Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Het algemene doel van het volgende experiment is om binding van DNA-bindende eiwitten zoals transcriptiefactoren of histonenmodificaties te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst de chromatine voor te bereiden als tweede stap. Een chromatine-immunoprecipitatiereactie wordt ingesteld om fragmenten van DNA die aan het eiwit van belang zijn vast te leggen.

Vervolgens wordt het DNA-fragment dat aan het eiwit van belang is gebonden, geamplificeerd door PCR. Resultaten worden verkregen die een voudbevraging van het DNA-fragment laten zien dat aan het eiwit van belang is gebonden in vergelijking met een ongebonden gebied op basis van QPCR-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van transcriptie, chromatine en epigenetica, zoals wanneer en waar verschillende gemodificeerde of ongemodificeerde eiwitten aanwezig zijn.

Over het DNA Hoewel deze methode inzicht kan geven in T-celgenregulatie. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals B-lymfocyten, leukemiemonsters en geïmmortaliseerde cellijnen. De chromatine voor dit experiment zal worden bereid uit muis splenische naive CD vier T-cellen.

Om deze procedure te starten, voegt u 37% formaldehyde toe tot een eindconcentratie van 1% aan de CD vier T-celsuspensie in DMEM en schudt u zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Dit zal de DNA-eiwitcomplexen crosslinken. Stop de crosslinking door een molare glycine toe te voegen tot een eindconcentratie van 125 millimolar.

Vervolg het schudden gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en suspendeer de cellen in vijf milliliters ijskoud PBS met proteaseremmers, centrifugeer opnieuw, was de cellen op deze manier gedurende een totaal van drie keer na de laatste wassing, verwijder de supernatant en suspendeer de cellen in één milliliter ijskoud cellysebuffer met proteaseremmers.

Breng de celsuspensie over in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Verzamel de kernen door centrifugatie bij 200 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi voorzichtig het supernatant weg en suspendeer de kernen in 500 microliters nucleaire lysis.

Buffer met proteaseremmers, incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Soniceer vervolgens de cellen met een 1,6 millimeter sonde en een uitvoerniveau van vier gedurende 15 seconden. Koel het monster op ijs gedurende één tot twee minuten om oververhitting te voorkomen en soniceer opnieuw gedurende 15 seconden.

Herhaal de sonicatie en koeling gedurende een totaal van vier keer, centrifugeer de sonic chromatine bij 16.000 G gedurende vijf minuten. Bij vier vier graden Celsius. Verzamel het heldere supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis.

Verwijder een 20 microliter aliquot van helder supernatant. Voeg DNA-laadkleurstof toe en controleer de gesoniceerde DNA door middel van elektroforese door een 2% agrogel. De ideale grootte van gesoniceerde DNA voor de meeste toepassingen is 200 tot 500 basenpaar.

Bepaal ten slotte de DNA-concentratie met behulp van een UV-spectrofotometer. Gescheerde chromatine kan onmiddellijk worden gebruikt om een chromatine-immunoprecipitatiereactie op te zetten of worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius voor chromatine-immunoprecipitatie of chip verdund gesoniceerd chromatine tot een DNA-concentratie van vijf tot tien microgram per milliliter in een totaal volume van twee milliliters in chipverdunningsbuffer met proteaseremmers. Alle stappen in deze procedure moeten worden uitgevoerd bij nul tot vier graden Celsius.

Bewaar 10%, dat wil zeggen 200 microliter in dit voorbeeld van de verdunde gesoniceerde chromatine als invoer, bewaar op ijs van het resterende monster aliquot 450 microliter in elk van de vier 1,7 milliliter microviewbuizen gelabeld als isotypecontrole en antilichaam van belang. Als er meerdere antilichamen van dezelfde isotype worden gebruikt, is een enkele isotypecontrole voldoende. Om deze analyse uit te voeren, voegt u twee tot vijf microgram specifiek antilichaam toe, afhankelijk van de specificiteit van het gebruikte antilichaam of isotypecontrole, aan de respectieve buizen. Schud de buizen een nacht lang op vier graden Celsius om de vorming van chromatine-antilichaamcomplexen te laten plaatsvinden op de volgende ochtend.

Voeg 25 microliter proteïne G magnetische kralen toe aan elk mengsel en schud gedurende ten minste twee uur bij vier graden Celsius. Plaats vervolgens de fugebuizen gedurende 15 tot 20 seconden op een magnetische standaard om de kralen aan de gemagnetiseerde zijde te laten verzamelen. Verwijder voorzichtig de oplossing door aspiratie zonder de kralen te verstoren.

Voeg een milliliter lage zout wasoplossing toe en schud gedurende vijf minuten op de mutator. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Voeg opnieuw een milliliter lage zout wasoplossing toe en schud gedurende vijf minuten.

Na het verwijderen van de lage zout wasoplossing, voegt u een milliliter hoge zout wasoplossing toe en schudt u gedurende vijf minuten. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Herhaal de wassing met de hoge zout wasoplossing.

Eenmaal verwijderd de hoge zout wasoplossing, voegt u een milliliter lithiumchloride wasoplossing toe en schudt u gedurende vijf minuten. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Herhaal de lithiumchloride wassing eenmaal.

Voeg een milliliter TE-oplossing toe en schud gedurende vijf minuten. Verzamel de kralen met behulp van de magnetische standaard en verwijder de wasoplossing. Eluteer het DNA van de kralen door 250 microliter eluciaanbuffer toe te voegen, schud gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Pipetteer de EIT af en bewaar dit materiaal in een nieuwe 1,7 millimeter fugebuis. Herhaal dit nog eens en combineer beide elu, gooi de kralen weg om de crosslinks ongedaan te maken. Voeg aan het elueerde DNA vijf molair natriumchloride toe tot een eindconcentratie van 0,3 molair en één microliter RNA's toe.

Voeg een 40