Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten
April 17th, 2013
Een techniek gebruik te maken van hoge resolutie intavital 2-foton microscopie om direct te visualiseren en te kwantificeren gloemrular filtratie in oppervlaktewater glomeruli. Deze methode maakt het mogelijk voor de directe bepaling van de permeabiliteit eigenschappen van macromoleculen in zowel normale en zieke staten.
Het algemene doel van deze procedure is om de filtratie-eenheid van het nephron succesvol te visualiseren en de filtratie van fluorescerende macromoleculen door de filtratiebarrière in de urineruimte in vivo te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de microscoopstandaard voor te bereiden voor het levende dier. Vervolgens wordt de nier blootgelegd en wordt de rat op de standaard geplaatst.
Vervolgens worden individuele glomeruli geïdentificeerd en in kaart gebracht en achtergrond 3D-beelden worden verkregen. Ten slotte wordt fluorescerend albumine geïnfundeerd. 3D-volumes van individuele glomeruli worden verkregen en permeabiliteit wordt gekwantificeerd.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de filtratiecoëfficiënt van macromoleculen door de glomeruli in de nier tonen door het gebruik van intra vial twee-foton microscopie. Het belangrijkste voordeel van twee-foton microscopie is dat het tegelijkertijd de kwantificering van zowel glomerulaire filtratie als proximale tubulaire reabsorptie en transcytose in het dier mogelijk maakt. Tegelijkertijd reiken de implicaties van de techniek verder dan mechanisch tot diagnostisch en therapeutisch aangezien de belangrijkheid van het begrijpen van zowel de rol van de glomerulaire filtratie als de proximale tubulaire.
Reabsorptie van albumine is cruciaal bij het bepalen van het targeting van therapie. Na het anesthetiseren van de rat, brengt u een veneuze toegangslijn in door ofwel de halsslagader of de dijbeenslagader en scheert u de linkerflank van net onder de ribbenkast tot net boven de linkerdij. Dit is een niet-overlevingschirurgie.
Plaats de rat plat op zijn rechterzijde zodat de geschoren linkerkant naar boven wijst. Zorg ervoor dat het plat op de werkbank ligt met een verlengde houding en niet gehurkt met voorpoten die elkaar raken en achterpoten die elkaar heel zachtjes raken. Palpeer om de nier te voelen om te bepalen waar deze van nature binnen het retroperitoneum ligt, en gebruik een markeerstift om een rechte lijn te tekenen die parallel loopt aan het lichaam met een paar tandentang.
Pak de huid op en gebruik een paar hemostaten om de huid langs de getekende lijn te knijpen om het weefsel te verpletteren en bloeden te voorkomen met behulp van een paar chirurgische schaar. Snijd langs de incisie. Gebruik dezelfde procedure voor het snijden van de buitenste spierlaag, die dun is zoals nodig is.
Gebruik hemostaten om bloeden te voorkomen voor de incisie in de binnenste spierlaag, die het peritoneum zal blootleggen. Palpeer de nier opnieuw om de grootte te schatten. Knijp een incisielijn die kleiner is dan de nier, zorg ervoor dat de incisie net boven de nier ligt.
Het is het beste om deze incisie te klein te maken en deze groter te maken indien nodig. Lokaliseer de nier en gebruik een pincet om het omringende vet vast te grijpen, werkend naar de onderpool van de nier in een hand-over-hand-stijl. Zodra de onderpool van de nier is bereikt, trekt u voorzichtig aan de nier door de incisie terwijl u heel voorzichtig onder de nier knijpt om het te externaliseren.
Als de incisie te klein is, verplettert u de spierlaag en snijdt u om deze te verbreden. Herhaal de procedure om de nier te externaliseren nadat de nier van de rat is geëxternaliseerd en de rat op de microscoopstandaard is geplaatst voor beeldvorming. Als uw microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde standaard die locaties kan markeren, gebruikt u een dubbele doorlaatfluoresceine staaf, domine filter en een laag vermogen objectief, zoek en centreer individuele glomeruli, die zullen verschijnen als lege cirkelvormige structuren omgeven door proximale tubuli.
Met een inherente gele oranje autofluorescentie om elke locatie te markeren, schakelt u de toren naar een hoger vermogen waterimmersie objectief en neemt u 3D-gegevenssets van elke glomeruli. Zorg ervoor dat de capillaire lussen en Bowman-ruimte duidelijk zichtbaar zijn. Het gebruik van een pseudokleurenpalet zal helpen om deze structuren te visualiseren.
Richt u vervolgens op een oppervlakkig bloedvat en infundeer langzaam fluorescerend albumine, zorg ervoor dat tijd wordt gegeven om systemische distributie mogelijk te maken voor moleculen met een lage glomerulaire cingcoëfficiënt of GSC, het is essentieel om de intensiteitswaarden in het plasma te maximaliseren, maar niet om niveaus te bereiken die de fotodetectoren in de microscoop zullen verzadigen. Dit verhoogt de detecteerbaarheid van gefilterde moleculen Na ongeveer 10 minuten te hebben gewacht om eventuele kleine moleculaire gewichtfragmenten te laten oplossen, verwerft u 3D-volumes met één micrometer intervallen om te worden gebruikt bij het berekenen van albumine's met behulp van metamorph beeldverwerkingssoftware. Laad de 3D-gegevenssets samen met de achtergrondbeelden voor elke glomerulus in het volume dat het fluorescerende albumine bevat.
Loceert een oppervlakkig capillair lusje met voldoende lege ruimte tussen de gedefinieerde marges en de rand van de Bowman's capsule. In het achtergrondvolume. Lokaliseer hetzelfde focale vlak, dat alle visuele aanwijzingen van het albuminebevattende beeld zou moeten bevatten.
Selecteer een regio binnen de capillaire lus van belang en noteer de gemiddelde intensiteitswaarde. Selecteer vervolgens een regio binnen de Bowman-ruimte en noteer de gemiddelde intensiteitswaarde. Deze zullen worden gebruikt als achtergrondwaarden voor kwantificering.
Selecteer de vergelijkbare regio binnen de Bowman-ruimte in het albuminebevattende beeld. Doe dit voor ten minste twee andere regio's om een waarde te verkrijgen voor de gemiddelde intensiteit binnen de Bowman-ruimte. Selecteer de capillaire lus met de helderste plasma-intensiteit en teken een regio eromheen.
Gebruik vervolgens de drempelfunctie om de heldere waarden binnen het circulerende plasma te markeren, waarbij de donkere strepen die rode bloedcellen circuleren worden vermeden. Noteer de gemiddelde intensiteitswaarden van de geselecteerde plasmaruimte. Het is belangrijk om de heldere gebieden van het plasma te selecteren omdat factoren in het bloed alleen zullen dienen om een onderschatting van plasmafluorescentieniveaus te veroorzaken.
Voer de waarden in een Excel-spreadsheet in om de GSC te berekenen waarbij GSC gelijk is aan het verschil van de ruwe Bowman-ruimte. Inten
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een techniek die gebruikmaakt van hoogwaardige intravitale 2-foton microscopie om glomerulaire filtratie in oppervlakteglomeruli te visualiseren en te kwantificeren. De methode maakt directe bepaling van de permeabiliteitskarakteristieken van macromoleculen mogelijk in zowel normale als zieke toestanden.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Nefrologie
- Microscopie
- In vivo beeldvorming
Achtergrond
- De nefron is de functionele eenheid van de nier.
- Glomerulaire filtratie is cruciaal voor de nierfunctie.
- Het begrijpen van permeabiliteit kan helpen bij ziekteonderzoek.
- Intravitale microscopie maakt real-time observatie mogelijk.
Doel van het onderzoek
- De filtratie-eenheid van de nefron visualiseren.
- De filtratie van fluorescente macromoleculen kwantificeren.
- De permeabiliteit over de filtratiebarrière in vivo beoordelen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van het microscoopplatform voor beeldvorming bij levende dieren.
- Blootleggen van de nier en plaatsing van de rat op het platform.
- Identificatie en in kaart brengen van individuele glomeruli.
- Infusie van fluorescent albumine en verwerving van 3D volumes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van glomerulaire filtratie.
- Kwantificering van permeabiliteitskarakteristieken.
- Vergelijking van normale en zieke toestanden.
- Verbeterd begrip van de nierfunctie in vivo.
Conclusies
- De techniek biedt waardevolle inzichten in de nierfiltratie.
- Het kan worden toegepast om verschillende nierziekten te bestuderen.
- Toekomstig onderzoek kan op deze methodologie voortbouwen voor verdere ontdekkingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This technique enables direct visualization and quantification of glomerular filtration and proximal tubular reabsorption in vivo, providing mechanistic insights into macromolecular handling relevant to proteinuric kidney diseases. By quantifying filtration coefficients and reabsorption dynamics, it supports target validation and de-risking in renal therapeutic development. The method offers a translational bridge from discovery to preclinical evaluation by linking barrier function to cellular retrieval pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying macromolecular flux across the glomerular filtration barrier under physiologic conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation by linking barrier permeability to proximal tubule cell retrieval mechanisms.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative permeability data that informs mechanistic de-risking of renal targets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by establishing baseline permeability and reabsorption metrics.
- Quantitative Outputs: Generates filtration coefficient (GSC) measurements that enable standardized, reproducible assessment of macromolecular handling.
- Platform Utility: Supports screening scalability through intravital imaging of fluorescent dextrans and albumin with identical permeability profiles.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects glomerular permeability alterations to proximal tubule dysfunction in proteinuric renal diseases.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by visualizing albumin transcytosis and retrieval pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying recovery efficiency in early tubular segments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing dynamic, longitudinal permeability data in intact nephrons.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing filtration and reabsorption in real time.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via 3D volume acquisition and intensity-based quantification of fluorescent tracers.
- Analytics: Enables comparative analysis through GSC calculations derived from capillary loop and Bowman's space intensity measurements.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by tracking albumin trafficking from glomerular filtration to proximal tubule uptake.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating macromolecular therapeutics and disease models across rodent strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glomerular and tubular handling.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through intravital imaging protocols and background subtraction methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying filtration and reabsorption efficiencies that influence therapeutic exposure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking permeability phenotypes to proximal tubule reclamation capacity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy, animal surgery, and fluorescent tracer handling.
- Dependent on two-photon microscope infrastructure with motorized stage and spectral detection capabilities.
- Necessitates cross-team standardization for image acquisition, region-of-interest selection, and GSC calculation.
- Involves adaptation considerations across model systems due to variations in glomerular anatomy and tubular function.
- Limited by surgical complexity and imaging depth constraints inherent to intravital preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:50
Exposing the Kidney in a Munich Wistar Rat for Intravital 2-Photon Imaging
4:10
Acquiring Images to Quantify Renal Permeability of Albumin
6:02
Calculating Glomerular Sieving Coefficient for Fluorescent Albumin from 3D Volumes
8:21
Glomerular Permeability Results
10:34
Conclusion
