeen wordt verlicht door alle drie de lasers.Identificeer een monstergebied dat zowel cellen als fiduciale markers bevat, dat zijn de gouden korrels in de naaste nabijheid maar niet overlappend. Verwerf één helderveldbeeld met een integratietijd van 50 milliseconden en verplaats de focus 0,5 micrometer in het monster. Verwerf vervolgens een ensemble groen fluorescentiebeeld met excitatie van de 488 nanometer laser met een integratietijd van 50 milliseconden.Verwerf vervolgens streaming video met continue verlichting van 405 nanometer en 561 nanometer lasers. Voor vaste cellen wordt een framerate van 50 milliseconden gebruikt voor een totaal van 20.000 frames. Met de 405 nanometer laserkracht verhoogd met ongeveer 10% elke 1000 frames hier, worden de eerste 500 frames getoond.Merk op dat het aantal verworven frames voor dit systeem is geoptimaliseerd en afhankelijk is van de specifieke cellulaire structuur. Labeldichtheid activeringssnelheid en of het hele reservoir van vloerlagen wordt uitgeput is belangrijk voor analyse Om beeldacquisitie uit te voeren. Identificeer eerst potentiële plekken in de beeldstroom als drie aangrenzende pixels met intensiteiten boven een empirisch bepaalde drempel. Pas de intensiteit van elke potentiële plek aan op een tweedimensionale Gaussiaanse functie.Om de molecuulpositie en het totale aantal uitgezonden fotonen te identificeren, bereken de lokalisatiepositie van elke plek met behulp van het totaal aantal gedetecteerde fotonen. Verwijder vervolgens slecht passende plekken door een drempel van de lokalisatieprecisie toe te passen en verwijder herhaalde waarnemingen van dezelfde molecuul door elke plek te negeren die binnen 45 nanometer en zes frames van elke voorgaande plek correct is voor monsterdrift. Door de frameafhankelijke verplaatsing van de gouden korrels van elke molecuulpositie af te

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)...

Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor PmbExM, een expansiemicroscopietechniek die speciaal is ontworpen voor Proteus mirabilis-biofilms . PmbExM maakt gebruik van een stapsgewijze enzymatische behandeling van biofilmmonsters om een isotrope, 4,3-voudige expansie te bereiken, waardoor superresolutieanalyse van de ruimtelijke organisatie van cellulaire en subcellulaire structuren binnen deze sessiele microbiële gemeenschappen mogelijk is.

Superresolutiebeeldvorming van Proteus mirabilis Biofilm door uitbreidingsmicroscopie

Leer super-resolutiebeeldvorming met PALM-microscopie om de FtsZ-ringstructuur in levende E. coli te visualiseren. Deze methode biedt nanometerprecisie voor kwantitatieve analyse van bacteriële celdelingsmechanismen.

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Meer video's verkennen