Name: Procedure voor decellularisatie van Varkens Heart van Retrograde coronaire perfusie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Leer decellularisatie van varkenshart via retrograde coronaire perfusie voor cardiale weefselengineering. Deze methode verwijdert celcomponenten en creëert een locatiespecifiek extracellulair matrix-skelet.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Brogan Gast, Michelle Weaver, en Kristen Lippert erkennen. De financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door NIH Grant R03EB009237, evenals NIH-beurzen voor opleiding T32EB001026-06 van het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering en T32HL076124-05.

1. Tissue Voorbereiding en Experiment Setup <ol><li> Oogst varkens orgaan onmiddellijk na euthanasie vanuit een slachthuis of onderzoeksfaciliteit en spoel het overtollige bloed. Trim het hart van overtollig vet en weefsel, het bijhouden van de atria en de aorta intact. Snij vet om de longslagader te scheiden van de aorta. Als er bezuinigingen in het weefsel, de juiste gooi. </li><li> Individueel Wikkel elk hart in de vriezer papier en bewaar alle weefsel in een -80 ° C vriezer voor tenminste 24 uur om een ​​volledige bevriezing te garanderen. </li><li> Wanneer klaar voor gebruik (meestal minder dan 3 maanden), dooi een intacte bevroren varkens hart in Type 1 water &#39;s nachts ondergedompeld in een 4 L beker bij 4 ° C. </li><li> Nadat het hart is volledig ontdooid, dep het hart droog is, weegt het hart, en registreer het gewicht. Het hart van een markt gewicht varken moeten wegen ongeveer 375 tot 450 g. </li><li> Sluit maat 18 Masterflex slang aan op de ¼ &quot;einde van een prikkeldraad reducer. Steek het prikkeldraad reducer enslang in de aorta. Plaats 2 slangklemmen of beveiligde zip banden rond de aorta, net onder de brachiocephalic kofferbak. Het verloopstuk en leidingen moeten blijven boven de aortaklep, waardoor de kransslagaders worden geperfuseerd (figuur 1). </li><li> Gebruik een 30 of 60 ml spuit om de slang te vullen met type I water. Plaats de buis in de cartridge van een Masterflex rollerpomp op zijn benadering middelpunt. Dompel het instroomeinde van de buis in de bodem van een 4 L beker gevuld met 2,5 L water en zet de slang. </li><li> Plaats het hart in het bekerglas gevuld met water, en prime de pomp om luchtbellen te verwijderen. Als er bellen worden waargenomen vanuit de aorta, waar de slang is geplaatst, kan de aorta moet worden verplaatst of vastgezet met extra banden. Een luchtdichte afdichting is belangrijk om voldoende druk te handhaven tijdens de cellen ontdoen proces (figuur 2). </li><li> Plaats het bekerglas met 4 L 3 L van een 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 oplossing op roerplaat en warm deze op tot 37 ° C in de voorbereiding van de decellularisatie proces. </li></ol> 2. Tissue Spoelt <ol><li> Stel de pomp met een debiet van 400 ml / min, waarbij de juiste slang is gekozen. Spoel het hart met Type I water voor 15-25 minuten. Als de pomp wordt gestart, moet het hart zwellen en uitstrooien bloed uit de ventrikels. Verse oplossing worden vervangen elke 5-10 min, of zoveel als nodig gebaseerd op de hoeveelheid bloed uit het hart. Als er bloed wordt niet effused uit het hart, past u de slangen en klemmen als het nodig is. </li><li> Stop de pomp en breng het hart een afzonderlijk bekerglas gevuld met 2X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Nadat de buis ondergedompeld in oplossing, start de pomp aan en de stroomsnelheid van 700 ml / min. Het hart blijven in oplossing gedurende 15 min, verandert de oplossing om de 5 minuten. Elke oplossing verandering vereist de pomp tijdelijk is gestopt terwijl het weefsel en slang verplaatstde nieuwe bekerglas. </li><li> Breng de hart I water type voor 10 min en de stroomsnelheid te verhogen tot 750 ml / min. </li></ol> 3. Decellularisatie en oplossing Perfusie <ol><li> Breng het hart in het bekerglas met 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 bij 37 ° C. Verhoog de pompsnelheid 1200 ml / min en start de pomp. Gebruik een roerstaaf geplaatst op de bodem van het bekerglas oplossing circuleren in het bekerglas. Het hart blijven in de 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 oplossing bij 37 ° C voor een totaal van drie uur. Na 1 uur verhogen pompsnelheid 1500 ml / min. Na een uur, verhoogt de pompsnelheid 1800 ml / min. Het weefsel wordt langzaam onderworpen aan verhoogde perfusie snelheid wordt om het weefsel en voorkomen breuk van de vaten. Het hart zal opzwellen en bijna het dubbele in omvang tijdens deze stap van het protocol. Het weefsel verliest zijn natuurlijke kleur, vordert van de atria naar de top in heel ee protocol (figuur 3). </li><li> Na elke oplossing perfusie, is een twee stappen spoeling uitgevoerd om cellulaire puin, chemisch residu, en de steun cellysis te verwijderen. Elke spoeling bestaat uit een 10 min spoelen met Type I water gevolgd door 10 min spoelen met PBS 2X oplossing bij kamertemperatuur. Elke wassing bestaat uit het verwijderen van de oplossing van de oorspronkelijke bekerglas toegevoegd spoel oplossingen en circuleren de perfusievloeistof in het bekerglas met ondergedompelde hart. Na 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 oplossing perfuseren water op 1900 ml / min en vervolgens 2X perfuseren PBS op 1950 ml / min. </li><li> Breng het hart aan een oplossing van 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 bij kamertemperatuur. Verhoog de pompsnelheid 2000 ml / min en perfuseren oplossing gedurende een uur. Verwijder de oplossing van de beker en vervangen door verse oplossing, verhogen de pompsnelheid tot 2100 ml / min en perfuseren de verse oplossing tegen anderhalf uur, waardoor de totale tijd in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 tot 2,5 uur. </li><li> Spoel het weefsel in Type I water bij 2150 ml / min en 2x PBS bij 2180 ml / min gedurende 10 min. elk. </li><li> Breng het hart aan 4% natriumdeoxycholaat oplossing bij kamertemperatuur. Verhoog de pompsnelheid 2200 ml / min en perfuseren oplossing gedurende 3 uur. </li><li> Spoel het weefsel in Type I water en 2x PBS bij 2200 ml / min gedurende 15 min elk, veranderen de oplossingen na 5-10 min voor elke oplossing. De beschreven perfusie stappen kunnen worden verdeeld over meerdere dagen na door de spoel stap tweemaal en opslaan van het hart met bevestigde buis overnacht bij 4 ° C en ondergedompeld in Type I water. </li><li> De volgende dag voeren op 5 min met Type I water spoelen bij 750 ml / min, gevolgd door een 5 min spoeling in 1X PBS op 1500 ml / min. Het protocol kan vervolgens voortgezet worden beschreven debiet in de juiste oplossing. </li></ol> 4. Desinfectie en eindverwerking <ol><li> Breng het hart een 0,1% peracetic zuur / 4% ethanol oplossing en perfuseren oplossing gedurende 1,5 uur bij 2200 ml / min. </li><li> Het uiteindelijke spoelen voor het weefsel worden alle uitgevoerd bij 2200 ml / min. Perfuseren het weefsel met 1X PBS gedurende 15 minuten gevolgd door twee wassingen in 5 min Type I water. Deze serie spoelingen wordt nog eens herhaald om de oplossing perfusie voltooien. </li><li> Schakel de pomp uit en verwijder het hart uit de oplossing naar het hart af te tappen. Snijd de banden van de aorta, verwijdert u alle slangen, en plaats het hart in een lege beker om uit te lekken gedurende 1 uur. Overtollige vloeistof moet regelmatig worden afgetapt. Leg de hart op een absorberend kussen om al het water het hart (figuur 4). </li><li> Na de meeste water wordt verwijderd, registreer het gewicht van het cardiale extracellulaire matrix (ECM-C). Het hart kan worden verwacht dat ongeveer 20-25% van zijn oorspronkelijke gewicht te verliezen tijdens het proces ontcelling. </li><li> Ontleden de rechter en linker ventrikels, en de ventriculaire septum voor DNA quantification en histologische verwerking om volledige ontcelling van het weefsel (Figuur 5) te bevestigen. </li><li> Bevriezen C-ECM bij -80 ° C gedurende ten minste 2 uur vóór lyofilisatie. </li></ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization%3A+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+journal+%3A+official+journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li>
<li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li>
<li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li>
<li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+tissues%2C+organs%22%5BJournal%5D)">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li>
</ol>

Dr Gilbert was op de Scientific Advisory Board van ACell, Inc terwijl het onderzoek werd gedaan, en sinds kort de VP van onderzoek en ontwikkeling. ACell, Inc verkoopt urineblaas matrix en heeft geen commercieel belang in de huidige studie.

De huidige studie beschreven methodologie voor consistente en efficiënte decellularisatie van een varkens hart. Het protocol was een modificatie van een eerder gepubliceerde report 1 en opgenomen langere blootstelling aan verhoogde druk en debiet die meer herhaalbare resultaten ontvangen. De resulterende ontcelde weefsel voldeed aan alle gepubliceerde criteria voor een succesvolle decellularisatie van weefsel 2. Frequente veranderingen oplossing werden uitgevoerd om de herinvoering van celmateriaal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Visser </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Visser </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdeoxycholaat </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> Perazijnzuur </td><td> Pfaltz en Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Masterflex Pump Drive </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Tubing </td><td> Cole Parmer </td><td> 96.400-18 </td><td> Maat 18 </td></tr><tr><td> Barbed Reducer </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30.612-20 </td><td></td></tr><tr><td> 4L Beaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure voor decellularisatie van varkens heart van retrograde coronaire perfusie

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based geheel orgaan ontcelling heeft onlangs verworven belang op het gebied van weefselmanipulatie als middel om site-specifieke extracellulaire matrix scaffolds maken, terwijl grotendeels behoud van de natieve structuur van de steiger. Tot op heden is deze benadering gebruikt in verschillende orgaansystemen, waaronder het hart, longen en lever 1-5. Previous decellularisatie werkwijzen voor weefsels geen gemakkelijk toegankelijke vasculaire netwerk zijn uitgegaan van langdurige blootstelling van weefsel oplossingen van wasmiddelen, zuren of enzymatische behandeling als een middel om de cellulaire en nucleaire componenten uit het omringende extracellulaire omgeving 6-8. De effectiviteit van deze methoden scharnierend op het vermogen van de oplossingen het weefsel permeaat via diffusie. In tegenstelling, perfusie van organen door het natuurlijke vasculaire systeem effectief verminderd de verspreiding afstand en vergemakkelijkt het transport van decellularizatide agenten in het weefsel en cellulaire componenten uit het weefsel. Hierin beschrijven we een methode om een ​​intacte varkens hart volledig decellularize door coronaire retrograde perfusie. Het protocol leverde een volledig cardiale cellen ontdane extracellulaire matrix (ECM-c) scaffold met de driedimensionale structuur van het hart intact. Onze methode een aantal enzymen, wasmiddelen, en zuren combinatie met hypertone en hypotone spoelingen te helpen bij de lysis van cellen en verwijdering. Het protocol een trypsine-oplossing om cellen van de matrix gevolgd door Triton X-100 en natriumdeoxycholaat oplossingen helpen bij verwijdering van celmateriaal los. De beschreven protocol gebruikt ook perfusie snelheden van meer dan 2 L / min gedurende langere tijd. De hoge stroomsnelheid, gekoppeld met een oplossing wijzigingen mogelijk transport van middelen om het weefsel zonder verontreiniging van celresten en gewaarborgd effectieve spoelen van het weefsel. De beschreven methode verwijderd alle nucleaire materiaal van native varkens hartweefsel, waardoor een site-specifieke cardiale ECM steiger die kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen.

Het effect van ontcelling op hele varkensharten varieert natuurlijk gevolg van verschillen in grootte, druk en vat arrangement. Daarom zal de exacte samenstelling van de afgeleide extracellulaire matrix scaffolds niet hetzelfde van hart tot hart. De voltooiing van de beschreven protocol levert een hart dat verschijnt wit of doorschijnend, met vermelding van het verlies van celmateriaal. Echter algemeen aanvaard dat een weefsel kan worden beschouwd &quot;ontcelde&quot; gebaseerd op de combinatie van een paar kwantitatiev...

Een methode om snel en volledig cellulaire componenten uit een intact varkens hart door retrograde perfusie beschreven. Deze methode levert een plaatsspecifieke cardiale extracellulaire matrix scaffold die het potentieel voor gebruik in verscheidene klinische toepassingen.

Procedure voor decellularisatie van Varkens Heart van Retrograde coronaire perfusie

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire componenten snel en volledig te verwijderen uit een intact varkenshart door middel van retrograde perfusie om een site-specifiek extracellulair matrix scaffold van het hart te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst de aorta van een intact varkenshart te canuleeren. Vervolgens wordt slangmateriaal aangesloten op een peristaltische pomp en wordt het weefsel gespoeld met water en zoutoplossingen bij lage stroomsnelheden.Het hart wordt vervolgens geperfundeerd met een reeks detergent en enzymatische oplossingen bij een geleidelijk stijgende stroomsnelheid om cellulaire componenten te verwijderen. De laatste stap is het perfunderen van een desinfectieoplossing. Verwijder de slangen en snijd de ventrikelwanden weg voor verwerking.Uiteindelijk wordt het hart geanalyseerd om de volledige verwijdering van cellulair en nucleair materiaal uit het weefsel te bevestigen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de canuleer- en initiële perfusiestappen moeilijk te leren zijn omdat de exacte positie van de slangen cruciaal is voor het succes van het experiment. Het varkensorgaan wordt direct na het euthanasiëren verkregen van een slachterij of onderzoeksfaciliteit.Begin met het afspoelen van overtollig bloed. Trim vervolgens het hart van overtollig vet en weefsel, houd de atria en aorta intact. Scheid de longslagader van de aorta door extra vet weg te knippen.Na het trimmen, wikkel elk hart afzonderlijk in vriespapier en bewaar het gedurende ten minste 24 uur bij min 80 graden Celsius om volledige bevriezing te garanderen. Wanneer klaar voor gebruik, ontdooi het hart door het onder te dompelen in een vier liter beker gevuld met type één water en laat het een nacht bij vier graden Celsius. Nadat het hart volledig is ontdooid, dep het droog en noteer het gewicht.Het hart van een marktgewicht varken moet ongeveer 375 tot 450 gram wegen. Zodra het hart klaar is, sluit u een Master flex slang van maat 18 aan op het kwartincheinde van een barbel reducer. Plaats vervolgens de barbel reducer en de slang in de aorta.Plaats twee slangklemmen of bevestig Zip-banden rond de aorta net onder de brachiocephalic trunk. De reducer en slang moeten boven de aortaklep blijven zodat de kransslagaders kunnen worden geperfundeerd. Gebruik vervolgens een spuit om de slang te vullen met type één water en steek deze in het karton van een master flex rollerpomp op ongeveer het middenpunt.Dompel vervolgens het instroomuiteinde van de slang, samen met het hart in de bodem van een beker gevuld met 2,5 liter water en bevestig. De moeilijkste aspecten van deze procedure zijn de juiste canuleer van het hart en het handhaven van voldoende pompsnelheden gedurende de procedure. We zorgen voor succes in ons experiment door het weefsel gedurende de procedure visueel te inspecteren op luchtbellen, evenals het handhaven van de juiste effusie van de ventrikels gedurende de procedure.Prime de pomp om luchtbellen uit de slangen te verwijderen, herpositioneer of bevestig extra banden rond de aorta en slangen als luchtbellen worden waargenomen. Een luchtdichte afdichting is belangrijk om voldoende druk tijdens het decellulatieproces te handhaven. Op dit punt verwarmt u een vierliter beker met drie liter gebalanceerde zout trypsinoplossing ter voorbereiding op het decellulatieproces.Stel eerst de pomp in op een stroomsnelheid van 400 milliliter per minuut en zorg ervoor dat de juiste slangmaat is geselecteerd. Start de pomp en spoel het hart met type één water gedurende 15 tot 25 minuten, het hart zou moeten zwellen en vers bloed uit de ventrikels vers oplossing moet worden vervangen elke vijf tot 10 minuten of naar behoefte. Nadat het bloed is verwijderd, stopt u de pomp en brengt u het hart over in een aparte beker gevuld met twee XPBS.Dompel de slang onder. Verhoog de stroomsnelheid naar 700 milliliter per minuut en start de pomp. Laat het hart 15 minuten in oplossing, ververs de oplossing elke vijf minuten.Wanneer u klaar bent, brengt u het hart over naar type één water gedurende 10 minuten en verhoogt u de stroomsnelheid naar 750 milliliter per minuut. Om het decellulatieproces te beginnen, brengt u het hart over naar de beker met warme gebalanceerde zout tryin oplossing. Verhoog de snelheid naar 1200 milliliter per minuut en start de pomp.Plaats een roerstaaf op de bodem van de beker voor circulatie en laat het hart drie uur in deze oplossing. Perfusiesnelheden worden langzaam verhoogd om het weefsel te conditioneren en scheuren van de vaten te voorkomen. Na een uur verhoogt u de pompsnelheid naar 1500 milliliter per minuut.Na een extra uur wordt de pompsnelheid verhoogd naar 1800 milliliter per minuut. Het hart zou moeten zwellen en bijna verdubbelen in grootte. Het weefsel zou zijn natuurlijke kleur moeten verliezen, beginnend bij de atria tot de apex.Na elke oplossingsperfusie wordt een tweede stap gespoeld om cellulair puin, chemische resten te verwijderen en cellyse te bevorderen Na de gebalanceerde zout trips en oplossing, perfundeerd u water bij 1900 milliliter per minuut en vervolgens twee XPBS bij 1950 milliliter per minuut gedurende 10 minuten elk. Breng vervolgens het hart over naar een kamertemperatuur zout balance oplossing van Triton X 100. Verhoog de pompsnelheid naar 2000 milliliter per minuut en perfundeerd voor een uur.Na het opnieuw vullen met verse oplossing, verhoogt u de pompsnelheid naar 2100 milliliter per minuut en perfundeerd u een extra anderhalf uur. Spoel vervolgens het weefsel zoals eerder aangetoond, maar bij verhoogde pompsnelheden. De volgende perfusie is met kamertemperatuur 4% natrium deoxy coate.Verhoog de pompsnelheid naar 2200 milliliter per minuut en perfundeerd u drie uur. Na drie uur herhaalt u de spoelstappen, vervangt u de oplossingen na vijf tot 10 minuten voor elke oplossing. Na de laatste perfusie brengt u het hart over naar een 0,1% paracetic zuur, 4% ethanol oplossing en perfundeerd

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we perform Langendorff retrograde perfusion of an isolated mouse heart. During the procedure, the cardiac activity of the heart is maintained by perfusing it retrogradely with a perfusion solution via the coronary arteries using a cannula inserted into the ascending aorta. The model is used to study the cardiac pathophysiology of the heart.

Langendorff Retrograde Heart Perfusion: An Ex Vivo Technique to Perfuse Isolated Mouse Heart

In this video, we describe a step-by-step protocol to extract the heart from a porcine model for cardiac transplantation.

Porcine Heart Excision: A Protocol to Extract Porcine Heart for Cardiac Transplant

This video describes an ex situ technique for preserving an isolated porcine heart by perfusing it with an oxygenated nutrient-rich perfusate solution. The technique allows the comprehensive evaluation of cardiac performance under physiological conditions.

Ex Situ Heart Perfusion: A Technique to Preserve Isolated Porcine Heart Function

Deze methode kan decellularization voor een complexe solide orgel met behulp van een eenvoudig protocol gebaseerd op osmotische schok en perfusie van Ionische detergent met minimale orgel matrix verstoring. Het bestaat uit een roman decellularization-techniek voor menselijke harten binnen een hydrofoor etui met real-time bewaking van flow dynamics en cellulaire puin uitstroom.

Decellularization van gehele menselijk hart binnen een hydrofoor tasje in een omgekeerde richting

Normothermic ex situ hart perfusie (ESHP), behoudt het hart in een slaand, semi-fysiologische staat. Wanneer uitgevoerd in een werkmodus, biedt ESHP de mogelijkheid voor het uitvoeren van geavanceerde evaluaties van donor hart functie en orgel levensvatbaarheid. Hier beschrijven we onze methode voor de evaluatie van de myocardiale prestaties tijdens ESHP.

Normothermic Ex Situ hart perfusie in modus werken: beoordeling van cardiale functie en metabolisme

Hier beschrijven we een pre-klinisch groot dier (Porcine) model van orthotopic harttransplantatie dat stevig is vastgesteld en gebruikt om nieuwe cardioprotective strategieën te onderzoeken.

Een preklinisch varkens model van Orthotopic harttransplantatie

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

We presenteren een protocol voor het gebruik van een normotherme ex vivo sanguineuze perfusiesysteem voor de levering van therapeutica aan een volledig cardiaal allograft in een varkens heterotopisch harttransplantatiemodel.

Een porcine heterotopisch harttransplantatieprotocol voor de levering van therapeutica aan een cardiale allograft

Het protocol beschrijft de chirurgische verkrijging en daaropvolgende decellularisatie van gevasculariseerde varkensflappen door de perfusie van natriumdodecylsulfaatwater door de flapvasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor.

Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor

Screening op coronaire hartziekte zou de verkrijging van donorharten kunnen verhogen met uitgebreide criteria. Een protocol voor het uitvoeren van reproduceerbare coronaire angiografie tijdens ex-situ hartperfusie wordt hierin beschreven in een varkensmodel.

Coronaire angiografie tijdens ex-situ hartperfusie in een varkensmodel

Het protocol beschrijft hier een high-fidelity varkensmodel van harttransplantatie na donatie na dood van de bloedsomloop met behulp van ex vivo perfusie van het allotransplantaat.

Een high-fidelity varkensmodel van orthotope harttransplantatie na donatie na overlijden van de bloedsomloop

Leer decellularisatie van varkenshart via retrograde coronaire perfusie voor cardiale weefselengineering. Deze methode verwijdert celcomponenten en creëert een locatiespecifiek extracellulair matrix-skelet.

Procedure voor decellularisatie van Varkens Heart van Retrograde coronaire perfusie

Meer video's verkennen