C. elegans Chemotaxis Assay
27 april 2013
Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons van Caenorhabditis elegans Is beschreven. Een chemotactische index (CI) werd gebruikt als een manier om de respons van wormen om bepaalde doelen nauwkeurig te evalueren, en dienen als een platform van vergelijking tussen stammen en verbindingen van belang.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de chemotactische respons van C elegance te kwantificeren met behulp van een eenvoudige en goedkope test. Dit wordt bereikt door gestagneerde wormen te isoleren en ze in het midden van een gemarkeerde plaat te plaatsen. Op gelijke afstand van alle test- en controleplaatsen, die op elke plaats zijn gedeponeerd, bevindt zich een compound van belang of een controlecompound, beide gecombineerd met een anestheticum dat de wormen zal stoppen terwijl ze naderen.
Na 60 minuten wordt de uiteindelijke verdeling van de wormen op de plaat geteld, en de verhouding van de locaties van de wormen wordt gebruikt om een testindex te geven. Uiteindelijk kan het kwantificeren van de aantrekkingskracht van zee-elegance op bepaalde verbindingen worden gebruikt om de gedragsconsequenties van onderliggende experimentele manipulaties te evalueren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het veel gunstige aspecten van zijn voorgangers bevat, terwijl het een grotere gebruiksgemak mogelijk maakt.
Deze test biedt inzicht in het gedrag van zee-elegance en is vooral nuttig in combinatie met neurogenetische manipulaties en andere neurobiologische tests. Begin met platen van vijf centimeter geladen met chemotaxis agar of NGM. Markeer de onderkant van de platen in vier gelijke kwadranten.
Bereid ten minste drie platen voor ten minste drie proeven per te testen genetische stam en per geteste conditie. Markeer vervolgens een cirkel met een straal van 0,5 centimeter rond de oorsprong. Markeer vervolgens punten in de tegenovergestelde kwadranten met een T voor test of een C voor controle, ervoor zorgen dat de sites op gelijke afstand van de oorsprong en van elkaar staan.
De punten moeten minimaal twee centimeter van de oorsprong verwijderd zijn voor deze test. Zorg voor bereide jonge volwassen wormen in gesynchroniseerde ontwikkeling op vijf centimeter chemotaxis platen. Wormen die zich in verschillende ontwikkelingsstadia bevinden, kunnen anders reageren op de analyten.
Als gevolg hiervan is het erg belangrijk dat alle wormen die in de test worden gebruikt zich in dezelfde ontwikkelingsfase bevinden. Zodra de wormen een grasveld van OP 50 e coli hebben opgeruimd, pipet twee milliliters S basaal buffer op de plaat. Manipuleer de plaat om alle wormen in de buffer te krijgen om de wormen te wassen.
Pipet een milliliter van de wormen in buffer in een microcentrifugebuis en centrifugeer ze gedurende 10 seconden. Gebruik een pico fuge bij 6.600 RPM, aspireer de basilicum, waarbij het pellet van wormen ongestoord blijft. Was deze wormen nu nog drie keer met dezelfde methode.
Begin door de S basilicumbuffer toe te voegen aan de buis en de buis om te draaien om de wormen weer in oplossing te brengen. Na de laatste wasbeurt, centrifugeer de wormen nog eens 10 seconden en aspireer vervolgens het supernatant tot een eindvolume van 100 microliter. Zorg vervolgens voor een voldoende dichtheid van wormen door twee microliter van de gewassen wormen van het pellet op een NGM-plaat te pipetten.
Er moeten minimaal 50 wormen zijn, maar niet veel meer dan 250 wormen. Als er te veel wormen zijn, verhoog dan het volume van de ESP basilicumoplossing. En als er te weinig wormen zijn, centrifugeer ze dan en suspendeer ze opnieuw in een lager volume.
Plaats de wormbuis in een afzuigkap. Eenmaal voorbereid, zijn de wormen tot een uur te gebruiken in de chemotaxistest. Bereid eerst de oplossingen voor.
Meng de testoplossing door gelijke volumes van de testverbinding te combineren met het anestheticum 0,5 molaire azide. Meng vervolgens een controleoplossing van het oplosmiddel dat wordt gebruikt om de testverbinding te verdunnen met 0,5 molair natriumazide. Bereid nu een testplaat voor.
Pipet eerst twee microliter wormoplossing van het pellet op de oorsprong van een testplaat. Tweede, voeg de geurstoffen toe: pipet twee microliter van de testoplossing op de twee T-sites en pipet twee microliter van de controleoplossing op de twee C-sites. Zodra de wormen en geurdruppels in de agar zijn opgenomen, vervang de deksels, draai de platen om en laat 60 minuten voor de testtijd.
Voor de natrium-ASI-diffusietijd om gestandaardiseerd te zijn tussen proeven. Het is belangrijk dat de wormen direct voor de geurstoffen worden toegevoegd.
Ook moet elke plaat volledig zijn voorbereid en dat de test wordt gestart voordat de volgende plaat wordt voorbereid. Plaats de wormen na de 60 minuten proef in een koelkast van vier graden Celsius. Later, verwijder de plaat uit de koelkast wanneer deze kan worden geteld.
Ze niet onmiddellijk tellen en de wormen op kamertemperatuur laten, kan ze in staat stellen zich te mobiliseren. Opnieuw. Noteer de locatie van wormen die de binnenste cirkel volledig hebben overgestoken uit de gegevens. Bereken de chemotaxisindex.
De waarde varieert van negatief één tot positief één, wat maximale afstoting tot maximale aantrekking vertegenwoordigt. Herhaal het proces met behulp van de controleoplossing in zowel de test- als controlekwadranten. Dit zal dienen als de controleplak.Drie.
Dergelijke platen moeten worden gemaakt en uitgevoerd voor elke experimentele conditie. Diacetyl. Een bekende C elegance chemo atractant werd gebruikt om wilde type wormen te vergelijken met mutanten die het receptor voor diacetyl missen. Zoals verwacht, veroorzaakte diacetyl een significante chemo aantrekkende reactie van wilde type wormen.
In tegenstelling, de ODR 10 mutanten werden niet meer aangetrokken tot diacetyl dan tot de controleverbinding ethanol Eenmaal onder de knie. Deze techniek kan in minder dan 90 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de chemotactische respons van zee-elegance op analyt-oplossingen efficiënt kunt evalueren.
Zorg er speciaal voor dat alle geteste wormen een gesynchroniseerd ontwikkelingsstadium bereiken en dat voldoende wormen worden gebruikt. Elke proef.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het kwantitatief evalueren van de chemotactische respons van Caenorhabditis elegans met behulp van een eenvoudige en kosteneffectieve test. De aanpak omvat het meten van de verdeling van wormen als reactie op verschillende verbindingen, waardoor een chemotactisch index voor vergelijking wordt verkregen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Experimentele tests
Achtergrond
- Caenorhabditis elegans is een modelorganisme dat wordt gebruikt om gedragsreacties te bestuderen.
- Chemotaxis is een cruciaal gedrag dat kwantitatief kan worden beoordeeld.
- Vorige methoden ontbraken precisie en gebruiksgemak.
- Dit onderzoek beoogt bestaande technieken voor het evalueren van chemotactische reacties te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om de chemotactische respons van C. elegans op verschillende verbindingen te kwantificeren.
- Om een betrouwbare chemotactische index voor vergelijking tussen verschillende stammen en verbindingen vast te stellen.
- Om de evaluatie van gedragsgevolgen van experimentele manipulaties te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van gestage wormen voor testen.
- Plaatsing van wormen in het midden van een gemarkeerde plaat.
- Gelijkafstandelijke plaatsing van test- en controleverbindingen in combinatie met anesthetica.
- Telling van de wormverdeling na 60 minuten om de chemotactische index te berekenen.
Belangrijkste resultaten
- De test kwantificeert effectief de aantrekkingskracht van wormen voor specifieke verbindingen.
- Resultaten leveren een duidelijke chemotactische index voor vergelijking.
- De methode toont gemak van gebruik vergeleken met eerdere technieken.
- Gedragsgevolgen van de reacties van de wormen kunnen op basis van de resultaten worden geëvalueerd.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een betrouwbare manier om chemotactisch gedrag in C. elegans te beoordelen.
- Deze aanpak kan het begrip van gedragsreacties in verschillende experimentele contexten verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen op deze methode voortbouwen om aanvullende verbindingen en omstandigheden te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying chemotactic responses in model organisms enables early-stage target validation by linking genetic or pharmacological manipulations to measurable behavioral outputs. This assay supports mechanistic de-risking in neuroscience discovery by providing a quantitative, reproducible readout for sensory pathway function. Its simplicity and scalability enhance predictive confidence in target engagement studies prior to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking gene function to sensory behavior in a whole-organism context.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative behavioral phenotyping.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by de-risking targets based on observable chemotactic phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs suitable for compound screening campaigns.
- Scalability: Four-quadrant design increases sample size and reduces bias, enabling reliable replicate testing.
- Workflow Integration: Allows unattended operation and endpoint scoring, improving throughput in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects genetic findings to behavioral outputs, supporting disease-relevant model validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway function through dose- and genotype-dependent chemotactic responses.
- Preclinical Alignment: Enables evaluation of behavioral consequences from target modulation in a genetically tractable system.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing a functional behavioral readout that informs target credibility.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying behavioral responses to compounds or genetic perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chemotactic indices that enable comparison across conditions and strains.
- Analytics: Generates a normalized chemotaxis index (−1 to +1) that facilitates data comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Links neurogenetic manipulations to phenotypic outcomes, supporting target-to-behavior translation.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, low-cost behavioral assay adaptable across multiple discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in behavioral phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized worm staging, plate preparation, and blinded scoring.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on functional behavioral data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying targets with strong phenotypic validation in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in worm handling, synchronization, and developmental staging.
- Depends on standard laboratory equipment including centrifuges, microcentrifuge tubes, and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of worm preparation and assay timing for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require adjustments to arena design and anesthetic compatibility.
- Practical limitations include sensitivity to worm density and developmental stage variability, which must be controlled.
