Name: Antigenen functionele rode bloedcellen die beschermd worden door de membraan enten van Compact Hypervertakte Polyglycerolen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer hoe je rode bloedcellen modificeert met hypervertakte polyglycerolen om oppervlakte-antigenen te beschermen. Deze methode gebruikt flowcytometrie en verbetert de functionaliteit voor bloedtransfusies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Canadese Blood Services (CBS) en de Canadese Institutes of Health Science (CIHR) Research Partnership Fund. De auteurs danken de LMB Macromolecule Hub op de UBC Centrum voor Bloed onderzoek voor het gebruik van hun onderzoeksfaciliteiten. De infrastructuur faciliteit wordt ondersteund door de Canada Foundation for Innovation (CFI) en de Michael Smith Foundation for Health Research (MSFHR). R. Chapanian is een ontvanger van (CIHR / CBS) postdoctorale mandaten in transfusie wetenschap en een ontvanger van MSFHR onderzoek stageplaats doctorale beurs. JN Kizhakkedathu is een ontvanger van MSFHR Career Investigator Scholar Award.

A. Hypervertakte Polyglycerol Modificatie (SS-HPG) <ol><li> Place gevriesdroogd HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) in een rondbodemkolf en overnacht drogen onder vacuüm bij 90 ° C. </li><li> Koel de kolf tot kamertemperatuur en los de gedroogde HPG in watervrije pyridine (3 ml). </li><li> Om ongeveer acht hydroxylgroepen functionaliseren van HPG met carboxylgroepen, voeg katalytische hoeveelheid dimethylaminopyridine (een druppel van 5 mg / ml oplossing in pyridine) HPG de oplossing. Aan dit mengsel toevoegen barnsteenzuuranhydride (0,0067 g, 0,0664 mmol) opgelost in 0,5 ml pyridine druppelsgewijs over 10 minuten. Roer het mengsel overnacht bij kamertemperatuur onder argon. </li><li> Precipiteren het mengsel in 40 ml koude aceton (4 ° C) in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeer met een Beckman J2-centrifuge bij 27.000 MC xg gedurende 15 minuten. Giet het supernatant en verwijder Rest aceton door spoelen met argon bij kamertemperatuur. </li><li> De carboxy activerenl groepen met succinimidyl succinaat (SS) groepen, los het carboxyl-gefunctionaliseerde HPG in 3 ml watervrij DMF. Voeg N-hydroxysuccinimide (0,0077 g, 0,0664 mmol) en N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (0,0084 g, 0,0664 mmol) aan de oplossing en HPG nacht roeren van het mengsel bij kamertemperatuur onder argon. </li><li> Zuiver het SS-HPG door neerslaan in koude aceton. </li><li> Verwijder de resterende aceton door spoelen met argon. </li><li> Bepaal de zuiverheid van gemodificeerde HPG en de mate van carboxyl en SS functionalisering door proton (1H) - NMR analyse. </li></ol> B. Hele bloedafname en scheiding van rode bloedcellen (RBC&#39;s) <ol><li> Verzamel volbloed (40% hematocriet, 3 ml) van gezonde donoren ingestemd in een citraat vacutainer buis. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 1000 citraat xg gedurende 4 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof die plasma en bloedplaatjes bevat en de tussenliggende buffy coat dat witte bloedcellen en platele bevatts met een Pasteur pipet. </li><li> Breng verpakt RBC (80% hematocriet, 1,2 ml) in een 12 ml Falcon centrifugebuis en voeg PBS buffer (8 ml, pH = 8,0) om RBC wassen. </li><li> Meng RBC door omkeren om een ​​uniforme cel te bekomen. </li><li> Centrifugeer de Falcon buis bij 1.000 xg gedurende 4 min, en verwijder het supernatant. </li><li> RBC wassen met PBS twee keer door stap 5 en 6. </li><li> Place verpakt-RBC (100 ui) in 1,6 ml Eppendorf buisje en PBS buffer (300 ul, pH = 8,0) tot 20% hematocriet RBCs verkrijgen voegen. </li></ol> C. HPG Enten op RBC <ol><li> Onmiddellijk na precipitatie van gemodificeerde HPG in aceton in stap A6, place SS-HPG (150 mg) in een glazen buisje (1 dram), en oplossen in PBS buffer (300 pl, pH = 8,0). </li><li> Voeg SS-HPG polymeeroplossing in 20% hematocriet gewassen RBC tot een eindvolume van 400 pl en SS-HPG concentratie die varieert van 0,5 mm tot 3 mm te verkrijgen. Bijvoorbeeld om RBC behandeld met 0,5 mM bereiden SS-HPG verwijderen 36 pi PBS uit de gewassen RBC en plaats 36 ui SS-HPG polymeeroplossing. </li><li> Vortex de suspensie voorzichtig en plaats de Eppendorf buizen op een orbitale schudder bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Centrifugeer de Eppendorf buizen bij 1.000 xg gedurende 4 min, en pipetteer de supernatant. </li><li> Voeg 1 ml PBS toe RBC wassen, centrifugeren en het supernatant te verwijderen. </li><li> Voeg 1 ml zoutoplossing en was RBC twee keer zoals in stap 5. </li><li> Voeg 300 ul van zoutoplossing tot 100 pi van verpakte erytrocyten (80% hematocriet) tot een eindconcentratie van 20% hematocriet. </li></ol> D. Karakterisatie van HPG Gewijzigd RBC I. Complement gemedieerde lysis <ol><li> Verzamel ongeveer 8 ml volledig bloed van gezonde donoren in BD vacutainer glazen buis serum en laat het bloed te stollen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 2000 xg gedurende 10 min en verzamel ongeveer 3 ml serum. </li><li> Een milliliter van de serum werd in een waterbad van 60 ° C gedurende 30 min warmte geïnactiveerd serum bereiden. </li><li> Voeg 60 pl vers serum of warmte geïnactiveerd serum in een Eppendorf buis die 60 pl 20% hematocriet HPG gemodificeerde of ongemodificeerde RBC RBC bevatten. </li><li> Incubeer RBC gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Om de hoeveelheid hemoglobine in de celsuspensie, plaats 5,9 pi van 20% hematocriet van HPG gewijzigd RBC&#39;s of niet-gemodificeerde cellen in drievoud in 96 well plaat te kwantificeren. Voeg 294 pl reagens Drabkin&#39;s (een reagens dat wordt gebruikt om de hoeveelheid hemoglobine spectrophotomerically kwantificeren). Meng cellen met reagens Drabkin&#39;s door pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglobine cyanoderivative bij 540 nm met behulp van SPECTRA MAX 190 plaatlezer. </li><li> De hoeveelheid hemoglobine in het supernatant kwantificeren, cellen gecentrifugeerd bij 13.000 xg gedurende 1 minuut. Plaats 50 pl supernatant in drievoud in een plaat met 96 putjes. Voeg 250 ul van reagens Drabkin&#39;s. Mix cellen met reagens Drabkin&#39;sdoor pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglobine cyanoderivative bij 540 nm met behulp van SPECTRA MAX 190 plaatlezer. </li><li> Kwantificeer de hoeveelheid gelyseerde cellen uit de verhouding van hemoglobine in het supernatant (stap 7) en de totale hemoglobine in het monster (stap 6) 8, 11, 12. </li></ol> II. De camouflage van grote en kleine antigenen met behulp van MTS-kaarten <ol><li> Plaats 50 gl van HPG gemodificeerde RBC (10% hematocriet) in een Eppendorf buis centrifuge bij 1000 xg gedurende 1 min en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 110 ul van MTS verdunningsmiddel aan de celpellet en homogeniseer de celsuspensie door het pipetteren in en uit. </li><li> Voeg 11 ul celsuspensie aan elk mini-kolom. Vermijd het aanraken van de gel gedurende de toevoeging. </li><li> Zoek MTS kaarten in een centrifuge kaarthouder, en centrifugeer bij 156 xg gedurende 6 minuten. </li><li> Bescherming van oppervlakteantigenen wordt bepaald door de plaats van RBC in de mini gel column, gebaseerd op de productier beschrijving. </li></ol> III. Waterige tweefasensysteem partitie metingen <ol><li> Bereid Dextran 500 kDa / 8 kDa PEG twee fasescheiding systeem bestaande uit (5% dextran 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosfaat) volgens conclusie 13. </li><li> Centrifugeer bij 433 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om een ​​tweefasensysteem (dextran in de bodem) te verkrijgen. </li><li> Haal voorzichtig de twee fasen. </li><li> Aliquot 1,0 ml van de PEG bovenste fase in een gemerkte buis (met holle bodem), voorzichtig toevoegen van 20 pi 20% hematocriet HPG gewijzigd RBC en meng cellen door vegen. </li><li> Voeg 0,5 ml van de bovenste fase die cellen bevatten 0,5 ml van een onderste fase, en meng het systeem tikken. </li><li> Plaats de buis op de bank tot 2 minuten om het systeem te scheiden, en bepalen de locatie van cellen in het systeem. Lokalisatie van RBC (in de bovenste PEG fase, in de onderste dextranfase of beiden) functie de mate van modificatie en moleculairegewicht van de HPG. </li></ol> IV. Osmotische fragiliteit metingen <ol><li> Bereid NaCl met concentraties die variëren van 0 tot 0,9 (w / v)%. </li><li> Plaats 0,4 ml NaCl oplossingen in 1,5 ml Eppendorf buisjes. </li><li> Voeg 20 ul van erytrocyten (20% hematocriet) in de NaCl oplossingen. </li><li> Mix cellen zorgvuldig door omkeren en plaats ze in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Zorgvuldig te schorten cellen door inversie. Neem 50 pi van RBC schorsing en voeg deze toe aan een 1 reagens ml Drabkin&#39;s, geplaatst in een cuvet. Meng cellen met reagens Drabkin&#39;s door pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglobine cyanoderivative bij 540 nm met behulp van BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lezer. </li><li> De hoeveelheid hemoglobine in het supernatant kwantificeren, cellen gecentrifugeerd bij 1.000 xg gedurende 1 minuut. Voeg 200 ul supernatant aan 1 ml reagens Drabkin&#39;s in een cuvet. Meng cellen met reagens Drabkin&#39;s door pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglOBiN cyanoderivative bij 540 nm met behulp van BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lezer. </li><li> Bereken de hoeveelheid cellen gelyseerd in verschillende NaCl-oplossing uit de verhouding van de hoeveelheid hemoglobine in het supernatant (stap 6) de totale hoeveelheid hemoglobine in de celsuspensie (stap 5). </li></ol> V. Flowcytometrie metingen - Bescherming van Rhesus-D (RhD) antigeen <ol><li> Voeg 5 gl controle of HPG gemodificeerde RBC (20% hematocriet) in drievoud aan PBS buffer aangevuld met 0,5% BSA tot een totaal volume van 25 ul. </li><li> Voeg 25 ul FITC monoklonaal anti-rhesus D (RhD) gekocht bij Quotiënt Biodiagnostics (PA, USA). </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij 37 ° C in een waterbad. </li><li> Was het mengsel met 1,5 ml PBS buffer tweemaal. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min om de supernatant te verwijderen. </li><li> Suspend RBC in 1 ml zoutoplossing, en breng het mengsel op in 4 ml stroom BD flowcytometrie buis. </li><li> Analyseren met behulp van FACSCanto II flow cytometer, het verwerven van 5.000 evenementen op de RBC bediende poort, en het gebruik van hele evenementen voor analyse. </li></ol> VI. Flowcytometrie metingen - Expressie van CD47 <ol><li> Voeg 1,54 ui controle of HPG gemodificeerde RBC (20% hematocriet) in drievoud aan PBS buffer aangevuld met 0,5% BSA tot een totaal volume van 44 ul. </li><li> Voeg 6 pl fycoerythrine (PE) gelabeld muis anti-humaan CD47 gekocht bij BD Biosciences (NJ, USA). </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij 37 ° C in een waterbad. </li><li> Was het mengsel met 1,5 ml PBS buffer voor twee keer. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min om de supernatant te verwijderen. </li><li> Suspend RBC in 1 ml zoutoplossing, en passeren 26 G 5/8 naald naar cel klonteren te minimaliseren. </li><li> Spoel de suspensie in 4 ml stroom BD flowcytometrie buis. </li><li> Analyseren met behulp van FACSCanto II flowcytometer, het verwerven van 10.000 gebeurtenissen op de RBC controle poort. </li></ol>

<ol><li>Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+consequences+of+linker+chemistry+and+polymer+size+on+stealth+erythrocytes%3A+size+does+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).</li>
<li>Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+consequences+of+antigenic+modulation+of+red+blood+cells+with+methoxypoly%28ethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol.</a> Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).</li>
<li>Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+camouflage+of+antigenic+determinants%3A+Stealth+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).</li>
<li>Daniels, G., Reid, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+groups%3A+the+past+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Blood groups: the past 50 years.</a> Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).</li>
<li>Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+cells%3A+Prevention+of+major+histocompatibility+complex+class+II-mediated+T-cell+activation+by+cell+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification.</a> Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).</li>
<li>Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biological+evaluation+of+high+molecular+weight+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).</li>
<li>Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+testing+of+branched+and+linear+polyglycidol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol.</a> Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+circulation%2C+clearance%2C+and+biodistribution+of+polyglycerol+grafted+functional+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polymer+architecture+on+antigens+Camouflage%2C+CD47+protection+and+complement+mediated+lysis+of+surface+grafted+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell+surface+polymer+grafting+in+concentrated+and+nonreactive+aqueous+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+membrane+grafting+of+multi-functional+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+complement+activity+assay+in+microtitration+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hemolytic complement activity assay in microtitration plates.</a> J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).</li>
<li>Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalter%2C+H+%22Partitioning+in+aqueous+two-phase+systems%3A+theory%2C+methods%2C+uses%2C+and+applications+to+biotechnology%22">Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology</a>. , Academic Press Inc. London. (1985).</li>
<li>Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte-based drug delivery.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).</li>
<li>Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+properties+other+than+charge+involved+in+cell+separation+by+partition+in+polymer%2C+aqueous+2-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems.</a> Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+complement-mediated+elimination+of+red+blood+cells+modified+with+biotin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin.</a> Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Universele donor RBC hebben een groot potentieel bij het verbeteren van het bloed beschikbaarheid en veiligheid van bloed transfusie therapie. RBC worden ook beschouwd als veelbelovend drug delivery voertuigen vanwege hun lange omloop en die inherent zijn biocompatibiliteit 14, 15. Experimenten die in dit paper evalueren van de in vitro eigenschappen van HPG gewijzigd RBC. De in vitro eigenschappen en in vivo circulatie van HPG gemodificeerde RBCs werden onderzocht in onze groep rec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Glycidol </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Trimethylolpropaan </td><td> Fluka </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Kaliummethylaat </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Watervrije pyridine </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> 4-Dimethylaminopyridine </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Barnsteenzuuranhydride </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Watervrij dimethylformamide </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N-hydroxysuccinimide </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> MTS-kaarten </td><td></td><td></td><td> Micro Typing System (MTS) kaarten (FL, USA) </td></tr><tr><td> Dextran 500 kDa </td><td> Pharmacia Fine Chemicals </td><td></td><td> (Zweden) </td></tr><tr><td> PEG 8 kDa </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> FITC monoklonaal anti-Rhesus-D-(RHD) </td><td> Quotient Biodiagnostics </td><td></td><td> (PA, USA) </td></tr><tr><td> PE monoklonaal anti-CD47 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> (NJ, USA) </td></tr><tr><td> Drabkin&#39;s reagens </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel. Chemicaliën en reagentia gebruikt voor het enten van HPG polymeren RBC membraan en hun analyse. </td></tr></tbody></table>

antigenen functionele rode bloedcellen die beschermd worden door de membraan enten van compact hypervertakte polyglycerolen

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Rode bloedcellen (RBC) transfusie is essentieel voor de behandeling van een aantal acute en chronische aandoeningen zoals thalassemie major en sikkelcelanemie 1-3. Door de aanwezigheid van vele antigenen op het oppervlak RBC (~ 308 bekende antigenen 4) patiënten in de chronische bloedtransfusie therapie te ontwikkelen antistoffen door de wedstrijd van miss minor antigenen op erytrocyten transfusie 4, 5. Enten van hydrofiele polymeren zoals polyethyleenglycol (PEG) en hypervertakte polyglycerol (HPG) vormt een laag op uitsluiting RBC membraan dat de interactie van antilichamen met oppervlakteantigenen voorkomt zonder dat de doorgang van kleine moleculen zoals zuurstof, glucose en ionen 3. Momenteel is er geen werkwijze beschikbaar voor het genereren van rode bloedcellen universele donorcellen mede door de ontmoedigende uitdaging door de aanwezigheid van grote aantal antigenen (eiwitten en koolhydraten zijn) op het oppervlak en de RBC dNTWIKKELING van dergelijke methoden zal een aanzienlijke verbetering transfusie veiligheid en drastisch verbeteren van de beschikbaarheid en het gebruik van RBC. In dit rapport worden de experimenten die worden gebruikt om antigen beschermde functionele RBC ontwikkelen door het membraan enten van HPG en hun karakterisatie gepresenteerd. HPGs zijn zeer biocompatibel compact polymeren 6, 7, en worden naar verwachting binnen de glycocalyx dat het lipide membraan 8, 9 en masker RBC oppervlakteantigenen 10, 11 omgeeft.

Camoufleren van Rhesus D antigeen en CD47 RBC oppervlakte-eiwit werden gekwantificeerd door flowcytometrie met fluorescent gelabelde monoklonale antilichamen en een representatief resultaat is weergegeven in figuur 1. Bij HPG-geënte RBC (grijs) de intensiteit van het signaal af (piek verschoven naar links) vergeleken met de controle RBC (rode en groen) voor een vermindering van binding aan antilichamen celoppervlak die het maskeren van manteleiwitten dan . <p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

Het celmembraan modificatie van rode bloedcellen (RBC&#39;s) met hypervertakte polyglycerol (HPG) wordt getoond. Gewijzigd RBC werden gekenmerkt door waterige twee fase partitionering, osmotische fragiliteit en complement gemedieerde lysis. De camouflage van de oppervlakte-eiwitten en antigenen werd geëvalueerd met behulp van de flowcytometrie en Micro Typing System (MTS) bloed fenotypering kaarten.

Antigenen functionele rode bloedcellen die beschermd worden door de membraan enten van Compact Hypervertakte Polyglycerolen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Het doel van deze procedure is om antigen-beschermde functionele rode bloedcellen te bereiden. Dit wordt bereikt door eerst de HPG-polymeer in de tweede stap te bereiden. De HPG wordt gefunctionaliseerd door de toevoeging van succinylsuccinate groepen.Vervolgens wordt het volbloed van gezonde donoren gewassen met zoutoplossing om de rode bloedcellen te scheiden. In de laatste stap worden de geïsoleerde rode bloedcellen behandeld met de functionele HPG. Uiteindelijk wordt de bescherming van de oppervlakte-antigenen op de gemodificeerde cellen door de functionele HPG bepaald door middel van flowcytometrie.Het belangrijkste voordeel van onze techniek in vergelijking met bestaande methoden is dat HPG-conjugaties functionele rode bloedcellen opleveren die normaal circuleren. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot chronische bloedtransfusie. Aangezien HPG-gemodificeerde rode bloedcellen een verminderde antigeniteit en normale circulatie in vivo hebben.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Ian, een postdoctoraal medewerker en technicus in mijn laboratorium. Drie dagen voor het verzamelen van volbloed van toestemming hebbende gezonde donoren, wordt droog lyofilisaat HPG in een rondbodemkolf overnacht bewaard en onder vacuüm op 90 graden Celsius. De volgende ochtend wordt de kolf uit het oliebad verwijderd en laat men het afkoelen tot kamertemperatuur en lost vervolgens het gedroogde HPG op in twee milliliter anhydrisch pyridine. Vervolgens voegt men een katalytische hoeveelheid dimethylaminopyridine toe aan de HPG-oplossing om ongeveer acht van de hydroxylgroepen op de HPG te functionaliseren met carboxylgroepen.Gedurende de volgende 10 minuten voegt men SiCa-hydride opgelost in 0,5 milliliter, druppelsgewijs toe aan de oplossing en roert vervolgens het mengsel een nacht lang bij kamertemperatuur onder argon. De volgende dag bezinkt men het HPG-mengsel in 40 milliliter vier graden Celsius. Aceton in een 50 milliliter centrifugeerbuis gedurende 15 minuten bij 27.000 keer G bij vier graden Celsius. Giet vervolgens het supernatant af en spoel het bezinksel met argon bij kamertemperatuur om eventueel restant aceton te verwijderen.Om de carboxylgroepen te activeren met saksisch en miaal succinaatgroepen. Groepen lost men het carboxylgefunctioneerde HPG op in twee milliliter anhydrisch DMF. Voeg vervolgens NHS en Diop-profiel CARBIMIDE toe aan de HPG-oplossing en roer het mengsel een nacht lang bij kamertemperatuur onder argon.De volgende ochtend gaat men verder met het zuiveren van de S-S-H-P-G door precipitatie in koud aceton. Daarna spoelt men met argon om eventueel restant aceton te verwijderen. Bepaal vervolgens de zuiverheid van de gemodificeerde HPG en de mate van carboxyl- en succinylsuccinaatfunctionalisering door middel van proton-NMR-analyse.Na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming, verzamelt men het bloed van de gezonde donor terwijl de zuiverheid van de S-S-H-P-G wordt geëvalueerd. Centrifugeer het donorvolbloed gedurende vier minuten bij 1000 keer G en kamertemperatuur. Gebruik een pasteurpipet om het supernatant en de buffy coat te verwijderen en breng vervolgens de gepakte rode bloedcellen over in een 15 milliliter conische centrifugeerbuis.Voeg PBS toe aan de cellen en meng vervolgens door omkeren om een uniforme celverdeling te verkrijgen. Centrifugeer vervolgens de cellen in PB S3 keer en verwijder het supernatant. Na elke wassing brengt u de pact RBC-pellet over in een 1,6 milliliter eend orph buis en voegt u 300 microliter PBS toe om het volume meteen na bevestiging van de zuiverheid van de gemodificeerde HPG op 400 microliter te brengen. Breng vervolgens 150 milligram van de S-S-H-P-G over in een Dr.Glass-vial.Na het wegen van het polymeer, voegt men 300 microliter PBS toe aan de S-S-H-P-G en vortext het om het polymeer op te lossen. Voeg vervolgens de S-S-H-P-G-polymeeroplossing toe aan de 20%gewassen rode bloedcellen. Vortex vervolgens voorzichtig de suspensie en plaats vervolgens de rode bloedcel-HPG-mengsel op een orbitale shaker bij kamertemperatuur.Na een uur, wast men de oplossing vier keer af met PBS en zoutoplossing en verwijdert men elke keer het supernatant. Voeg vervolgens 300 microliter zoutoplossing toe aan de laatste 100 microliter pallet gepakte rode bloedcellen tot een uiteindelijke 20%hematocrietconcentratie. Laat nu acht milliliter donorvolbloedcellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur stollen.Na het centrifugeren van de cellen, verzamelt men ongeveer drie milliliter van het serum en brengt men een milliliter van het serum over in een 60 graden Celsius waterbad. Om hitte-inactiveerd serum te bereiden. Voeg na 30 minuten 60 microliter vers serum en 60 microliter hitte-inactiveerd serum toe aan afzonderlijke eph-buisjes.Elk bevat 60 microliter van 20%hematocriet HPG-gemodificeerde rode bloedcellen. Voeg vervolgens 60 microliter van hetzelfde toe aan buisjes met hetzelfde volume ongemodificeerde rode bloedcellen en incubeer alle rode bloedmonsters gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Om de hoeveelheid hemoglobine in de celsuspensies te kwantificeren, plaatst u eerst 5,9 microliter van elk van de monsters in drievoudig in een 96-wellsplaat.Meng vervolgens elk monster met 294 microliter drab kins reagens en lees de absorptie van het hemoglobine sano-derivaat met een spectrofotometer bij 540 nanometer om de hoeveelheid hemoglobine in het supernatant te kwantificeren. Centrifugeer de rest van de celmonsters en plateer vervolgens 50 microliter van elk van het supernatant in drievoudig in een 96-wellsplaat. Na het mengen van de cellen met 250 microliter drab kins reagens, meet u de absorptie van het hemoglobine ano-derivaat zoals net voor deze stap is gedemonstreerd. Begin door 50 microliter HPG-gemodificeerde RBC met 10%hematocriet in een eend orph buis te centrifugeren.Na het weggooien van de S-superna

antigens-protected-functional-red-blood-cells-membrane-grafting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om allogeen-specifieke anergie induceren in humane perifere bloed mononucleaire cellen. De techniek kan klinisch worden toegepast op niet-alloreactieve donorcellen te genereren. Infusie van deze cellen zou kunnen verbeteren immuun reconstitutie en vermindering van toxiciteit na allogene hematopoietische stamceltransplantatie.

Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

Functie-Spacer-Lipid (FSL) constructies kan de oppervlakte-eigenschappen van levende cellen en virions worden gewijzigd zonder verlies van vitaliteit. De methode vereist slechts een eenvoudige aanraking van een FSL bouwen oplossing met een cel / virion en spontaan en stabiele ondergrond incorporatie optreedt.

FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid

Blootstelling van bloed aan polymere bloedgeleiders initieert de vreemde lichaamsreactie die is geassocieerd met klinische complicaties. Hier wordt de Chandler Loop Apparatus beschreven, een experimenteel hulpmiddel dat de bloedperfusie door deze geleiders nabootst. Het toevoegen van recombinant CD47 resulteert in verminderde aanwijzingen van de vreemde lichaamsreactie op deze geleiders.

Het gebruik van de Ex Vivo Chandler Loop Apparaat om Beoordeel de Biocompatibility Modified Polymer Blood Conduits

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.

Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

Dit protocol beschrijft de verwijdering en de zuivering van de longslagader endotheliale cellen (PAECs), die aan de ballontips van Swan-Ganz katheters, voldoen terwijl ze worden ingeklemd in de longslagader tijdens het rechterdeel van het hart catheterisatie en blijven aanhangend aan de leeggelopen ballon na verwijdering van het lichaam van de patiënt.

Oogst van de endotheliale cellen van de ballontips van Swan-Ganz katheters na het rechterdeel van het hart catheterisatie

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

We beschrijven een model van heterotopische buikharttransplantatie bij ratten, wat wijzigingen van de huidige strategieën impliceert, die leiden tot een vereenvoudigde chirurgische aanpak. Daarnaast beschrijven we een nieuw afstotingsmodel door in-ear injectie van vitale hartspiercellen, waardoor verdere transplantatie immunologische analyses bij ratten mogelijk zijn.

Een immunologisch model voor heterotopische hart- en hartspierceltransplantatie bij ratten

Leer hoe je rode bloedcellen modificeert met hypervertakte polyglycerolen om oppervlakte-antigenen te beschermen. Deze methode gebruikt flowcytometrie en verbetert de functionaliteit voor bloedtransfusies.

Antigenen functionele rode bloedcellen die beschermd worden door de membraan enten van Compact Hypervertakte Polyglycerolen

Meer video's verkennen