Name: Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNAs in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer mRNA-visualisatie bij het endoplasmatisch reticulum in zoogdiercellen met fluorescentie in situ hybridisatie. Deze methode onthult hoe transcripten lokaliseren en reguleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science and Engineering Research Council van Canada om XAC en AFP

1. Voorbereiding van Materialen voor Extraction <ol><li> Bereiding van Cellen <ol><li> Seed weefselkweekcellen on zuurbehandelde coverslips ten minste een dag voor het experiment. Wij gebruiken COS-7 of U2OS, als deze twee cellijnen vertonen sterke productie van uitgescheiden eiwit en hebben een goed gedefinieerde ER. Merk op dat een hoge extractie efficiëntie, cellen niet zouden 80% confluentie op het dekglaasje op de dag van het experiment overschrijden. </li><li> Als een bepaalde exogene mRNA wordt onderzocht, worden de cellen getransfecteerd een dag na enten met plasmiden die het gen van interesse met behulp van standaard transfectie protocollen. De cellen worden vervolgens toegestaan ​​om de mRNA ten minste 18 uur vóór extractie drukken. </li></ol></li><li> Het behandelen van de Cellen met Translation Remmers <ol><li> Om het effect van intact ribosomen op het onderhoud van mRNAs associatie met de ER testen, kunnen cellen worden behandeld met translatie inhibitoren die de associatie verstorenribosomen van de mRNA 11. </li><li> Remmers van translatie-initiatie, zoals homoharringtonin (HHT), pactamycin of 2 - (4-methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (MDMP) voorkomen nieuwe ribosomen associëren met het transcript tegelijkertijd mogelijk betrokken op ribosomen volledige vertaling 12-14. Aangezien de vertaaltarief voor de meeste eiwitten in zoogdiercellen is 5 aminozuren per seconde, ongeacht codongebruik of mRNA lengte 15 dient een behandeling van 30 min duidelijk ribosomen off van berichten met open reading frames zolang 27000 nucleotiden (die coderen voor eiwitten Zolang 9.000 aminozuren). </li><li> Remmers, zoals puromycine bevorderen de voortijdige uitwerpen van de ontluikende keten en dus verstoren polysomen 12. Echter volledig de associatie van puromycine behandeld ribosomen met mRNA verstoren, moet magnesium chelatoren zoals EDTA worden toegevoegd aan de digitonine extractiebuffer 11. </li> &lt;li&gt; In dit experiment worden cellen behandeld met 200 uM puromycine, 5 uM HHT of control medium gedurende 30 min voor extractie. </li></ol></li><li> Voorbereiding van digitonine extractiebuffer. Om ER-gelokaliseerde mRNA&#39;s te visualiseren zonder de belemmering van de vrije (dwz cytoplasmatische, niet-ER-geassocieerde) transcripten, we selectief doorlaatbaar de cel met digitonine, een steroïde glycoside dat bij voorkeur interageert met 3β-hydroxysterols. Bij lage concentraties, digitonine permeabilizes selectief delen van het plasmamembraan, waardoor &#39;lekkage&#39; 16. Daarentegen zijn de ER membraan en nucleaire envelop, die arm in cholesterol, intact 16,17. <ol><li> Digitonine (Sigma Aldrich) poeder wordt opgelost in gedestilleerd water bij 5% gewicht / volume en deze voorraadoplossing wordt verdeeld in kleine volumes en opgeslagen in de -20 ° C. In onze ervaring meerdere vries-ontdooi cycli vermindert de efficiency van opgeloste digitonine. </li><li> Een voorraadoplossing van10x CHO buffer (1x werkoplossing concentratie: 115 mM KAC, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl2, 2 mM EGTA en 150 mM sucrose) wordt bereid met RNase-vrije reagentia en opgeslagen bij -20 ° C. Een werkoplossing (1x CHO buffer) wordt bereid door verdunning van de oplossing met RNase-vrij water en kan worden opgeslagen bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Digitonine Extractie <ol><li> Voorbereiden Extraction Solutions <ol><li> Een verwarmingsblok met een vlak oppervlak voorverwarmd tot 40 ° C en op deze temperatuur gedurende de extractie. </li><li> Om een ​​vlak werkoppervlak dat RNase vrij te vormen, wordt de verwarming blok bevochtigd met wat water en bedekt met een vers stukje Parafilm M (Bemis Company, Inc). Luchtbellen tussen de parafilm vel en verwarming blok worden gladgestreken met RNase-vrij handschoenen en kimwipes (VWR). </li><li> 1x CHO buffer wordt opgewarmd tot 37 ° C door incubatie in een waterbad. </li><li> 6-well platen worden gebruikt om wassenen bevestig de cellen. Elke rij 3 putten wordt gebruikt voor een cover-slip. Om de eerste twee putten in de rij, wordt 2 ml van een warmgelopen CHO-buffer toegevoegd. De laatste put, 2 ml van het fixatie-oplossing (PBS + 4% paraformaldehyde (Electron Microscope Sciences)) toegevoegd. Deze cassette kan worden opgeslagen in de 37 ° C incubator totdat de cellen klaar zijn voor extractie. </li><li> Digitonine extractie-oplossing wordt bereid door verdunning van de oplossing digitonine 0,025% met warm CHO buffer vlak voor gebruik. Ook hier is voor puromycine-behandelde cellen was de extractiebuffer aanvullend moet 20 mM EDTA bevatten efficiënt verstoren ribosomen 11. Dalingen van 100 pl van de extractie-oplossing worden op de parafilm bedekte verwarmingsblok onmiddellijk voor extractie. </li></ol></li><li> Digitonine Extractie en Cell Fixation <ol><li> Verwijder de cellen van de 37 ° C incubator. </li><li> Tijdens de extractie worden dekglaasjes gemanipuleerd met behulp van de forceps jewler. Metde tang pak de dekglaasje en dompel het in de eerste en vervolgens de tweede putje met CHO buffer te wassen van het groeimedium. </li><li> Snel blot overtollige buffer van de achterkant van het dekglaasje met een Kimwipe en meteen overgaan tot het dekglaasje, cel naar beneden, op de extractie-oplossing. </li><li> Na 10 sec, pak de dekglaasje met de tang en onmiddellijk overdragen, cel zijde naar boven, naar de put met de 4% paraformaldehyde bevestiging buffer. </li><li> Laat het monster in fixeermiddel incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Bereiding van controle cellen uitgepakte. Om de totale hoeveelheid mRNA in het cytoplasma is het een goed idee om een ​​uitgepakte controlemonster te bereiden bepalen. <ol><li> Cellen gekweekt op dekglaasjes worden bereid zoals hierboven (zie paragraaf 2.2), behalve dat de digitonine extractiestap (2.2.3) wordt overgeslagen. </li><li> Na fixatie, de niet-geëxtraheerde cellen moeten worden gepermeabiliseerde in PBS + 0,1% TritonX-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li></ol> 3. FISH Staining <ol><li> Ontwerpen van probes voor fluorescentie in situ hybridisatie <ol><li> De primaire sequentie van het mRNA van interesse wordt gevouwen met RNA secundaire structuur voorspelling software zoals RNAstructure 5,0 18. De mRNA vouwen visuele beoordeling van een gebied van ongeveer 50 nucleotiden die geen grote secundaire structuren te identificeren. </li><li> Het omgekeerde complement van dit gebied wordt gesynthetiseerd met Alexa546 fluorofoor aan het 5&#39;-uiteinde van de probe (verkregen van Integrated DNA Technologies). </li><li> De probe wordt verdund met RNase-vrij water tot een voorraad concentratie van 100 uM kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Kleuring met FISH probes <ol><li> Merk op dat hoewel de digitonine geëxtraheerd cellen geen verdere permeabilisatie deze gefixeerde monsters behandeling met 2 ml van 0,1% Triton X-100 in verdundPBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur vóór FISH kleuring en vermindert het achtergrondsignaal. </li><li> De slides worden vervolgens tweemaal gewassen met PBS om resten paraformaldehyde of Triton X-100 te verwijderen. </li><li> De cellen worden vervolgens tweemaal gewassen met 25% tot 60% formamide in 1X natriumcitraatbuffer (150 mM NaCl en 15 mM natriumcitraat). Algemeen, specifieke FISH probes die 50-60 nucleotiden lang, 60% formamide gebruikt, maar voor poly (A) mRNA kleuring met oligo (dT) FISH probe, het niveau van formamide verlaagd tot 25%. </li><li> De kleuring kamer bereiden, wordt de bodem van een 150 mm petrischaal die met water en een stuk parafilm wordt dreef op het water. Het water wordt verwijderd door de schaal op, waardoor de parafilm te houden aan de bodem van de schaal. Luchtbellen worden handmatig verwijderd met kimwipes. </li><li> Voor elke dekglaasje te worden gemerkt en pipetteer een 100 ul druppel van de hybridisatie oplossing die FISH probe van belang op de parafilm in de kamer kleuring. De stock FISH probe wordt verdund met 25% tot 60% formamide in hybridisatiebuffer (1x SSC, 100 mg / ml dextran sulfaat, 1 mg / ml gist tRNA, 5 mM vanadyl riboside complex, 25-60% formamide) tot een werkconcentratie van 0,2 uM. Merk op dat de hoeveelheid formamide worden geoptimaliseerd voor de specifieke probe wordt gebruikt en aanwezig is in dezelfde concentratie als in de SSC wasbuffer (zie stap 3.3.3). </li><li> Het dekglaasje geplaatst cel naar beneden op de FISH oplossing in de kamer kleuring en gedurende 5-24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde kamer zoals weefselkweekincubator. </li></ol></li><li> Wassen en het monteren van de gebrandschilderde monsters <ol><li> Om een ​​RNase vrij wasruimte voor te bereiden, voorzien in een strook van parafilm op een vlakke ondergrond, zoals een lab bank. Om ervoor te zorgen dat de parafilm is nat, laag het vlakke ondergrond, plaats de parafilm op de top en handmatig eventuele luchtbellen te verwijderen met kimwipes. </li><li> De kamer is kleuringverwijderd uit de incubator en geplaatst op een vlakke ondergrond. De dekglaasjes worden vervolgens gedreven door pipetteren ongeveer 500 ui wasbuffer FISH de rand van elke dekglaasje. De oplossing zal worden opgesteld in-tussen het dekglaasje en de parafilm via capillaire werking. </li><li> Voor elke dekglaasje, wordt 1 ml wasbuffer (1x SCC met 25-60% formamide, zie stap 3.3.3) gepipetteerd op de wasplaats parafilm (zie stap 3.4.1). </li><li> Behulp van een tang worden de dekglaasjes verwijderd uit de kamer en elke kleuring is geplaatst op de druppel wasbuffer en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Het wasproces wordt 3 keer herhaald. </li><li> Objectglaasjes worden gewassen met 70% ethanol en gedroogd met kimwipes. </li><li> Voor elke dekglaasje, wordt 25 ul van de montage-oplossing (DAPI Fluoromount G, Zuid-Biotech) gepipetteerd op de dia. Merk op dat deze oplossing 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dat vlekken DNA bevat en maakt visualisatie van de kernen. </li><li> Using forceps en kimwipes, kan de achterzijde van het dekglaasje gedroogd en dan FISH wasbuffer wordt uitgewist uit het monster zonder drogen. Elke dekglaasje wordt dan geplaatst cel kant naar beneden, op de daling van de montage-oplossing. </li><li> Hout monsters worden vervolgens geëtiketteerd en opslag bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Imaging en kwantificering <ol><li> Imaging <ol><li> Een epifluorescentiemicroscoop wordt gebruikt om het imago van de cellen na FISH kleuring. De getransfecteerde cellen kunnen worden onderscheiden van niet-getransfecteerde cellen door heldere fluorescentiesignaal in het juiste kanaal. Idealiter zal elk verkregen gebied bevatten ook een getransfecteerde cel worden gebruikt om de achtergrond fluorescentie voor kwantificering bepalen. </li><li> Voor elk veld beelden van de FISH en DAPI kanaal worden verworven. Bovendien, als de cellen gekleurd met co-proteïne markers wordt een beeld van de immunofluorescentie kanaal verworven. Merk op dat digitonine extractie ook kan worden gebruiktER gebonden ribosomen en eiwitten 11 visualiseren. </li><li> Dat de fluorescentie-intensiteiten tussen velden worden vergeleken, moeten de belichtingstijd voor elk kanaal constant voor elke set experiment. </li><li> Weer dat de fluorescerende intensiteit van cellen op verschillende coverslips kunnen worden vergeleken, moeten de dag-tot-dag veranderingen in intensiteit of epiluminescence verval in de FISH signaal geminimaliseerd door beeldvorming alle dekglaasjes in een keer. </li></ol></li><li> Kwantificering. Om de hoeveelheid mRNA dat is gelokaliseerd op de ER kwantificeren gebruiken we Nikon NIS Element software. Echter andere beeldanalyse software zoals ImageJ worden gebruikt. <ol><li> Met behulp van de Nikon NOS ELEMENT beeld analyse-instrument, zijn de cel periferie en de kern geschetst als aparte regio van belangen (ROI). </li><li> Voor elk ROI, de fluorescentie-intensiteit (I T de totale cel en intensiteit I N denucleaire intensiteit) en het gebied (A T en A N) worden geregistreerd en geëxporteerd naar een Excel-spreadsheet. </li><li> Voor elk beeld wordt de achtergrond fluorescentie-intensiteit (I B) bepaald door het registreren van de intensiteit van een niet-getransfecteerde cellen. Als poly (A) mRNA niveaus worden geanalyseerd, wordt een celvrij gebied geselecteerd. </li><li> De totale hoeveelheid ER (in geëxtraheerde cellen) of cytoplasmatische (in uitgepakte cellen) fluorescentie wordt berekend volgens de formule: [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li> De nucleaire kleurintensiteit kan ook worden berekend en gebruikt als controle tussen verschillende behandelingen. Omdat kernen worden niet beïnvloed door digitonine behandeling 17 of ribosoom verstoring 11, moet het bedrag van de nucleaire mRNA constant blijven tussen elk van deze behandelingen. Om de nucleaire fluorescentie wordt de volgende formule gebruikt te berekenen: [A N] [I N - IB] </li><li> Het percentage cytoplasmatische mRNA dat ER gerichte kan worden berekend door de gemiddelde fluorescentie ER van 30-40 geëxtraheerd cellen (zie 4.2.4) gedeeld door de gemiddelde fluorescentie cytoplasmatische 30-40 uitgepakte cellen (zie opnieuw 4.2.4) . Het is essentieel dat de gewonnen en uitgepakte cellen worden bereid, gekleurd en afgebeeld in parallel. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li>
<li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li>
<li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li>
<li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li>
<li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells%3A+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li>
<li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li>
<li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li>
<li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li>
<li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+poly+A%28%2B%29+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li>
<li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li>
<li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336(2012).</li>
<li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+ribosome+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li>
<li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li>
<li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-%284-methyl-2%2C6-dinitroanilino%29-N-methylpropionamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li>
<li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li>
<li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li>
<li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).</li>
<li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li>
<li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387(2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De lokalisatie van mRNAs verschillende subcellulaire locaties, door de interactie van mRNA transcripten met lokalisatie eiwitten, is een veel voorkomend verschijnsel belangrijk voor de juiste sortering van eiwitten naar hun eindbestemming, en voor de fijnafstelling van genexpressie aan de plaatselijke eisen van een subcellulaire regio 19,20. Met de assay hier beschreven we opnieuw de vraag of mRNA&#39;s die coderen voor secretie eiwitten kan worden gehandhaafd op de ER in de aanwe...

In eukaryoten mRNA codeert uitgescheiden en membraaneiwitten kunnen worden gericht op de ER co-translationeel de signaalherkenning deeltje 1,2 en kan worden gehandhaafd op het ER via de directe interacties tussen ribosomen en translocons tijdens de vertaling 3,4. Maar of mRNA&#39;s kan worden gericht en onderhouden op de ER onafhankelijk van een van beide ribosomen of vertaling is niet duidelijk tot voor kort. Eerdere studies geprobeerd om aan te pakken of er sprake is translatie-onafhankelijke mRNA samenwerking met de ER met behulp van cellulaire fractionering technieken. Omdat agressieve chemische omstandigheden moesten ribosomen distantiëren van ER afgeleid blaasjes, die zouden kunnen verstoren de potentieel gevoelige mRNA-ER vereniging, deze studies waren niet overtuigend, waaruit blijkt voor 5-8 en tegen 9,10 ribosomaal-onafhankelijke verankering van mRNA naar de ER . Om deze problemen te omzeilen hebben wij een protocol te isoleren en beeld ER-gebonden mRNA&#39;s. Deze procedure omvat een mild extractiebehandeling, die effectief verwijdert alle cytoplasmatische inhoud van de cel (inclusief niet-ER gebonden mRNAs) tegelijkertijd behoud van de morfologie ER en alle geassocieerde moleculen. Met dit protocol hebben we aangetoond dat een subset van mRNA gericht en onderhouden op ER onafhankelijk van ribosomen of translatie 11.

visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mrna&#39;s in zoogdiercellen

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryoten meeste messenger RNA (mRNA) die coderen uitgescheiden en membraan eiwitten gelokaliseerd op het oppervlak van het endoplasmatisch reticulum (ER). Echter, de visualisatie van deze mRNA&#39;s een hele uitdaging. Dit geldt vooral wanneer slechts een fractie van de mRNA ER-geassocieerde en de distributie van dit organel wordt belemmerd door ongerichte (dwz &quot;vrij&quot;) transcripten. Om ER-geassocieerde mRNA controleren, hebben wij een methode waarbij cellen worden behandeld met een korte blootstelling aan een digitonine extractieoplossing die selectief permeabilizes het plasmamembraan is waardoor het cytoplasmatische inhoud, terwijl ze tegelijkertijd de integriteit van de ER . Wanneer deze methode wordt gekoppeld met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), kan men duidelijk zichtbaar ER gebonden mRNA&#39;s door fluorescentiemicroscopie. Met dit protocol de mate van ER-vereniging voor bulk poly (A) transcripts of specifieke mRNAs kan worden geëvalueerden zelfs gekwantificeerd. In het proces kan men gebruik maken van deze assay de aard van mRNA-ER interacties te onderzoeken.

Het percentage mRNA dat ER-geassocieerde, COS-7-cellen die waren getransfecteerd met plasmiden die de placentaire alkalische fosfatase (ALPP) of cytochroom P450-8B1 (CYP8B1) ofwel werden geëxtraheerd met digitonine en vervolgens gefixeerd of direct bevestigd die vast (zie figuur 1, vergelijk &quot;uitgepakte Ctrl&quot; naar &quot;extractie Ctrl&quot;). De niet-nucleaire fluorescentie werd gekwantificeerd in beide monsters en de fractie van ER-geassocieerde mRNA werd berekend (F...

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie met bulk-poly (A) mRNA of specifieke transcripten detecteren.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Het doel van deze procedure is om messenger RNA te visualiseren dat geassocieerd is met het endoplasmatisch reticulum of er. Dit wordt bereikt door eerst zoogdierweefselkweekcellen op dekglasjes te plateren. De tweede stap van de procedure is om de cellen te behandelen met extractiebuffer om cytoplasmatisch mRNA te verwijderen dat niet aan de er is gebonden.De volgende stappen zijn om de cellen snel te fixeren en het mRNA te kleuren door middel van fluorescente in situ hybridisatie. De laatste stappen zijn om de hoeveelheid fluoresceine die met de er is geassocieerd, te beeldvormen en vervolgens te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen de resultaten laten zien hoe mRNA's geassocieerd zijn met het oppervlak van dit orgaan onder verschillende omstandigheden.Deze methode kan helpen om belangrijke biologische vraagstukken te beantwoorden, zoals of mRNA's die secretoire eiwitten coderen, onafhankelijk van ribosomen of eiwitsynthese, op het oppervlak van de er kunnen worden gehandhaafd. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het een paar lastige cellulaire manipulatie stappen omvat. Zaai de weefselkweekcellen op met zuur behandelde dekglasjes gedurende ten minste één dag vo

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

In situ subcellulaire fractionatie van zoogdiercellen op microscoop dekglaasjes kan de visualisatie van eiwit lokalisatie.

In situ subcellulaire fractionering van het aanklevende en niet-klevende zoogdiercellen

Hier beschrijven we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescerende...

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Isolatie van mRNA&#39;s geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Leer mRNA-visualisatie bij het endoplasmatisch reticulum in zoogdiercellen met fluorescentie in situ hybridisatie. Deze methode onthult hoe transcripten lokaliseren en reguleren.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA's in zoogdiercellen

Meer video's verkennen