Name: Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer DNA-schade analyseren in hippocampale neuronen met de comet assay. Deze methode maakt kwantificering van enkel- en dubbelstrengsbreuken mogelijk voor onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de IMPACT Award van de afdeling Radiotherapie van de Universiteit van Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, de Fighting Children&#39;s Cancer Foundation, en de Gabrielle&#39;s Angel Foundation (tot ESY.).

1. Cultuur van de Cel <ol><li> Cultuur neuronale cellen en behandelen hen als dat nodig is. </li><li> Oogst cellen in 15 ml buizen: aspiraat media, spoelen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, calcium en magnesium vrij), voeg trypsine in 15 ml buizen en trypsine passende serum bevattend medium te neutraliseren. </li><li> Spin bij 1000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren media. </li><li> Resuspendeer cellen in PBS. </li><li> Spin bij 1000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig media en resuspendeer cellen in verse PBS. </li><li> Tellen cellen met behulp van een hemacytometer of uw favoriete celteller. </li><li> Celmonsters onmiddellijk worden bereid voordat de assay. </li><li> Alle monsters worden behandeld in het donker of licht gele DNA schade ultraviolet licht te voorkomen. </li></ol> 2. Comet Assay 1. Het prepareren van objectglaasjes <ol><li> Smelt 1% agarose (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, boorzuur, EDTA, TBE) in een magnetron 3 min totdat alle korrels verdwijnen. </li><li> Dip dia&#39;s in de gesmolten agarose en veeg een kant schoon met een Kimwipe. Laat de agarose aan de lucht drogen om een ​​transparante film. Dit kan vooraf slides worden opgeslagen. </li></ol> 2. Neutraal Comet Assay <ol><li> Chill lysis oplossing (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% natrium lauryl sarcosinaat, en 1% Triton X-100, pH 10) bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik. </li><li> 2.2.2. Smelt 1% laag smeltpunt agarose (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, boorzuur, EDTA) in een magnetron 3 min totdat alle korrels verdwijnen. De agarose te koelen tot 37 ° C in een waterbad te voorkomen kunstmatige inductie van komeetstaartkanon. Idealiter de agarose te koelen gedurende een half uur voor gebruik. </li><li> 2.2.3. Verdun de celsuspensie zodat er 100.000 cellen per ml. Combineer de celsuspensie met laag smeltpunt agarose (bij 37 ° C)een verhouding van 1:10 (v / v), vortex kort en direct Pipetteer 50 ul op de Comet Slide. Gebruik de zijkant van de pipetpunt aan de celsuspensie gelijkmatig over het testgebied. Elke behandelingsgroep moet ten minste in drievoud. </li><li> Plaats de glaasjes plat in de koelkast gedurende 30 minuten tot een cirkel verschijnt in de periferie van de dia. </li><li> Prechill de lysisoplossing en dompel slides in deze oplossing gedurende 30 minuten in het donker bij 4 ° C (of in de koelkast). </li><li> Giet of zuigen de lysisoplossing en 1X voeg neutrale elektroforese buffer (Tris base, boorzuur, EDTA, 1X TBE). Laat dia&#39;s in deze buffer voor een half uur in de koelkast. </li><li> Voeg voorgekoelde 1X Neutraal elektroforesebuffer (TBE) in elektroforese kamer, plaats dia&#39;s in elektroforese slide tray. Lijn slides zodat zij op gelijke afstand van elektroden. </li><li> Giet 1X neutrale elektroforese tot bufferen tot 0,2 centimeter boven dia&#39;s. Overtollige buffer zal onderFere met elektroforese. </li><li> Stel voedingsspanning tot 1 V per cm (gemeten elektrode naar elektrode) en gedurende 30 min bij 4 ° C (of de cel) in het donker. </li></ol> 3. Alkaline Comet Assay <ol><li> Chill lysis oplossing (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% natrium lauryl sarcosinaat, en 1% Triton X-100, pH 10) bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik. </li><li> Smelt 1% laag smeltpunt agarose (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, boorzuur, EDTA) in een magnetron 3 min totdat alle korrels verdwijnen. Vervolgens afkoelen in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 30 minuten. </li><li> Combineer cellen bij 1 x 105 / ml met gesmolten laag smeltpunt agarose (bij 37 ° C) in een verhouding van 1:10 (v / v), vortex kort en direct 50 ui pipet op de Comet Slide. Gebruik de zijkant van de pipetpunt aan de celsuspensie gelijkmatig over het testgebied. Elke behandelingsgroep moet ten minste in drievoud. </li><li> Plaats geschovenes plat in de koelkast gedurende 30 minuten tot een cirkel verschijnt in de periferie van de dia. </li><li> Dompel de objectglaasjes in voorgekoelde lysis oplossing en laat bij 4 ° C gedurende 1 uur om &#39;s nachts in het donker. </li><li> Verwijder de dia&#39;s van de lysis oplossing, laat u de dia&#39;s en spoel een keer met koud neutralisatiebuffer gedurende 5 minuten om zeepresten en zouten te verwijderen voorafgaand aan het alkali-afwikkelen stap. </li><li> Plaats de glaasjes in een gel elektroforese kamer gevuld met verse voorgekoelde elektroforese buffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH&gt; 13) niet tot 0,5 cm boven dia overschrijden. Lijn slides zodat zij op gelijke afstand van elektroden. </li><li> Laat slides in de alkalische buffer zitten voor 30 min in het donker mogelijk te maken afwikkelen van het DNA en de expressie van alkali-aansprakelijk schade. </li><li> Stel voedingsspanning tot 1 V per cm (gemeten elektrode de elektrode) en 30 min bij 4 ° C uitgevoerd (of cel). </li></ol> 4. Bevestiging en Staining Cellen <ol><li> Giet het overtollige elektroforesebuffer </li><li> Dompel de objectglaasjes in voorgekoeld gedestilleerd water gedurende 5 min bij RT. </li><li> Dompel de objectglaasjes in voorgekoeld 70% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Droge monsters een nacht. Niet blootstellen dia&#39;s aan fel licht. Monsters kunnen maanden opgeslagen bij kamertemperatuur voor het maken van dit stadium. </li><li> Vlek dia door onderdompeling in SYBR Green (1X verdund in PBS) gedurende 20 minuten in de koelkast. </li><li> Verwijder dia&#39;s en laat ze goed drogen in het donker. De agarose wordt transparant als het geheel droog. </li></ol> 4. Image Acquisition and Analysis <ol><li> Acquire beelden met behulp van fluorescentie microscoop ingesteld op de groene filter (Zeiss AxioVision) en analyseren met behulp van Comet Assay software (Perceptive Instruments). </li><li> Op de &quot;comet head&quot; (de kern) en berekent de software de parameters inclusief de gemiddelde staart moment hoeveelheid DNA in dekern. </li><li> Analyseren ten minste 200 cellen per behandeling. </li><li> Gegevens exporteren naar Microsoft Excel. </li><li> Bereken betekenen staart moment voor elke behandelingsgroep en plotgegevens naargelang het geval. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van comet assay analyse van neuronale cellen wordt getoond in Figuur 2 en Figuur 3. In dit geval bestraling van de neuronale cellen induceert DNA schade. De cellen worden onderworpen aan het elektrische veld, de DNA migreert met verschillende snelheden door verschillen in grootte, die vervolgens wordt geanalyseerd op de Comet Assay software. Hoe meer de DNA schade, hoe verder de DNA migreert uit de kern. Dit vermindert de fluorescentie-intensiteit in de kern, die vervolgens wordt opgepikt door de software en resulteert in hogere staart moment. Tabel 1 geeft een representatief tafel comet assay analyse en Figuur 4 een representatievetieve grafiek die DNA schade in neuronale cellen na bestraling zoals gemeten door de comet assay. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Stroomschema van de komeet assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Representatieve beelden van neuronale cellen (A) en zonder (B) met komeetstaartkanon. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Comet assay analyse met Comet Assay software. (A) Vertegenwoordiger screen shots van het beeld verkregen met Carl Zeiss fluorescentie microscoop en geanalyseerd met behulp van CometAssay software. (B) te klikken op de kern of het &quot;komeet hoofd&quot; (omcirkeld in groen) genereert een fluorescerende kaart en grafiek (geel omcirkeld) en een (C) gegevenstabel (rood omcirkeld). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Figuur 4"/> Figuur 4. Representatieve grafiek verkregen door het uitzetten van de gemiddelde staart tijdstip verkregen door analyse van DNA schade in bestraalde en niet-bestraalde neuronale cellen met neutrale comet assay. Zoals verwacht 3Gy straling (x-ray) veroorzaakt DNA beschadiging zoals afgebeeld door de hogere gemiddelde staart moment in de bestraalde neuronale cellen. Getoond wordt de gemiddelde staart moment (+ / - standaardfout), ** p &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tabel 1"/> Tabel 1. </strong&gt; Vertegenwoordiger tabel verkregen door comet assay analyse van bestraalde en niet-bestraalde neuronale cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay.+An+overview+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li>
<li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li>
<li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li>
<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De komeet assay heeft de unieke capaciteit van het analyseren van individuele cellen. Dit is voordelig in identificatie van subpopulaties van cellen die andere reactie op cytotoxische middelen tonen. Een aantal praktische beperkingen moeten worden gehouden. Het aantal cellen die afzonderlijk kunnen worden geëvalueerd kan variëren afhankelijk van het individu. De steekproefomvang te worden verhoogd indien er variatie in DNA schade binnen een populatie. Levensvatbare enkele celsuspensie noodzakelijk is voor deze assay sin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> 1,5 ml buisjes </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris base, boorzuur, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tube </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumfolie </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Beker </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Comet Assay software </td><td> Comet Assay IV Image Analysis System </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cilinder </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroforese kamer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Tl microscoop met groene filter voldoende </td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Laag smeltpunt agarose </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Magnetronoven </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, calcium vrij, magnesium free </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Voeding </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Koelkast </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heerser </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schuif </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxide </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium lauryl sarcosinaat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Dienblad </td><td> Fishaar wetenschappelijke </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Draaikolk </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Waterbad </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

analyseren dna schade in hippocampale neuronen met behulp van de comet assay

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Een aantal geneesmiddelen gericht op de DNA herstel routes en induceren celdoding door het creëren van DNA schade. Zo zijn processen om rechtstreeks DNA-beschadiging uitgebreid geëvalueerd. Traditionele methoden zijn tijdrovend, duur, arbeidsintensief en vereisen replicerende cellen. In tegenstelling, de comet assay, een cel gelelektroforese assay, een snellere, niet-invasieve, goedkoop, direct en gevoelige meting van DNA schade en herstel. Alle vormen van DNA-schade en DNA-herstel kan worden gevisualiseerd op de enkele cel niveau met behulp van deze krachtige techniek. Het uitgangspunt van de comet assay is dat intact DNA sterk geordende terwijl DNA-schade verstoort deze organisatie. De beschadigde DNA sijpelt in de agarose matrix en wanneer onderworpen aan een elektrisch veld, het negatief geladen DNA migreert naar de kathode die positief geladen is. De grote onbeschadigd DNA strengen kunnen niet ver van de kern migreren. DNA schademaakt kleinere DNA fragmenten die groter bereik dan het intacte DNA. Comet Assay een beeldanalyse software, meet en vergelijkt de totale fluorescentie-intensiteit van de DNA in de kern met DNA dat uit gemigreerd van de kern. Fluorescerend signaal van de gemigreerde DNA evenredig is met DNA schade. Langere helderder DNA staart betekent verhoogde DNA-schade. Enkele parameters die gemeten zijn staart moment dat een maat is voor zowel de hoeveelheid DNA en de verdeling van DNA in de staart, staartlengte en het percentage DNA in de staart. Deze test maakt het mogelijk om DNA repair meten en aangezien resolutie van DNA schade betekent herstel heeft plaatsgevonden. De grens van de gevoeligheid is ongeveer 50 breuken per diploïde zoogdiercellen 1,2. Cellen behandeld met een DNA beschadigende middelen, zoals etoposide, kan worden gebruikt als een positieve controle. Dus de comet assay is een snelle en effectieve procedure DNA schade te meten.

De komeet assay is een efficiënte manier voor het opsporen enkel-en dubbel-breuken, met inbegrip van alkali-labiele sites en DNA-DNA/DNA-protein cross-links op het DNA in alle cellen met inbegrip van hippocampale neuronen. De methode maakt gebruik van de differentiële migratie van DNA in een elektrisch veld als gevolg van verschillen in hoeveelheid DNA schade.

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Het algemene doel van deze procedure is om de hoeveelheid DNA-schade in neuronen te meten en te kwantificeren met behulp van de COMET-test. Dit wordt bereikt door de neuronen eerst bloot te stellen aan verschillende DNA-beschadigende omstandigheden, de neuronen te verzamelen en ze te mengen met laag smeltpunt aros. De tweede stap is het immobiliseren van de neuronen op slides.Vervolgens worden de neuronen gelyseerd en vervolgens onderworpen aan elektroforese in de laatste stap. Het DNA wordt gekleurd met cybergroen. Uiteindelijk worden fluorescentiemicroscopie en de COMET-testsoftware gebruikt om de niveaus van DNA-schade in individuele neuronen te visualiseren en te kwantificeren.Hallo, mijn naam is Eddie Yang en ik ben assistent-professor in de afdeling Radiatie-oncologie aan de Universiteit van Alabama in Birmingham. Vandaag zullen we de COMET-test demonstreren, een eenvoudige methode om DNA-schade in cellen te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden zoals de Gamma H two A X foci-kleuring, evenals de pulse field gel elektroforese, is dat deze techniek een directe en gevoelige methode is om DNA-schade te meten.Bovendien kan met kleine aanpassingen van deze techniek het type DNA-schade worden bepaald, omdat veel kankertherapieën werken door DNA-schade in tumoren te induceren en vaak werken door de DNA-reparatiecapaciteit te veranderen. De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar de effectiviteit van kankertherapie. Het demonstreren van de procedure vandaag zal Ms. Samara Noshin zijn, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, Begin met het oogsten van neuronale cellen behandeld onder de gewenste experimentele omstandigheden in 15 milliliter buizen.Centrifugeer de buizen vijf minuten bij 1000 keer G en vier graden Celsius na het aspireren van de supernatant resus. Sla de pellet op in PBS en centrifugeer de cellen vervolgens weer neer na de tweede wassing. Resus sla de cellen op in meer PBS, tel ze en bewaar ze in het donker totdat ze worden gebruikt in de comet-test.Om DNA-schade te voorkomen voordat u begint met de come-test, smelt u 1% aros in een magnetron gedurende drie minuten totdat alle korrels verdwijnen. Dompel vervolgens de slides in de gesmolten agros en veeg een kant schoon met een Kim-doek. Laat de agros uitdrogen tot een transparante film terwijl de agros wordt gekoeld bij lysisoplossing op vier graden Celsius gedurende ten minste een uur en smelt meer.1% lage smeltpunt agros.Cool. Koel deze batch van agros tot 37 graden Celsius in een waterbad gedurende een half uur. Om de kunstmatige inductie van een komeetstaart te voorkomen, verdunt u nu de geoogste neuronale celsuspensie zodat er 100.000 cellen per milliliter zijn.Combineer de celsuspensie met de 37 graden Celsius lage smeltpunt agros in een verhouding van één tot tien, kort kloppen en gebruik onmiddellijk de zijkant van een pipettip om 50 microliters van de celsuspensie gelijkmatig over het monstergebied van de luchtdroger te verspreiden comet-Slide. Plaats de behandelde slides plat in de koelkast gedurende 30 minuten totdat er een cirkel verschijnt in de periferie van de slide. Dompel vervolgens de slides in de voorgekoelde lysisoplossing in het donker bij vier graden Celsius.Na 30 minuten, aspireer de lysisoplossing. Behandel vervolgens de slides in een x neutraal elektroforesebuffer gedurende een half uur in de koelkast. Voeg vervolgens voorgekoelde een x neutraal elektroforesebuffer toe aan een elektroforesekamer en plaats vervolgens de slides in de elektroforese-slidebak, waarbij de slides worden uitgelijnd zodat ze gelijkmatig op afstand zijn van de elektroden.Nadat de kamer voldoende is gevuld om de slides te bedekken met 0,2 inch van een x neutraal elektroforesebuffer, stelt u de voedingsspanning in op één volt per centimeter en voert u de test uit in het donker gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Begin met het onderdompelen van nieuwe agros en behandelde neuronale cellen in verse voorgekoelde lysisoplossing en incubeer ze vervolgens in het donker bij vier graden Celsius gedurende één uur tot een nacht. Verwijder vervolgens de slides uit de lysisoplossing, giet ze af en spoel ze vervolgens één keer met koud neutralisatiebuffer gedurende vijf minuten om eventuele resten te verwijderen voorafgaand aan de alkalische wikkelstap.Plaats vervolgens de slides in een gelelektroforesekamer gevuld met voorgekoelde, vers gemaakte elektroforesebuffer niet hoger dan 0,5 centimeter boven de slides. Incubeer de slides gedurende 30 minuten in het donker in de alkalische buffer om de ontwindende van het DNA en de expressie van de alkali-vatbare schade mogelijk te maken. Voer vervolgens de test uit bij één volt per centimeter gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Na het uitvoeren van de comet-test, giet u het overtollige elektroforesebuffer en dompelt u de slides in voorgekoeld gedistilleerd water op kamertemperatuur. Na vijf minuten dompelt u de slides in voorgekoeld, 70% ethanol, ook op kamertemperatuur. Na nog vijf minuten, laat de monsters overnacht drogen, houd ze uit felle licht.Vervolgens kleurt u de slides in cybergroen in de koelkast gedurende 30 minuten. Verwijder nu de slides en laat ze volledig drogen in het donker. De aros worden transparant wanneer ze volledig droog zijn.Gebruik een fluorescentiemicroscoop ingesteld op de groene filter om beelden van de test te verkrijgen. Open vervolgens het COMET-testprogramma om de verworven beelden te analyseren. Door op de komeetkopknop te klikken, berekent de software de parameters, inclusief het gemiddelde staartmoment en de hoeveelheid DNA in de kern.Na het analyseren van minimaal 200 cellen per behandeling, exporteert u de gegevens naar Microsoft Excel voor het berekenen van het gemiddelde staartmoment en het plotten van gegevens. Deze eerste figuur toont een voorbeeld van een COMET-testanalyse van neuronale cellen met en zonder een komeetstaart. In deze tweede komeet-test, geanalyseerd met behulp van de COMET-testsoftware, werd bestralingsschade van de neuronale cellen bepaald om DNA-schade te induceren, aangezien de cellen werden onderworpen aan het elektrische veld.Het DNA migreerde met verschillende s

assaying-dna-damage-in-hippocampal-neurons-using-the-comet-assay

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video demonstrates the comet assay for detecting DNA damage following exposure to harmful agents. Under alkaline conditions, the DNA unwinds and denatures, and upon electrophoresis, the undamaged and damaged DNA migrate differently in the agarose gel, forming a comet-shaped structure. The slowly migrating undamaged DNA forms the circular comet head, while the rapidly migrating damaged DNA fragments form the elongated comet tail.

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

Comet assay meet DNA-breuken, veroorzaakt door verschillende factoren. Als alle elementen (behalve oxidatieve stress) veroorzaakt DNA beschadiging constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade een goede indirecte parameter van oxidatieve stress. Het doel van dit protocol is het comet assay gebruikt voor indirecte meting van oxidatieve stress.

Comet Assay als een indirecte maat van Systemische oxidatieve stress

De alkalische komeet-assay meet DNA-strengbreuken in eukaryotische cellen. Door een digestiestap met Endonuclease III of humane 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase toe te voegen, kan de assay efficiënt oxidatieve DNA-schade detecteren. We beschrijven methoden voor het gebruik van deze assays om DNA-schade in rattenlever te detecteren.

In vivo Alkaline Comet Assay en Enzyme-gemodificeerde Alkaline Comet Assay voor het meten van DNA-breuken en oxidatieve DNA-schade in Rat Liver

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

De komeettest is een populair middel om DNA-schade op te sporen. Deze studie beschrijft een benadering van het uitvoeren van dia's in representatieve varianten van de komeettest. Deze aanpak verhoogde het aantal monsters aanzienlijk, terwijl de looptijd van de test, het aantal diamanipulaties en het risico op schade aan gels afnam.

Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

Dit protocol beschrijft een effectieve methode voor het kwantificeren van het verschil in DNA-schade veroorzaakt door type I- en type II-remmers in FLT3-mutante cellen door de toepassing van de komeettest.

Komeettest om DNA-schade te kwantificeren in FLT3-cellen die mutant tot expressie brengen van 32D na blootstelling aan type I en type II FLT3-remmers

Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model

Beschrijven we een protocol dat beeldvorming van mitochondriën kan in levende neuronen via fluorescentie microscopie over lange duur. Imaging gedurende langere perioden wordt bereikt door lentivirus-gemedieerde expressie van een mitochondrially gerichte fluorescerend eiwit en het gebruik van een goedkope stage-top incubator, dat is ontworpen en gebouwd in ons laboratorium.

Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

Leer DNA-schade analyseren in hippocampale neuronen met de comet assay. Deze methode maakt kwantificering van enkel- en dubbelstrengsbreuken mogelijk voor onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

Meer video's verkennen