Name: Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer een high-throughput methode voor het meten van T-cel cytotoxiciteit op enkelcellig niveau met behulp van nano-well arrays en fluorescentiemicroscopie. Deze techniek verbetert de analyse van immuunresponsen tegen tumorcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Aantal R01CA174385. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

1. Reagentia Voorbereiding <ol><li> Bereid RPMI-PLGH door mengen 500 ml RPMI-1640 en 5 ml elk van penicilline-streptomycine, L-glutamine en HEPES oplossing. </li><li> Bereid R10 oplossing mengen RPMI-PLGH met 10% foetaal runderserum (FBS). De FBS is hitte-geïnactiveerd bij 56 ° C gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging. </li><li> Voorverwarmen bij 37 ° C 50 ml van RPMI-PLGH, 15 ml PBS en 15 ml R10 in steriele conische buizen. </li><li> Fabricage van arrays van nanowells in PDMS: De silicium master vervaardigd met behulp van fotolithografie in hoofdzaak zoals eerder beschreven 10. Meng grondig de Sylgard 184 elastomeer kit basis en verharder in 10:01 gewichtsverhouding in een wegwerp beker met behulp van een plastic mes. Ontgas het mengsel in een vacuümkamer gedurende 1 uur. Giet het mengsel op de nanowell array, sluiten met een glaasje en laat het zitten voor 30 minuten. Breng het geheel in een oven op 80 ° C gedurende 2 uur en laat afkoelen op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het elastomeer zal huidige tijdens deze periode en wil binding met het glas dia. De glazen dia met de PDMS nanowell array voorzichtig opgetild van de silicium meester, bedekt met Scotch tape en opgeslagen tot toekomstig gebruik. </li></ol> 2. Target Cell (T) Etikettering <ol><li> Tel 5 miljoendoelstelling cellen van celkweek met behulp van een hemocytometer en de pellet cellen in een steriele 15 ml conische buis door centrifugatie bij 340 xg gedurende 5 minuten. De celkweek wordt gesplitst de dag in 5 ml totaal volume (dichtheid = 1 miljoen / ml) en gekweekt in T-25 kolf (VWR). Protocollen voor celtelling met hemocytometer zijn beschreven in detail eerder 11 </li><li> Zuig al het papier met achterlating van ongeveer 50 ul van de media. </li><li> Bereid een werkoplossing van Cell Tracker Rood (CTR) door mengen 0,5 ui CTR voorraad (1 mM) tot 150 pi RPMI-PLGH (eindconcentratie 2,5 uM). Voeg 150 pi van de werkoplossing de doelcellen en meng met een P200 pipet.Als alternatief kan PKH 26 (eindconcentratie van 2 uM) worden gebruikt label doelcellen volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 20 min. </li></ol> 3. Effector (E) Mobiele Labeling <ol><li> Tel 5000000 effectorcellen van celkweek met behulp van een hemacytometer en pellet van de cellen in een steriele 15 ml conische buis door centrifugatie bij 340 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig al het papier </li><li> Bereid een werkoplossing van Vybrant DyeCycleViolet Stain oplossing door toevoeging van 1 pi 5 mM Vybrant Violet stock aan 1 ml R10 media (eindconcentratie van 5 uM). Voeg de werkoplossing voor de cellen en resuspendeer met P200 pipet. Als alternatief kan PKH 67 (eindconcentratie van 2 uM) worden gebruikt label doelcellen volgens de instructies van de fabrikant. Als PKH 67 wordt gebruikt, dan SYTOX Green mogen niet worden gebruikt omdat ze in dezelfde fluorescentie kanaal. De opsomming van apoptotische doelstellingen gebeurt uitsluitend met behulp van eennnexinV kleuring in dit geval. Opmerking: Bij het ​​uitvoeren van time-lapse en niet eindpunt metingen UV kleurstoffen zoals Vybrant Violet moet worden vermeden. </li><li> Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 20 min. </li></ol> 4. Scheiding van levende en dode cellen door een dichtheidsgradiënt <ol><li> Voeg 6,8 ml en 6,0 ml van RPMI-PLGH te richten en effector cellen, respectievelijk en meng door pipetteren en zachtjes. </li><li> Laag 3,5 ml Ficoll-Paque Plus onderaan elke conische buis die doel en effectorcellen. Leg de FICOLL langzaam om een ​​goede vorming van lagen tussen FICOLL en media te garanderen. </li><li> Centrifugeer beide buizen bij 340 xg gedurende 30 minuten. zonder rem en versnelling. </li><li> Tijdens centrifugeren overdragen 7 ml voorverwarmde PBS een 4-well plaat. Bereid nanowell array (gefabriceerd in PDMS): bodemstofzuiger glasplaatje met ethanol en oxideren PDMS bij hoge RF instelling met plasma oxidatiemiddel gedurende 1 min. Deze stap zal sterilize de nanowell array terwijl ook waardoor de PDMS hydrofiel. Onmiddellijk zet de nanowell array naar de plaat met PBS. </li><li> Breng de plaat op een bioveiligheid kast en zuig overtollige PBS. Maak 10 ml 1% edele agar door het toevoegen van 100 mg agar poeder aan 10 ml gedeïoniseerd water en daarna magnetron het gedurende 30-45 sec. Breng opwarmen 1% edele agar op de boven-en onderrand van glasplaatje dat de nanowell array om de array te immobiliseren en wacht 10 minuten voor agar te stollen bevat. Voeg 3 ml PBS en zuig overtollige agar. </li><li> 3 ml R10 op de bovenkant van nanowell array en laat equilibreren ~ 10 min. </li><li> Na centrifugatie Ficoll, zuig 5 ml inhoud van de toplaag van elke buis. Zorg ervoor dat u de laag met de cellen te zuigen. </li><li> Oogst de cellen (witte laag) door het winnen van 1-2 ml van de laag tussen FICOLL en media met P1, 000 pipet en verhuis naar nieuwe steriele conische buizen. Herhaal dit voor beide groepen van cellen terwijl ervoor te zorgen dat je stelregelize het herstel cellen. </li><li> 3 ml voorverwarmde RPMI-PLGH aan elke buis mengen door pipetteren en pellet door centrifugatie bij 340 xg gedurende 5 minuten op volle optrekt en remt. </li><li> Zuig al het papier, voeg 5 ml voorverwarmde RPMI-PLGH aan elke buis en herhaal centrifugeren bij 340 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het medium en resuspendeer de celpellet in 500 pi R10. </li><li> Tellen levende cellen met de Trypan blauw exclusie methode op een hemacytometer. </li></ol> 5. Mobiele Laden op Nanowell Array <ol><li> Zuig al het papier uit nanowell array en voeg 2 ml vers R10 over de array. Zuig weer terwijl het maken van dat de bovenkant van nanowell array is niet te nat / droog als het zal verdeling van cellen beïnvloeden. </li><li> Deposit 1 x 10 5 effector cellen in 200 pi R10 op nanowell matrix oppervlak (dichtheid = 5 x 10 5 cellen / ml). </li><li> Laat cellen rusten gedurende 5 minuten en bij een standaard weefselkweek microscoop cheque aan enof de verdeling van cellen gewenst is. Voeg meer cellen indien nodig. </li><li> Deposit 1 x 10 5 doelcellen in 200 ui R10 op nanowell matrix oppervlak (dichtheid = 5 x 10 5 cellen / ml). </li><li> Laat cellen rusten gedurende 5 min en bij een standaard weefselkweek microscoop controleren dat de verdeling van cellen gewenst is. Voeg meer cellen indien nodig. </li><li> Zorgvuldig spoelen nanowell array met 2 ml R10 en zuig overtollige media. </li><li> Bereid 3 ml voorverwarmde R10 in een 15 ml steriele conische buis. Voeg 3 pl 0,5 mM SYTOX Green Nucleic Acid Stain (eindconcentratie 0,5 uM) en 60 ui Annexine V-Alexa Fluor 647 tot werkoplossing te maken. Voorzichtig de werkende oplossing op de 4-well plaat terwijl ervoor te zorgen dat cellen niet worden verplaatst uit de putjes. </li><li> Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 15 min. </li></ol> 6. Imaging 1 <ol><li> Acquire beelden van de nanowell array met behulp van een fluorescentie microscope: In dit voorbeeld gebruiken we een ZEISS Observer Z-1 microscoop uitgerust met een gemotoriseerde podium en Lambda-DG4. </li><li> Initialiseer de software en de microscoop en controleer de signaalintensiteit van het doorgelaten licht en andere fluorescerende kanalen. Overall, er vijf kanalen overeenkomstig: doorgelaten licht, Annexine V-647 (Cy5 filter), CTR (DsRed filter), SYTOX Green (FITC filter) en Vybrant Violet (DAPI filter). Zorg ervoor dat de microscoop te stellen met de maximale signaal naar ruis terwijl het vermijden van verzadiging. </li><li> Stel X en Y positie voor de nanowell array. Begin proces door het instellen van de nulstand en het initialiseren van focus op het midden van 7 x 7 nanowell scala blok aan linker bovenhoek van de nanowell reeks stempel. De x, y posities samenvallen met het middelpunt van elk blok en de z-waarde nauwkeurig de nadruk op elk blok. </li><li> Zodra de positie en focus zijn helemaal klaar, zorg ervoor dat beeldopname in lineaire mode en beelden te verwerven. <sTrong&gt; Opmerking: Indien nodig schakelt u de incubator en CO 2 op de microscoop ten minste 30 minuten voor het experiment. </li></ol> 7. Post-imaging Breng de 4-wells plaat met de nanowell array in een incubator (37 ° C / 5% CO 2) gedurende 6 uur. 8. Imaging 2 Het verwerven van de beelden op de tweede keer-punt, zoals beschreven in stap 6. 9. Beeldanalyse <ol><li> De bezetting van cellen in de nanowells wordt bepaald door het gebruik van geschikte beeldsegmentatie programma&#39;s (bijvoorbeeld ImageJ, <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) in hoofdzaak zoals eerder beschreven 9,12. </li><li> Analyse van de initieel geselecteerde microscoopbeelden (t = 0 uur, t 0) wordt gebruikt om een database van de individuele nanowells met precies een levende doelcel (geïdentificeerd genererendoor CellTracker Red, red) en geen dode cellen (geïdentificeerd door Annexine V kleuring, groen) [T1t 0 nanowells]. </li><li> Analyse van de tweede reeks microscoopbeelden (t = 6 uur, t 6) wordt gebruikt om zelfstandig een tweede database nanowells met een doelcel (red) [T1t 6 nanowells]. Een integriteitscontrolewaarde (database query) wordt toegepast om alle levende doelen op t 0 zijn afgestemd op doelen op t 6 tot een uiteindelijke set van trefwoorden targets (geïmplementeerd als nanowells dat T1t 0 = T1t 6, aangeduid als T1match hebben) produceren </li><li> Het aantal effectorcellen in nanowells bepaald volgens Vybrant Violet kleuring op t 0 [E1 nanowells] </li><li> Een database query wordt uitgevoerd om nanowells die enkelvoudige effectors identificeren geco-incubeerd met enkelvoudige doelen (gedefinieerd als nanowells dat E1 en T1 match hebben aangeduid als E1T1) </li><li> Effector geïnduceerde apoptose wordt gescoord door i<html> dentifying doelen die zijn Annexine V negatief op t 0 en Annexine V positief op t 4 (E1T1 met Annexine V doelgroep vlekken op t 6). </li></ol> 10. Optionele Time-lapse imaging van Killing gebruik van Nikon&#39;s BioStation IM <ol><li> Neem een ​​petrischaal met dekglas onderkant en snijd een klein stukje van de nanowell array chip (bereid in stap 5) die precies past op het dekglaasje. Zorg ervoor dat de chip natte blijft tijdens het snijden. </li><li> Mix 1 x 10 6 targets en 1 x 10 6 T-cellen in 100 ul media, en op het dekglaasje pipet. </li><li> Laat ongeveer 15-30 minuten te laten de cellen af ​​te wikkelen. </li><li> Snel Keer de kleine nanowell array chip en plaats het op het dekglaasje. </li><li> Om ervoor te zorgen dat de chip niet kunnen bewegen tijdens de beeldvorming, plaats een of twee 20mm x 20mm dekglaasjes op de bovenkant van de chip. Breng druk zachtjes de chip druk om de bodem van de schaal. </li></ol>tent &quot;&gt; Opmerking: De nanowell serie chip bodem is te dik voor een hoge-resolutie beeldvorming en dus moet ondersteboven worden gedraaid Tijdens deze, veel van de cellen worden uitgewassen Aangezien dit niet gemakkelijk gecontroleerd, het aantal cellen in stap 9.2.. en incubatietijd in stap 9.3 moeten worden geoptimaliseerd.

<ol><li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPorter%2C+DL+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. , (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%2B+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li>
<li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+a+house+of+cards%3A+re-evaluating+CD8%2B+T-cell+immune+correlates+against+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li>
<li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben geschetste protocol voor een high-throughput eencellige cytolytische assay geactiveerd door co-incubatie van effectors en doelen in arrays van nanowells (figuur 1). Naast throughput een belangrijk voordeel van de techniek is de mogelijkheid om effector-gemedieerde cytotoxiciteit tegen gewenste doelcellen volgen zonder doelcel techniek wat op zijn beurt het gebruik van autologe of matched / primaire tumorcellen als doelcellen. De ruimtelijke opsluiting maakt het ophalen en daaropvolgende kloner...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Cellgro </td><td> 30-002 CI- </td><td> 10.000 IU Penicilline 10.000 ug / ml streptomycine </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 CI- </td><td> 200 mM oplossing </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lot getest </td></tr><tr><td> Cell Tracker Red Stain </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 ug </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Stain </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX groene Nucleic Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexine V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Noble agar </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% vloeistof, steriel gefiltreerd </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Heldere lijn </td></tr><tr><td> 4-putjesplaat </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plasma Cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Basic plasma reiniger </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Fluorescentie microscoop (werkt met de drie delen hieronder) </td></tr><tr><td> Lambda tien-drie </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Filter controller </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​Golflengte switcher </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD Camera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> CCD-Microscoop camera </td></tr><tr><td> 15 ml conische buis </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml conische buis </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Met glazen bodem cultuur schotel </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm petrischaaltje 10 mm microwell </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput eencellige cytotoxiciteit t cellen

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Immunotherapie van kanker kunnen benutten van de specificiteit van immuunrespons op te richten en te elimineren tumoren. Adoptieve celtherapie (ACT) gebaseerd op de adoptieve overdracht van T-cellen genetisch gemodificeerd om een chimeer antigen receptor (CAR) expressie blijkt aanzienlijke belofte in klinische proeven 1-4. Er zijn verscheidene voordelen aan het gebruik CAR + T cellen voor de behandeling van kanker inclusief de mogelijkheid om niet-MHC beperkte antigenen te richten en de T-cellen voor optimale overleving, homing en persistentie in de gastheer functionaliseren en uiteindelijk apoptose induceren van CAR + T-cellen bij ontvangst toxiciteit 5. Afbakening van de optimale functies van CAR + T cellen geassocieerd met klinische voordelen zijn essentieel voor het ontwerpen van de volgende generatie klinische trials. Recente ontwikkelingen in levende dieren imaging zoals multifoton microscopie hebben een revolutie in de studie van de immuun cel functie in 6,7 vivo. Hoewel deze studies hebben ons begrip van T-cel functie in vivo, T-cel-gebaseerde ACT in klinische proeven vereist de noodzaak moleculaire en functionele kenmerken van T-cel preparaten koppelen pre-infusie met klinische werkzaamheid na de injectie door gebruik in vitro testen bewaken T-cel functies zoals, cytotoxiciteit en cytokine secretie. Flow-cytometrie standaard gebaseerde testen ontwikkeld die bepalen de algemene werking van populaties van T-cellen in de eencellige niveau, maar deze zijn niet geschikt voor het bewaken conjugaat vorming en levens of het vermogen van dezelfde cel te doden meerdere doelen 8. Microfabricated arrays ontworpen biocompatibele polymeren zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) een bijzonder aantrekkelijke methode om ruimtelijk beperken effectoren en targets in kleine volumes 9. In combinatie met automatische time-lapse fluorescentiemicroscopie, thousands van effector-target interacties gelijktijdig monitoren door beeldvorming afzonderlijke putjes van een nanowell array. We stellen hier een high-throughput methode daartoe T-cel gemedieerde cytotoxiciteit bij de eencellige niveau breed toepasbaar voor onderzoek naar de functies van cytolytische T-cellen.

Een voorbeeld van de toepassing van de high-throughput cytolytische assay aangetoond in figuur 2. Kort, gemerkt CD19-specifieke CAR + T-cellen werden geco-incubeerd met gelabelde muizen EL4 doelcellen in de afzonderlijke putjes van een nanowell array (hoofdstukken 1-5). Een eerste beeld werd opgenomen op de geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop om de bezettingsgraad (effectoren en / of doelstellingen) van elke nanowell te identificeren op de array (hoofdstuk 6). Beeldverwerking werd gebrui...

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Dit experimentele systeem biedt een methode met hoge doorvoer voor het monitoren van T-celgemedieerde cytotoxiciteit op het niveau van één cel. Label eerst de effector T-cellen en tumordoelcellen met fluorescerende kleurstoffen. Laad beide celtypen op de nano-wel-arrays en dompel de hele chip onder in een medium dat cyt groen en fluorescerend gelabelde nexin.Vijf bevat.Om zowel necrotische als apoptotische cellen te identificeren, neem nu een initiële pre-afbeelding op om de bezetting van de wells en de levensvatbaarheid van de cellen aan het begin van de test te bepalen. Na een incubatie van zes uur neem een tweede afbeelding op. Gebruik vervolgens geautomatiseerde beeldanalyse om de antigeenspecifieke lysis van EL vier CD 19 positieve door car positieve T-cellen te kwantificeren.De resultaten die met deze methode met hoge doorvoer zijn verkregen, kunnen de antigeenspecifieke lysis van doelwitten door effectorcellen screenen op basis van positieve kleuring met cytoxin.Vijf. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de chromium 51 release assay is dat echte een-op-een effectieve doelinteracties kunnen worden bereikt en de satellietfreque

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het chromium afgifte assay, een gemeenschappelijke test voor het detecteren cytotoxische T-celactiviteit, heeft verschillende beperkingen. Gebruikmakende van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen en humane borsttumor lijn, SKBR3, in dit artikel is een impedantie-gebaseerde aanpak onderzocht kan detecteren celdoding.

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

This video demonstrates a method for monitoring CAR T cell activity against cancer cells through real-time electrical impedance measurements. Tracking changes in impedance assesses the effectiveness of CAR T cells in inducing cancer cell cytolysis, providing insights into their cytotoxic capabilities.

A Real-Time In Vitro Cytolysis Assay to Evaluate the Potency of CAR T Cells

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.

Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Dit protocol schetst een gedetailleerde procedure voor het genereren van voorbijgaande chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen met behulp van niet-integrerend mRNA voor kankerimmunotherapie en biedt betrouwbare methoden voor het evalueren van CAR-T-cellen en hun cytotoxische functie.

Een niet-virale benadering om voorbijgaande chimere antigeenreceptor-T-cellen te genereren met behulp van mRNA voor immunotherapie bij kanker

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Leer een high-throughput methode voor het meten van T-cel cytotoxiciteit op enkelcellig niveau met behulp van nano-well arrays en fluorescentiemicroscopie. Deze techniek verbetert de analyse van immuunresponsen tegen tumorcellen.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Meer video's verkennen