Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa
May 1st, 2013
We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.
Het algemene doel van het volgende experiment is om binding van DNA-bindende eiwitten zoals transcriptiefactoren of histonenmodificaties te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst de chromatine voor te bereiden als tweede stap. Een chromatine-immunoprecipitatiereactie wordt ingesteld om fragmenten van DNA die aan het eiwit van belang zijn vast te leggen.
Vervolgens wordt het DNA-fragment dat aan het eiwit van belang is gebonden, geamplificeerd door PCR. Resultaten worden verkregen die een voudbevraging van het DNA-fragment laten zien dat aan het eiwit van belang is gebonden in vergelijking met een ongebonden gebied op basis van QPCR-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van transcriptie, chromatine en epigenetica, zoals wanneer en waar verschillende gemodificeerde of ongemodificeerde eiwitten aanwezig zijn.
Over het DNA Hoewel deze methode inzicht kan geven in T-celgenregulatie. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals B-lymfocyten, leukemiemonsters en geïmmortaliseerde cellijnen. De chromatine voor dit experiment zal worden bereid uit muis splenische naive CD vier T-cellen.
Om deze procedure te starten, voegt u 37% formaldehyde toe tot een eindconcentratie van 1% aan de CD vier T-celsuspensie in DMEM en schudt u zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Dit zal de DNA-eiwitcomplexen crosslinken. Stop de crosslinking door een molare glycine toe te voegen tot een eindconcentratie van 125 millimolar.
Vervolg het schudden gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en suspendeer de cellen in vijf milliliters ijskoud PBS met proteaseremmers, centrifugeer opnieuw, was de cellen op deze manier gedurende een totaal van drie keer na de laatste wassing, verwijder de supernatant en suspendeer de cellen in één milliliter ijskoud cellysebuffer met proteaseremmers.
Breng de celsuspensie over in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Verzamel de kernen door centrifugatie bij 200 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi voorzichtig het supernatant weg en suspendeer de kernen in 500 microliters nucleaire lysis.
Buffer met proteaseremmers, incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Soniceer vervolgens de cellen met een 1,6 millimeter sonde en een uitvoerniveau van vier gedurende 15 seconden. Koel het monster op ijs gedurende één tot twee minuten om oververhitting te voorkomen en soniceer opnieuw gedurende 15 seconden.
Herhaal de sonicatie en koeling gedurende een totaal van vier keer, centrifugeer de sonic chromatine bij 16.000 G gedurende vijf minuten. Bij vier vier graden Celsius. Verzamel het heldere supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis.
Verwijder een 20 microliter aliquot van helder supernatant. Voeg DNA-laadkleurstof toe en controleer de gesoniceerde DNA door middel van elektroforese door een 2% agrogel. De ideale grootte van gesoniceerde DNA voor de meeste toepassingen is 200 tot 500 basenpaar.
Bepaal ten slotte de DNA-concentratie met behulp van een UV-spectrofotometer. Gescheerde chromatine kan onmiddellijk worden gebruikt om een chromatine-immunoprecipitatiereactie op te zetten of worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius voor chromatine-immunoprecipitatie of chip verdund gesoniceerd chromatine tot een DNA-concentratie van vijf tot tien microgram per milliliter in een totaal volume van twee milliliters in chipverdunningsbuffer met proteaseremmers. Alle stappen in deze procedure moeten worden uitgevoerd bij nul tot vier graden Celsius.
Bewaar 10%, dat wil zeggen 200 microliter in dit voorbeeld van de verdunde gesoniceerde chromatine als invoer, bewaar op ijs van het resterende monster aliquot 450 microliter in elk van de vier 1,7 milliliter microviewbuizen gelabeld als isotypecontrole en antilichaam van belang. Als er meerdere antilichamen van dezelfde isotype worden gebruikt, is een enkele isotypecontrole voldoende. Om deze analyse uit te voeren, voegt u twee tot vijf microgram specifiek antilichaam toe, afhankelijk van de specificiteit van het gebruikte antilichaam of isotypecontrole, aan de respectieve buizen. Schud de buizen een nacht lang op vier graden Celsius om de vorming van chromatine-antilichaamcomplexen te laten plaatsvinden op de volgende ochtend.
Voeg 25 microliter proteïne G magnetische kralen toe aan elk mengsel en schud gedurende ten minste twee uur bij vier graden Celsius. Plaats vervolgens de fugebuizen gedurende 15 tot 20 seconden op een magnetische standaard om de kralen aan de gemagnetiseerde zijde te laten verzamelen. Verwijder voorzichtig de oplossing door aspiratie zonder de kralen te verstoren.
Voeg een milliliter lage zout wasoplossing toe en schud gedurende vijf minuten op de mutator. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Voeg opnieuw een milliliter lage zout wasoplossing toe en schud gedurende vijf minuten.
Na het verwijderen van de lage zout wasoplossing, voegt u een milliliter hoge zout wasoplossing toe en schudt u gedurende vijf minuten. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Herhaal de wassing met de hoge zout wasoplossing.
Eenmaal verwijderd de hoge zout wasoplossing, voegt u een milliliter lithiumchloride wasoplossing toe en schudt u gedurende vijf minuten. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Herhaal de lithiumchloride wassing eenmaal.
Voeg een milliliter TE-oplossing toe en schud gedurende vijf minuten. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Eluteer het DNA van de kralen door 250 microliter eluciaanbuffer toe te voegen, schud gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Pipetteer de EIT af en bewaar dit materiaal in een nieuwe 1,7 millimeter fugebuis. Herhaal dit nog eens en combineer beide elu, gooi de kralen weg om de crosslinks ongedaan te maken. Voeg aan het elueerde DNA vijf molair natriumchloride toe tot een eindconcentratie van 0,3 molair en één microliter RNA's toe.
Voeg een 40
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een robuuste methode voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van primaire T-cellen, die de efficiëntie voor beperkte celhoeveelheden verbetert. Het bevat een gedetailleerde beschrijving van de fase van gegevensanalyse.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Chromatine biologie
- Transcriptieregulatie
- Epigenetica
Achtergrond
- Chromatine immunoprecipitatie is een techniek die wordt gebruikt om eiwit-DNA-interacties te bestuderen.
- Primaire T-cellen zijn cruciaal voor het begrijpen van immuunreacties.
- Efficiënte methoden zijn nodig voor het werken met beperkte celmonsters.
- Gegevensanalyse is essentieel voor het interpreteren van ChIP-resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om binding van DNA-bindende eiwitten en histonmodificaties te detecteren.
- Om ChIP-methodologie voor primaire T-cellen te verbeteren.
- Om een uitgebreide analyse van de resulterende gegevens te bieden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van chromatine uit primaire T-cellen.
- Opzetten van een chromatine immunoprecipitatie-reactie.
- Amplificatie van DNA-fragmenten gebonden aan eiwitten van belang met behulp van PCR.
- Kwantitatieve PCR (QPCR) analyse om de voudverrijking te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van eiwit-DNA-interacties.
- Verbeterde efficiëntie in ChIP voor beperkte celhoeveelheden.
- Gedetailleerde analyse van bindingsgebeurtenissen en histonmodificaties.
- Inzichten in transcriptie, chromatine en epigenetische dynamica.
Conclusies
- De methode verbetert de studie van transcriptiefactoren en histonmodificaties.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers in chromatine en epigenetica.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies in immuuncelbiologie omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) enables target validation by mapping protein-DNA interactions, a critical step in de-risking therapeutic hypotheses. This protocol improves sensitivity and reproducibility for limited primary cell samples, supporting early discovery workflows where material is constrained. Quantitative analysis via standard curves and qPCR provides predictive confidence in binding specificity, informing go/no-go decisions in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates transcription factor binding to specific genomic regions, clarifying mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Enables functional validation of targets using limiting biomass, reducing reliance on large-scale cell culture.
- Predictive Value: Standard curve normalization allows quantitative comparison across conditions, supporting data-driven target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces enriched DNA fragments suitable for PCR-based quantification, enabling reproducible readouts.
- Standardization: Use of input DNA standard curves controls for primer efficiency and sample variability, improving assay consistency.
- Scalability: Protocol adapted for low-input systems, facilitating screening in primary or rare cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned studies by linking protein binding to functional genomic regions in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes specific binding from background using isotype controls and unbound genomic regions, reducing false positives.
- Preclinical Alignment: Enables chromatin state analysis in primary immune cells, relevant for immunomodulator target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly when working with primary or limited primary cell samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining where and when proteins bind DNA in chromatin.
- Screening: Generates quantitative ChIP-qPCR data suitable for evaluating compound effects on protein-DNA interactions.
- Analytics: Absolute quantification via standard curves enables inter-sample comparison and statistical rigor.
- Translational Research: Connects binding events to functional outcomes in primary T cells, relevant for immune-targeted therapies.
- Enterprise Reuse: Standardized workflow allows reuse across antibody and target panels in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-DNA interactions, increasing confidence in target biology.
- Operational Value: Standardized lysis, immunoprecipitation, and wash steps improve reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Enables early de-risking of targets by confirming chromatin engagement, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Quantitative enrichment data supports risk-adjusted prioritization of targets for lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin handling, antibody validation, and qPCR data analysis.
- Dependent on sonication equipment for consistent chromatin shearing and magnetic separation tools for immunoprecipitation.
- Necessitates standardized reagent lots and antibody qualification to ensure reproducibility across experiments.
- Adaptation to different cell types may require optimization of crosslinking and lysis conditions.
- Limited by antibody specificity and the need for appropriate control regions to distinguish specific from nonspecific binding.
