Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen
2 februari 2013
We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.
Dit experimentele systeem biedt een methode met hoge doorvoer voor het monitoren van T-celgemedieerde cytotoxiciteit op het niveau van één cel. Label eerst de effector T-cellen en tumordoelcellen met fluorescerende kleurstoffen. Laad beide celtypen op de nano-wel-arrays en dompel de hele chip onder in een medium dat cyt groen en fluorescerend gelabelde nexin.Vijf bevat.
Om zowel necrotische als apoptotische cellen te identificeren, neem nu een initiële pre-afbeelding op om de bezetting van de wells en de levensvatbaarheid van de cellen aan het begin van de test te bepalen. Na een incubatie van zes uur neem een tweede afbeelding op. Gebruik vervolgens geautomatiseerde beeldanalyse om de antigeenspecifieke lysis van EL vier CD 19 positieve door car positieve T-cellen te kwantificeren.
De resultaten die met deze methode met hoge doorvoer zijn verkregen, kunnen de antigeenspecifieke lysis van doelwitten door effectorcellen screenen op basis van positieve kleuring met cytoxin.Vijf. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de chromium 51 release assay is dat echte een-op-een effectieve doelinteracties kunnen worden bereikt en de satellietfrequentie kan worden gemeten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van kanker, omdat het mogelijk maakt correlaties van werkzaamheid in autologe celtherapie te bestuderen. Om nano-wellen te fabriceren met behulp van de siliconen master, meng eerst grondig de cigar 180 4 elastomerenkitbasis en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10 tot 1 in gewicht in een wegwerpbekker met behulp van een plastic mes. Ontgast het mengsel gedurende een uur in een vacuümkamer.
Giet vervolgens het mengsel op de siliconen master en laat het 30 minuten staan. Om het elastomeren te harden, verwarm de assemblage gedurende twee uur in een oven van 80 graden Celsius na afkoeling op kamertemperatuur gedurende een uur. Verwijder voorzichtig de PDMS nano-wel-array van de siliconen master.
Bedek het met scotchtape totdat u een dag voor het experiment 5 miljoen doelcellen in vijf milliliters passeert. Op de dag van het experiment. Pellet 5 miljoen cellen in een steriele 15 milliliter conische buis door centrifugatie bij 340 Gs gedurende vijf minuten.
Zuig overtollig medium af en laat ongeveer 50 microliter medium achter om de cellen te labelen. Voeg 150 microliter van de verse celtracker rode werkoplossing toe en meng grondig met behulp van een P 200 pipetteerpipet. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Gebruik een hemocytometer om de effectorcellen die uit het kweekmedium zijn gehaald te tellen.
Pellet vervolgens 5 miljoen cellen in een steriele 15 milliliter conische buis door centrifugatie. Zuig het overtollige medium af. Voeg vervolgens een verse werkoplossing van vijf micromolair vibrant D cyclus violet kleurstof toe en schud opnieuw op met behulp van een P 200 pipetteerpipet.
Incubeer de cellen en de kleurstof gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide bij 6,8 milliliter en 6,0 milliliter van R-P-M-I-P-L-G-H voor doel- en effectorcellen respectievelijk en meng door pipetteren. Laag vervolgens langzaam 3,5 milliliter fial pack plus op de bodem van elke buis, centrifugeer beide buizen bij 340 GS gedurende 30 minuten zonder pauze en versnelling tijdens centrifugatie, bereid de nano-wel-array voor. Breng eerst zeven milliliter pre-war PBS over naar een vier-well plaat. Reinig de bodem van de glasplaat met ethanol met behulp van een plasma oxidator.
Behandel de PDMS op hoge RF-instelling gedurende 30 tot 45 seconden. Plaats vervolgens de array in de PBS. Breng de plaat over naar een bioveiligheidskast en zuig overtollig PBS af. Breng warm 1% edel agar aan op de boven- en onderkant van de glasplaat om de array te immobiliseren.
Zorg ervoor dat u de PDMS niet laat drogen na 10 minuten bij drie milliliter PBS en zuig het overtollige agar af. Voeg vervolgens drie milliliter van R 10 toe aan de bovenkant van de nano-wel-array en laat het ongeveer 10 minuten gelijkmaken. Na de Fial-centrifugatie zuigt u vijf milliliter medium af van de bovenste laag van elke buis.
Zorg ervoor dat u niet het laagje met de cellen aanzuigt met een P 1000 pipetteerpipet. Haal de witte laag cellen tussen de fial en het medium op. Breng de cellen over in nieuwe steriele conische buizen.
Was nu de geoogste effector- en doelcellen twee keer met drie milliliter pre-war R-P-M-I-P-L-G-H. Na de laatste centrifugatie zuigt u het overtollige medium af en schudt u het cellenpellet op. Tel de levensvatbare cellen in 500 microliter R 10, met behulp van de trian blauwe exclusiemethode op een hemocytometer. Zuig het overtollige medium van de nano-wel-array af.
Voeg vervolgens twee milliliter verse R 10 toe en zuig af. Zorg er opnieuw voor dat de bovenkant van de nano-wel-array niet te nat of te droog is, omdat dit de verdeling van de cellen zal beïnvloeden. Deponeer nu eenmaal 10 tot de vijfde macht van effectorcellen in 200 microliter R 10 op het oppervlak van de nano-wel-array. Laat de cellen vijf minuten bezinken.
Verifieer vervolgens met behulp van een standaard weefselkweekmicroscoop de gewenste verdeling van de cellen. Deponeer vervolgens eenmaal 10 tot de vijfde macht van doelcellen in 200 microliter R 10 op het oppervlak van de nano-wel-array met de effectorcellen. Evalueer na vijf minuten de verdeling van de cellen door microscopie.
Spoel vervolgens de nano-wel-array voorzichtig af met twee milliliter R 10 en zuig het overtollige medium af in een aparte steriele 15 milliliter conische buis. Pipetteer drie milliliter voorverwarmd R 10 bij drie microliter 0,5 millimolair cyt groen nucleïnezuurkleuring en 60 microliter van een X in vijf LOR 6 47 goed door elkaar mengen met behulp van pipetteren. Pipetteer nu voorzichtig de kleurstof
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een high-throughput assay voor het meten van de cytotoxiciteit van T-cellen tegen tumor-doelcellen op single-cell niveau. De methode maakt gebruik van een dichte elastomere array van sub-nanoliter putjes om de cellen ruimtelijk te beperken en hanteert fluorescentiemicroscopie voor de monitoring.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Kankerbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van T-celgemedieerde cytotoxiciteit is essentieel voor kankerimmunotherapie.
- Huidige methoden missen mogelijk de resolutie om interacties tussen individuele cellen te analyseren.
- High-throughput technieken kunnen de efficiëntie van dergelijke studies verbeteren.
- Deze studie presenteert een nieuwe benadering met gebruik van nano well arrays.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om de cytotoxiciteit van T-cellen op single-cell niveau te beoordelen.
- Het gebruikmaken van fluorescentiemicroscopie voor gedetailleerde observatie van celinteracties.
- Het verbeteren van het begrip van de effectiviteit van T-cellen tegen tumorcellen.
Gebruikte methoden
- Het labelen van effector-T-cellen en tumor-doelcellen met fluorescente kleurstoffen.
- Het laden van cellen op nano-well arrays voor ruimtelijke beperking.
- Het incuberen van cellen in een medium dat cyt green en fluorescent gelabeld nexine bevat.
- Het gebruik van geautomatiseerde beeldanalyse om cellysis na incubatie te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van antigenspecifieke lysis van doelcellen door T-cellen.
- Identificatie van necrotische en apoptotische cellen via beeldvorming.
- Demonstratie van de high-throughput mogelijkheden van de assay.
- Validatie van de methode voor toekomstige immunologische studies.
Conclusies
- De ontwikkelde assay biedt een robuust platform voor het bestuderen van de cytotoxiciteit van T-cellen.
- Fluorescentiemicroscopie in combinatie met nano-welltechnologie verhoogt de precisie van de analyse.
- Deze methode kan bijdragen aan vorderingen in het onderzoek naar kankerimmunotherapie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze high-throughput single-cell cytotoxiciteitsassay maakt een nauwkeurige kwantificering van antigeenspecifieke T-cellyse mogelijk, waardoor een kritisch gat in de ontwikkeling van immunotherapie wordt gedicht door functionele attributen vóór infusie te koppelen aan klinische uitkomsten na infusie. De methode ondersteunt het mechanistische risicobeheersing van CAR-T-celkandidaten (chimeric antigen receptor) via reproduceerbare readouts met een single-cell resolutie van conjugaatvorming en seriële killing-capaciteit. Door kwantitatieve, op imaging gebaseerde eindpunten te bieden, wordt het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-kandidaten en portfoliotriage voor adoptieve celtherapieprogramma's vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door antigeenspecifieke lyse op single-cell resolutie te meten, wat de functionele potentie van gemanipuleerde T-cellen verduidelijkt.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door gestandaardiseerde kwantificering van de frequenties van necrotische en apoptotische cellen met behulp van cytotoX.Five en nucleïnezuurkleuring.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfoliotriage door de dynamiek van effector-target conjugatie en de frequentie van seriële doding te correleren met voorspellers voor therapeutische effectiviteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door kwantitatieve lysis-histogrammen te genereren vanuit nano-well arrays waarin enkelvoudige effector-targetparen zijn ingesloten.
- Reproduceerbaarheid: Adresseert de standaardisatie van de assay via geautomatiseerde beeldanalyse van fluorescentiesignalen over duizenden wells, waardoor variabiliteit door de operator wordt geminimaliseerd.
- Schaalbaarheid: Benadrukt de screening-geschiktheid via parallelle monitoring van duizenden effector-targetinteracties, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of constructen mogelijk maakt in immunologische screeningscascades.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziekten door correlaten van werkzaamheid bij autologe celtherapie te modelleren met behulp van CAR+ T-cellen en antigeen-positieve tumor-doelwitten in een gecontroleerde micro-omgeving.
- Preklinische Afstemming: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door antigeen-specifieke lysis te meten als een functionele biomarker die voorspellend is voor in vivo activiteit.
- Risico-gecorrigeerde Beslissingen: Ondersteunt beslissingen over verdere ontwikkeling door achtergrondlyse-frequenties (2–4%) te rapporteren als drempelwaarden voor negatieve controles voor de interpretatie van specifieke signalen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor een kwantitatieve beoordeling van de cytolytische functie van T-cellen mogelijk is vóórdat er preklinische investeringen worden gedaan.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking ondersteunt door antigeenspecifieke lysegebeurtenissen in individuele nanobronnen te isoleren, waardoor storende invloeden van polyclonele effecten worden verminderd.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid door ruimtelijke opsluiting van effector- en doelcellen in sub-nanoliterbronnen, wat het volgen van één-op-één interacties en de meting van satellietfrequentie voor de beoordeling van seriële killing mogelijk maakt.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals de antigeenspecifieke lysefrequentie, gekwantificeerd via cytoxin.Five positieve kleuring en geautomatiseerde beeldanalyse, wat statistische resultaten oplevert voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door functionele kenmerken van T-cellen vóór infusie (bijv. killing-kinetiek, levensduur van conjugaten) te koppelen aan modellering van de effectiviteit na infusie in contexten van autologe celtherapie.
- Enterprise Hergebruik: Presenteert de methode als een herbruikbaar platform voor teams in de immunologie en oncologie, aanpasbaar voor time-lapse imaging van conjugatiedynamiek of cytokine-secretieprofielen via complementaire technieken zoals micro grabbing.
Operationele & bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in effectorfuncties van T-cellen en verduidelijking van correlaten van klinisch voordeel.
- Operationele waarde: Standaardisatie via geautomatiseerde beeldvorming en analyse, reproduceerbaarheid over wells en schaalbaarheid naar duizenden datapunten per run.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door kwantitatieve lysisdrempels, kapitaalefficiëntie in screeningcampagnes en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij de ontwikkeling van ACT.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van antigeenspecifieke lysisprofielen en seriële killingcapaciteit, wat datagedreven voortgang van lead-kandidaten mogelijk maakt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescente celmarkering, fabricage van nano-well arrays (PDMS-gieten vanaf een silicium master) en het bedienen van fluorescentiemicroscopie.
- Vereist instrumentatie, waaronder een fluorescentiemicroscoop met gemotoriseerde tafel (bijv. Zeiss Observer Z1), Lambda DG4 voor excitatie en geautomatiseerde beeldanalyse-software voor XYZ-positionering en signaalquantificatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams in kleuringsprotocollen (cytotoxin.Five, nucleïnezuurkleuringen, celtrackers) en incubatiecondities (37°C, 5% CO2) om de bezettingsgraad van de wells en signaalconsistentie te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende target-/effectorceltypen, aangezien optimale celdichtheden en kleuringsvolumes getitreerd moeten worden om overbezetting van de wells of uitdrogingsartefacten te voorkomen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om agitatie tijdens incubatie te vermijden om celverplaatsing te voorkomen en de vereiste voor plasma-oxidatie van PDMS-oppervlakken om hydrofiele eigenschappen van de wells te waarborgen.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Fabrication of Arrays of Nanowells in PDMS
2:14
Target Cell (T) Labeling
2:53
Effector (E) Cell Labeling
3:26
Separation of Live and Dead Cells by Ficoll Density Gradient
5:23
Cell Loading onto Nanowell Array
6:51
Imaging
7:58
Results: A High-throughput Cytolytic Assay
9:03
Conclusion
