Name: Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer hoe u glomerulaire doorlatendheid kwantificeert met 2-fotonenmicroscopie bij München Wistarratten. Deze methode visualiseert fluorescent gelabelde macromoleculen in vivo voor nieronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Drs Silvia B Campos-Bilderback en George J Rhodes bedanken voor het invullen van chirurgische procedures waarbij plaatsing van veneuze lijnen. Zij zouden ook graag Sara E Spenen bedanken voor het handhaven van de München-Wistar kolonies bestaande uit zowel Simonsen en Frömter stammen.

1. Vervoeging van Rat serum albumine te Sulfo-Rhodamine 101 sulfonylchloride (Texas Red) <ol><li> Los 100 mg Rat Serum Albumine (RSA) in 6,667 ml van 100 mM natriumbicarbonaat pH 9,0, uiteindelijke concentratie 15 mg / ml in een 50 ml conische buis. </li><li> Plaats oplossing in ijs / water bekerglas en koel tot tussen 0 en 4 ° C. </li><li> Voeg 200 ul van hoge kwaliteit watervrij Dimethylformamide (DMF) naar een 10 mg flacon van Texas Red sulfonylchloride (TRSC); vortex op medium voor 15 sec. </li><li> Vortex RSA-oplossing op middellange en voeg de opgeloste TRSC. </li><li> Wrap 50 ml conische in folie (Parafilm kan gebruikt worden om een ​​goede afdichting te verzekeren wordt gevormd), plaats horizontaal / ice alleen en plaats op rocker om oplossing langzaam te ageren (vorming van luchtbellen te vermijden) in ijsemmer, laat reactie om verder te gaan op 0 tot 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Maak 5 L van 0,9% zoutoplossing, en bevochtig een 50 kDa moleculair gewicht afgesneden kamer die ofwel a) dialyse-membraan met clips kunnen worden, b) diANALYSE buis als in een float-a-Lyzer, of c) slide-a-Lyzer cassette (alle geschikt voor het verwijderen ongeconjugeerde TRSC). </li><li> Plaats reactiemengsel in de dialyse kamer en in de container 5 L w / de 0,9% zoutoplossing, dialyseren overnacht bij 4 ° C met voorzichtig roeren met een roerstaaf. </li><li> Wijzig de 5 L dialyseoplossing in de ochtend en in de late namiddag tot een overnacht incubatie resulteert in vrijwel geen kleurverandering (Dit duurt gewoonlijk ~ 48 uur met minimaal 4 uitwisselingen). Bovendien bestaat met MWCO van 50 kDa zo dicht bij het MW van RSA, 66kDa, kan men nooit een heldere oplossing, dit afhankelijk van de verdeling van de poriegrootte van het membraan zijn, 60 uur en 5 uitwisselingen meer dan voldoende tijd. </li><li> Volume meten en verdeel het aanvankelijke gewicht van 100 mg van de volume concentratie van TR-RSA approximate geven, meestal concentraties bereik 10-13 mg / ml. De uiteindelijke kleurstof: albumine verhouding moet ~ 04:01, 1 fluorophore per 15,00 zijn0 Daltons van eiwit MW. Bewaren bij 4 ° C; NOOIT FREEZE de TR-RSA-oplossing, als gevolg fragmentatie die zich kunnen voordoen zal permeabiliteit waarden veranderen. </li></ol> 2. Voorbereiden van de Omgekeerde Microscoop Stage for Imaging / Microscoop Instellingen <ol><li> Plaats ~ 4-7 stukken autoclaaf tape (ongeveer ¾ &quot;lang) perfect gestapeld op elkaar in een 50 mm schaal met een 40 mm dekglaasje bodem (dekglaasje onderste schaal). Deze moeten worden geplaatst dichter bij een van de randen, zodat de rand van de tape zal contact met de rand van de kromming van de nier, maar de doelstelling lichtpad (figuren 1A en 1B) niet blokkeren; grotere ratten zullen meer ruimte tussen de band en de rand van de schotel nodig. </li><li> Place 2 Repti-therm pads naast het podium naast de 50 mm schaal (figuur 1A). Plaats een warming water jasje deken over het podium. </li><li> Maximaliseren van de efficiëntie bij het verzamelen van beelden door het verzekeren van de objectieve turret heeft een 10x lucht or 20x (lucht of water immersie) objectief en een hogere aangedreven water immersie objectief om beelden te verzamelen voor kwantificering. </li><li> Tijdens de beeldvorming de meest efficiënte manier om water toe te voegen aan de doelstellingen is om ze te draaien naar de kant en voeg water met een 1 cc spuit met een lang stuk van PE-200 buizen die de top van de doelstellingen kan bereiken. </li><li> Stel de excitatie-intensiteit van de 10watt laser om ~ 15-20% met behulp van de grijsfilters op de software. De gallium-arsenide fosfide non-descanned fotodetectoren zijn ingesteld op 750 tot groene emissies, en 625 te verzamelen om rode uitstoot te verzamelen. Blauw-emissie (zoals de nucleaire vlek Hoechst 33342) worden verzameld met behulp van een standaard nondescanned multialkaline detector met een instelling tussen 750-800. </li><li> Om de correcte inning van de lage emissie-intensiteit te verzekeren binnen de Bowman&#39;s ruimte, zorg ervoor dat de ondergrenzen van de detectoren zijn zo ingesteld als niet aan deze waarden uit te sluiten. Visuele waarschuwing markers zal aangeven of de gevoeligheidinstelling te laag is en deze waarden worden gegeven een intensiteit waarde van nul. </li><li> Laad een 1 cc spuit met ~ 5-8 mg van de tl-albumine oplossing verdund met 0,9% steriele zoutoplossing om het totale volume op 1 cc. </li></ol> 3. Blootstellen van de nier in een München Wistar Rat voor intravitale 2-Photon Imaging <ol><li> Begin met een pre-verdoofde rat met Pentabarbitol (50 mg / ml oplossing, μl/100 120 g lichaamsgewicht), Inactin (130 mg / ml oplossing, μ/100 120 g lichaamsgewicht) of isofluorane (5% inductie, 1,5 tot 2.5% onderhoud), een inwonende veneuze lijn (ofwel halsader of femorale veneuze), en de linker flank geschoren van net onder de ribbenkast tot net boven de linker dij. </li><li> Plaats de rat plat op haar rechterzijde, zodat de linker, geschoren kant naar boven, zorg ervoor dat het is plat op de tafel, met zijn houding langwerpig en niet gehurkt, met voorpoten tegen elkaar en achter poten raken elkaar (Figuur 2A). </li&gt; <li> Heel voorzichtig palperen om de nieren te bepalen waar het natuurlijk legt binnen de retroperitoneum en trek een rechte lijn parallel aan het lichaam (van ribbenkast naar dij) met een Sharpie (Figuur 2A) voelen. </li><li> Pak de huid met een paar getande tang, en neem de huid langs de getekende lijn met behulp van een paar hemostats om het weefsel te verpletteren en bloedingen te voorkomen. Knip langs de incisie met een paar chirurgische schaar. Breken de buitenste huid en de spieren lagen voorafgaand aan het snijden zal drastisch verminderen en typisch elimineren bloeden. </li><li> Herhaal deze procedure voor de buitenste spierlaag, die dun. </li><li> Voor de incisie in de binnenste spierlaag, die het peritoneum blootstelt, opnieuw palperen de nier te schatten formaat. Knijp een incisie lijn kleiner is dan de nieren, het verzekeren van de incisie is iets meer dan de nier. Het beste is om deze incisie te klein te maken en maken het groter indien nodig. Als deze te groot is, zal hechten vereist.Dit laatste incisie is cruciaal; te ver dan in elke richting zal beïnvloeden stabiliteit op het podium en induceren ofwel bewegende voorwerpen uit de ademhaling (best case scenario) of zullen de renale pedikel en negatieve verminderen nierperfusie (worst case scenario) rekken. </li><li> Zoek de nieren (zie figuur 2B) en de grip omringende vet met forceps, werkt aan de onderzijde pool van de nier in een hand over hand mode. </li><li> Zodra de onderste pool van de nier wordt bereikt, trek de nier door de incisie, terwijl heel zachtjes knijpen onder de nieren te exterioriseren. Als de incisie te klein is, verpletteren de spierlaag en snijd het te verbreden, herhaal dan de procedure om nier exterioriseren. </li></ol> 4. Het plaatsen van de Munich Wistar Rat in het werkgebied voor Imaging <ol><li> Plaats de nier naar de rand van het dekglaasje schaal met de nieren lichtjes gedraaid naar de dorsale (achterzijde) van de rat zodat de ventrale zijde van de nier is contact maken met het dekglaasje onderste schaal (figuur 1A). Voeg een voorverwarmde, steriele 09.% Zoutoplossing aan het gerecht. </li><li> Kijk door de 10x of 20x objectief en controleer beweging. Als er beweging wordt gedetecteerd, rollen de rat op iets, zodat de thorax is verder weg van het dekglaasje onderste schaal, zorg ervoor dat de nieren wordt zo dicht mogelijk bij de rand van de schotel zonder strekken de renale pedicle (Figuur 1B). </li></ol> 5. Afbeeldingen ophalen om Renal Doorlatendheid albumine kwantificeren <ol><li> Het berekenen van de glomerulaire permeabiliteit (Glomeruluar zeefcoëfficiënt; SGR) van elke macromolekuul vereist het nemen van referentie achtergrond beelden van individuele glomeruli voorafgaand aan infusie van de fluorescente molecuul. Als uw microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde podium staat is het markeren van locaties, te vinden en het centrum individuele glomeruli met de onderste aangedreven objectieve en markeer elke locatie. Een dubbele pas Fluorescein / Rhodamine epifluorescente filter is ideaal voor deze procedure, hoewel beide emissiefilter zal werken (fase-contrast-of andere niet-fluorescentie lichtbronnen zal niet werken). Glomeruli verschijnt als lege cirkelvormige structuren omgeven door proximale tubuli met een inherente geel-oranje autoflourescence wanneer bekeken door de dual-pass filter. </li><li> Als uw microscoop niet over een gemotoriseerde podium, scan de nier in een raster patroon met het lage vermogen objectief en maak een rudimentaire kaart van waar de individuele glomeruli liggen; vertrouwen op natuurlijke bezienswaardigheden zoals grote oppervlakkige bloedvaten zich boven de nierkapsel of vet vlekken. </li><li> Schakel het torentje aan de hogere macht water immersie objectief en neem 3D data sets van elk glomeruli te zorgen dat de capillaire lussen en Bowman&#39;s ruimte zijn duidelijk zichtbaar. Met behulp van een pseudokleur palet (iets anders dan B / W) zal helpen om deze structuren te visualiseren. </li><li> Focussen in op een oppervlakkig bloedvat langzaam doordringen in tHij fluorescerende albumine maken zeker de tijd wordt gegeven om voor systemische distributie. Voor moleculen met lage GSC is het essentieel om de sterktewaarden in het plasma maximaliseren maar niet tot een niveau dat de fotodetectoren verzadigd zal in de microscoop bereiken. Dit verhoogt detecteerbaarheid gefilterd moleculen. Opmerking: er is meestal een 5-7 sec tijdsverloop tussen het moment dat de fluorescerende albumine wordt ingevoerd om de tijd die op het scherm verschijnt (het verwerven van volledige beelden op ~ 1 frame / seconde). </li><li> Laat ongeveer 10 minuten om eventuele kleine moleculair gewicht fragmenten te wissen voordat het verwerven van 3D-volumes op 1 micrometer intervallen te worden gebruikt bij de berekening van albumine SGR. Typisch, de Simonsen&#39;s stam van München Wistarratten heeft veel minder oppervlak glomeruli, dus alles wat kan worden gevisualiseerd worden afgebeeld en gekwantificeerd. De Frömter stam heeft een veel groter aantal dus beperken we het aantal gekwantificeerde tot ~ 10. </li><li> Aan het einde van de studie de rat gedood door een overdosis van de anesthetic in de studie. Een dubbele pneumothoracotamy wordt uitgevoerd om euthanasie te verzekeren. </li></ol> 6. Berekenen van GSC voor TL albumine van 3D volumes <ol><li> Met behulp Metamorph beeldverwerking software te laden de 3D data sets voor elke glomeruli, zowel de achtergrond set en set genomen na infusie van de tl-albumine. </li><li> In het volume met de tl-albumine zoek een oppervlakkige capillaire lus met voldoende ruimte lege ruimte tussen de gedefinieerde marges en de rand van het kapsel van Bowman. </li><li> Op de achtergrond volume lokaliseren dezelfde focal plane waarin alle visuele aanwijzingen van de albumine afbeelding bevattende moet bevatten. Selecteer een regio binnen de capillaire lus van rente en noteer de gemiddelde intensiteit lezen. Vervolgens selecteert u een regio binnen de Bowman ruimte en noteer de gemiddelde intensiteit lezen. Deze worden gebruikt als achtergrondwaarden. </li><li> Voor kwantificering, selecteert de vergelijkbare regio binnen de Bowman ruimte in de albumine containing afbeelding. Doe dit voor minstens twee andere regio&#39;s om een ​​gemiddelde waarde voor de gemiddelde intensiteit van binnen Bowman&#39;s ruimte innemen. </li><li> Selecteer de capillaire lus met de helderste plasma-intensiteit en trek een streek eromheen. Vervolgens met behulp van de drempel functie, markeert de heldere waarden binnen het circulerende plasma, het vermijden van de donkere strepen die circuleren RBC&#39;s. Let op de gemiddelde intensiteit waarden van de geselecteerde plasma ruimte. Het is belangrijk om bij voorkeur selecteren de heldere gebieden van het plasma omdat factoren in het bloed zal alleen dienen oorzaak en onderschatting van plasma fluorescentieniveaus. </li><li> Met behulp van een Microsoft Excel spreadsheet voert u de waarden bij het SGR waar berekenen: </li></ol><img alt="Figuur 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3B+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504(2007).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489(2009).</li>
<li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447(2012).</li>
<li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601(1992).</li>
<li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides%2C+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat%3A+Effects+of+molecular+size+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237(2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9(2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De stappen benadrukt hier vertegenwoordigen wat we voelen zijn degenen die zal produceren consistente en nauwkeurige permeabiliteitswaarden omdat ze omzeilen de volgende valkuilen: <ol><li> Verstrooiing: Het gebruik van een rood emitterende fluoroforen zorgen voor een efficiëntere inning van het licht omdat fotonen langere golflengte minder geneigd zijn te verstrooien. Met behulp van hetzij groen of blauw emitterende fluoroforen zullen grotere variatie in de GSC&#39;s vanwege de verhoogde variabiliteit in intensitei...

<table><tbody><tr><td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td><td>Olympus America</td><td></td><td>Filters voor detectoren: Blauw 430/100, Groen 525/50, Rood 605/90</td></tr><tr><td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Afstelbare excitatiegolflengten: ~750-1150 nm</td></tr><tr><td>Gallium arsenide fosfide fotodetectoren</td><td>Hamamatsu Corp</td><td></td><td>Opmerking: Beschikbaar in voor- of zijmontage.</td></tr><tr><td>Metamorph Beeldverwerkingssoftware</td><td>Molecular Dynamics</td><td></td><td>Opmerking: Versie 6.1r1</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td></td><td>2007 versie</td></tr><tr><td>Handling Forceps</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Dissecting Scissors</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>CA Micro scissors Model 1C300</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostatic Forceps (recht)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Water Jacket Blanket + Verwarmingspad</td><td>Gaymar</td><td></td><td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td></tr><tr><td>Repti-Therm Onder Tank Heater</td><td>ZooMed</td><td></td><td>RH-4</td></tr><tr><td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td><td>Invitrogen/Molecular Probes</td><td>Cat# T-353</td><td></td></tr><tr><td>Rat Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A-6272</td><td></td></tr><tr><td>High Quality Anhydrous DMF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# 270547</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line Autoclave Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificeren glomerulaire doorlatendheid fluorescent macromoleculen met 2-photon microscopy in münchen wistarratten

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Nierziekten waarbij urine verlies van grote essentiële macromoleculen, zoals serumalbumine, hebben lange tijd gedacht te worden veroorzaakt door veranderingen in de permeabiliteit barrière bestaat uit podocytes, vasculaire endotheliale cellen, en een basaal membraan werken in koor. Gegevens van ons laboratorium met behulp intravitale 2-foton microscopie toonde een meer doorlaatbaar glomerulaire filtratie barrière (GFB) dan voorheen onder fysiologische omstandigheden gedacht, met het ophalen van gefilterde albumine die zich in een vroeg subset van cellen genoemd proximale tubulus cellen (PTC) 1,2, 3. Vorige technieken om renale filtratie bestuderen en de vaststelling van de kenmerken van filtratie barrière betrokken micropuncture het lumen van deze vroege buisvormige segmenten bemonstering van de vloeistofinhoud en analyse 4. In deze onderzoeken albumine in de luminale vloeistof nagenoeg onbestaande, die nauw aansluitenwelke normaal in de urine. Echter, karakterisering van dextranpolymeren met gedefinieerde afmetingen van deze techniek bleek die van een soortgelijk formaat serumalbumine hadden hogere niveaus in het tubulaire lumen en urine; suggereert verhoogde doorlaatbaarheid 5. Hierin is een gedetailleerd overzicht van de gebruikte techniek om direct te visualiseren en te kwantificeren glomerulaire fluorescerende albumine permeabiliteit in vivo. Deze methode maakt het mogelijk voor de detectie van gefilterde albumine in de filtratie barrière in Bowman&#39;s ruimte (de eerste kamer van urine-filtratie), en maakt het ook mogelijk kwantificering van albumine reabsorptie door de proximale tubuli en visualisatie van de daaropvolgende albumine transcytose 6. Het ontbreken van fluorescentie albumine later langs buisvormige segmenten op weg naar de blaas benadrukt de efficiëntie van het ophalen pathway in het oudere proximale tubulus segmenten. Bovendien, wanneer deze techniek werd toegepast op doorlatendheiddextranen met een vergelijkbare grootte aan albumine vrijwel identiek permeabiliteit gemeld 2. Deze waarnemingen direct ondersteunen de noodzaak om de focus van veel proteïnurie nierziekten te breiden naar opgenomen veranderingen in proximale tubulus cel regeneratie.

Figuur 3 toont een voorbeeld van een afbeelding uit een oppervlak van een glomerulus München Wistar Frömter rat en de maatregelen om de permeabiliteit van fluorescente albumine te bepalen. De SGR waarde voor albumine van 0,0111 afgeleid voor deze persoon glomerulus vallen binnen het bereik gezien bij deze stam van München Wistarratten toen in de gevoede toestand 3. De stabiliteit gezien in dergelijke beelden door de zorgvuldige planning en uitvoering van instructies getoond in figuren...

Een techniek gebruik te maken van hoge resolutie intavital 2-foton microscopie om direct te visualiseren en te kwantificeren gloemrular filtratie in oppervlaktewater glomeruli. Deze methode maakt het mogelijk voor de directe bepaling van de permeabiliteit eigenschappen van macromoleculen in zowel normale en zieke staten.

Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Het algemene doel van deze procedure is om de filtratie-eenheid van het nephron succesvol te visualiseren en de filtratie van fluorescerende macromoleculen door de filtratiebarrière in de urineruimte in vivo te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de microscoopstandaard voor te bereiden voor het levende dier. Vervolgens wordt de nier blootgelegd en wordt de rat op de standaard geplaatst.Vervolgens worden individuele glomeruli geïdentificeerd en in kaart gebracht en achtergrond 3D-beelden worden verkregen. Ten slotte wordt fluorescerend albumine geïnfundeerd. 3D-volumes van individuele glomeruli worden verkregen en permeabiliteit wordt gekwantificeerd.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de filtratiecoëfficiënt van macromoleculen door de glomeruli in de nier tonen door het gebruik van intra vial twee-foton microscopie. Het belangrijkste voordeel van twee-foton microscopie is dat het tegelijkertijd de kwantificering van zowel glomerulaire filtratie als proximale tubulaire reabsorptie en transcytose in het dier mogelijk maakt. Tegelijkertijd reiken de implicaties van de techniek verder dan mechanisch tot diagnostisch en therapeutisch aangezien de belangrijkheid v

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video showcases fluid aspiration from mouse glomeruli using the two-photon mediated micropuncture technique. The technique provides access to the living mouse’s glomeruli and thus helps gain insights into renal physiology.

Fluid Aspiration from Mouse Glomeruli: A Method to Aspirate Glomerular Fluid from Mouse Using Two-Photon Mediated Micropuncture

Meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de gouden standaard voor de nierfunctie beoordeling. Hier beschrijven we een high-throughput methode die de bepaling van GFR in bewuste muizen met een enkele bolusinjectie, bepaling van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-inuline in plasma en berekening van GFR door een bifasisch exponentieel model laat.

Een High-throughput-methode voor meting van de glomerulaire filtratiesnelheid in Conscious Muizen

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte

Presenteren wij gebruik van 2-foton microscopie te plaatsen van een micropipet binnen de urine ruimte Bowman in muizen, 2 fundamentele technieken van renale fysiologie combineren. Gebruik van 2-foton microscopie overwint kritische beperkingen van conventionele microscopie voor micropuncture renale fysiologie studies.

Micropuncture van Bowman ruimte in muizen vergemakkelijkt door 2 foton microscopie

Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de glomerulaire filtratie snelheid (GFR) in bewuste, vrij bewegende muizen met behulp van een monitor transdermaal GFR.

Transdermaal meting van de glomerulaire filtratie snelheid in muizen

Hier presenteren we een protocol voor het testen van de glomerulaire permeabiliteit in muizen met behulp van een zeer gevoelige, niet-radioactieve Tracer. Deze methode maakt repetitieve urine analyses mogelijk met kleine urine volumes.

Zeer gevoelige meting van de glomerulaire permeabiliteit bij muizen met Fluorescein isothiocyanaat-poly sucrose 70

Hier presenteren we een protocol met behulp van 2-fotonmicroscopie in München Wistar Fromter-ratten met oppervlakteglomeruli om de effecten van langdurige ureterale obstructie op glomerulaire dynamiek en functie te kwantificeren.

2-fotonenmicroscopie gebruiken om de effecten van chronische unilaterale ureterale obstructie op glomerulaire processen te kwantificeren

Deze studie presenteert een gebruiksvriendelijke, complete en eenvoudige reeks methoden om glomeruli uit CUBIC-gezuiverde muizennieren te labelen en te analyseren. Gegevens zoals het aantal en het volume van de glomerulus kunnen eenvoudig en betrouwbaar worden verkregen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-Dextran, light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) of gewone confocale microscopie en software zoals Imaris.

Een efficiënte en snelle methode voor het labelen en analyseren van muizenglomeruli

Leer hoe u glomerulaire doorlatendheid kwantificeert met 2-fotonenmicroscopie bij München Wistarratten. Deze methode visualiseert fluorescent gelabelde macromoleculen in vivo voor nieronderzoek.

Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Meer video's verkennen