Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA's in zoogdiercellen

Het doel van deze procedure is om messenger RNA te visualiseren dat geassocieerd is met het endoplasmatisch reticulum of er. Dit wordt bereikt door eerst zoogdierweefselkweekcellen op dekglasjes te plateren. De tweede stap van de procedure is om de cellen te behandelen met extractiebuffer om cytoplasmatisch mRNA te verwijderen dat niet aan de er is gebonden.

De volgende stappen zijn om de cellen snel te fixeren en het mRNA te kleuren door middel van fluorescente in situ hybridisatie. De laatste stappen zijn om de hoeveelheid fluoresceine die met de er is geassocieerd, te beeldvormen en vervolgens te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen de resultaten laten zien hoe mRNA's geassocieerd zijn met het oppervlak van dit orgaan onder verschillende omstandigheden.

Deze methode kan helpen om belangrijke biologische vraagstukken te beantwoorden, zoals of mRNA's die secretoire eiwitten coderen, onafhankelijk van ribosomen of eiwitsynthese, op het oppervlak van de er kunnen worden gehandhaafd. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het een paar lastige cellulaire manipulatie stappen omvat. Zaai de weefselkweekcellen op met zuur behandelde dekglasjes gedurende ten minste één dag voorafgaand aan het experiment, kosten zeven en vanwege OS-cellen zijn beide geschikte keuzes omdat ze een hoge gesecreteerde eiwitproductie en goed gedefinieerde ER's hebben.

Als er een exogeen Mr NA wordt onderzocht, transfecteer dan de cellen één dag na het zaaien en incubeer de cellen vervolgens gedurende nog eens 18 uur om MR.NA expressie mogelijk te maken. Op de dag van het experiment. Om een hoge extractie-efficiëntie te bereiken, mogen de cellen niet meer dan 80% confluency op het dekglasje overschrijden om te detecteren of mRNA's onafhankelijk van translatie met de ER interageren, kunnen cellen worden behandeld met agentia die de interactie tussen ribosomen en mRNA bij deze agentia verstoren of controlemedia naar de cellen 30 minuten voorafgaand aan extractie.

In dit geval worden translationele inhibitoren, pure Mycin en Homo Harrington in of HHT gebruikt. Begin met het opwarmen van vers bereide extractieoplossing die dig tontine bevat en een werkbuffer van één XCHO tot 37 graden Celsius. Zet een verwarmingsblok op 40 graden Celsius en plaats een omgekeerd metalen blok erin om een vlak werkoppervlak te vormen.

Bevochtig het metalen blok met water, bedek het vervolgens met een vers stukje paraform en maak eventuele luchtbellen glad met RNA's vrije handschoenen en pluisvrije tissue. Vervolgens, voor elk paar dekglasjes, bereid een zesputjesplaat voor voor het wassen en fixeren van de cellen in vier putjes. Voeg twee milliliters opgewarmde CHO buffer toe aan de laatste twee putjes.

Voeg twee milliliters van de fixatieoplossing toe. Bewaar vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius tot het nodig is. Plaats op het verwarmingsblok een druppel van 100 microliter van de extractieoplossing voor elk dekglas van cellen dat moet worden verwerkt.

Nu, met behulp van een juwelierstang, pak een met cellen bedekt dekglas op en dompel het in de eerste en tweede putjes met CHO buffer. Dit wast het groeimedium weg. Wis snel het overtollige buffer van de achterkant van het dekglas.

En plaats het dekglas kortstondig met de celkant naar beneden op de extractieoplossing. Na 10 seconden, breng het dekglas met de celkant omhoog over naar de fixatiebuffer waar het minimaal 15 minuten moet blijven. De celextractiestap is essentieel om alle cyop plasty mRNA te verwijderen dat niet aan ER is gebonden.

Bovendien, bereid een controle dekglas voor waarbij de cellen worden gefixeerd zonder extractie. Stap na fixatie. Was deze niet geëxtraheerde controlecellen twee keer met PBS en permeer vervolgens in PBS en TRITTON X 100.

Hoewel het niet vereist is, moeten ook gedig-extracteerde cellen worden gewassen met dezelfde PBS en Triton-oplossing om achtergrondfluorescentie te verminderen nadat de cellen zijn gepermeeerd. Was de dia's twee keer met PBS om het fixeermiddel en het detergent te verwijderen. Was vervolgens de dia's twee keer met 60% fide in eenmalige natriumcitraatbuffer of SSC.

Echter, als er een oligo DT vissonde wordt gebruikt om alle cellen te kleuren, verlaag het niveau van fide naar 25% volgende, bereid de hybridisatiebuffer met de vissonde voor. Verdun de stock vissonde tot 0,2 micromolar in dezelfde concentratie van fide in hybridisatiebuffer. Bereid nu de kleurkamer voor.

Vul de bodem van een 150 millimeter Petrischaal met water. Drijf vervolgens een stukje paraform op het water en draai de schaal ondersteboven. De parafilm zal zich hechten aan de bodem van de schaal terwijl het water ontsnapt.

Als er luchtbellen zijn, verwijder ze met handschoenen en pluisvrij tissue voor elk dekglas pipet 100 microliters van de hybridisatieoplossing met de vissonde op de parafilm. Plaats nu het dekglas met de celkant naar beneden op de oplossing. Incubeer tenslotte de kamer gedurende vijf tot 24 uur in een warme bevochtigde kamer.

Voordat de viskleuring voorbij is, bereid een RNA's vrije wasruimte voor, wetter niveau vlakke oppervlak met water en bedek het met strips van param. Verwijder eventuele luchtbellen met handschoenen en lin vrij tissue. Wanneer het kleuren is voltooid, breng de kamer over naar de werkruimte voor elk dekglas Pipet een milliliter wasbuffer op de wasruimte.

Para film om de dekglasjes over te brengen, pipet eerst een halve milliliter viswasbuffer nabij de rand van elk dekglas. De vloeistof wordt door capillaire actie onder het dekglas getrokken. Vervolgens, met behulp van een pincet, verwijder de dekglasjes uit de kamer en plaats ze op de druppels wasbuffer.

En wacht vijf minuten. Herhaal deze wastechniek nog drie keer. Gebruik verse een milliliter druppels wasbuffer op de wasruimte.

Ondertussen, reinig glazen dia's met 70% ethanol en droog ze af met pluisvrij tissue. Breng vervolgens voor elk dekglas 25 microliters DPI montageoplossing aan op een dia Gebruik een pincet om een dekglas op te pakken en droog de achterkant ervan af met een pluisvrij