Name: Protein Transfectie van Mouse Lung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Leer een efficiënte eiwittransfectiemethode voor muizenlongen met een lipide-gebaseerd reagens en een ultrafijne microverstuiver. Deze techniek minimaliseert off-target effecten en verhoogt eiwitexpressie in longweefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (7R01HL098528-03) en FAMRI&#39;s Klinische Innovator Award.

1. Voorbereiding van Protein transfectiereagens <ol><li> Los het Pro-Ject Reagent door toevoeging van 250 ul methanol en chloroform aan de buis met de droge film. </li><li> Vortex gedurende 10-20 sec op topsnelheid. </li><li> Pipetteer 20 ul van Pro-Ject reagens in afzonderlijke microcentrifuge buisjes. </li><li> Damp het oplosmiddel door het plaatsen van de microcentrifuge buizen met de Pro-Ject reagens onder een laminaire stroming kap minimaal 6 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het moet volledig droog zijn. Als alternatief, droog de Pro-Ject reagens met een vacuümexsiccator. </li><li> Bewaar de flesjes bij -20 ° C. Ze zijn goed voor een jaar bij deze temperatuur. </li></ol> 2. Het toevoegen van eiwit aan Pro-Ject Reagens <ol><li> Pipetteer 50 ul PBS, dat 2,0 ug van het eiwit van belang, in een buis met 20 pl droog Pro-Ject transfectie reagens. </li><li> Na het toevoegen van het eiwit, meng de oplossing door vortexen bij lage snelheid fof 3-5 sec gevolgd door incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Intratracheaal Toediening van Protein <ol><li> Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine (100 mg / kg en 10 mg / kg). </li><li> Na sedatie is bereikt, worden muizen opgehangen aan de bovenste snijtanden behulp van een speciaal ontworpen platform (figuur 1). </li><li> Behulp van een tang en een paperclip als laryngoscoop wordt de orofarynx, teneinde tot de katheter kan worden ingebracht (figuur 2). De stembanden worden gevisualiseerd door een lichtbron tegen de trachea van de muis. </li><li> Het eiwit / ProJect reactiemengsel (50 pi) wordt geïnjecteerd door de trachea met behulp van een Penn Century Microsprayer. </li></ol>

<ol><li>Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+models+for+study+of+pulmonary+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic models for study of pulmonary development and disease.</a> Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).</li>
<li>D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+expression+in+the+lungs+of+transgenic+mice+causes+pulmonary+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema.</a> Cell. 71, 955-961 (1992).</li>
<li>Foronjy, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+expression+attenuates+cigarette+smoke-+or+elastase-generated+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice.</a> Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).</li>
<li>Foronjy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+divergent+roles+of+secreted+frizzled+related+protein-1+%28SFRP1%29+in+lung+morphogenesis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema.</a> Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).</li>
<li>Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+mouse+lung+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in mouse lung development and function.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).</li>
<li>Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+the+respiratory+epithelium+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse.</a> Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).</li>
<li>Morimoto, M., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rtTA+toxicity+limits+the+usefulness+of+the+SP-C-rtTA+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse.</a> Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Crystal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+an+adenovirus+containing+the+human+CFTR+cDNA+to+the+respiratory+tract+of+individuals+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis.</a> Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).</li>
<li>Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+gene+delivery+using+polymeric+nonviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors.</a> Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).</li>
<li>Liu, Q., Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+inflammatory+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors.</a> Gene Ther. 10, 935-940 (2003).</li>
<li>Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+9-mediated+pulmonary+transgene+expression%3A+effect+of+mouse+strain%2C+animal+gender+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation.</a> Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulates+innate+immune+and+proteolytic+responses+to+cigarette+smoke+exposure+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung.</a> Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Phosphatase+2a+%28Pp2a%29+Regulates+Innate+Immune+and+Proteolytic+Responses+to+Cigarette+Smoke+Exposure+in+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung.</a> Toxicol. Sci. , (2012).</li>
<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het voordeel van deze techniek boven andere is dat het produceert toename in eiwit en de activiteit in het longweefsel zelf. Bovendien dringt het meest distale gebieden van de long in plaats blijven net binnen de luchtwegen. We hebben een verhoogde eiwit-activiteit van onze injectaat zelfs na lavaging de luchtwegen met een zoutoplossing 15 gemeten. Tissue activiteit analyses geven aan dat het eiwit cellen binnendringen en niet alleen blijven in de luchtruimten van de muis. Dit werd verder bevestigd door immun...

<table><tbody><tr><td>Pro-Ject</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>Microsprayer</td><td>Penn Century</td><td>FMJ-250</td><td></td></tr><tr><td>Beta-galactosidase</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>Beta-galactosidase antilichaam</td><td>Santa Cruz Bio</td><td>SC-19119</td><td></td></tr><tr><td>Muis serum albumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3139</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine/xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr></tbody></table>

protein transfectie van mouse lung

Protein Transfection of Mouse Lung

Verhogend eiwit expressie kunnen onderzoekers beter inzicht in de functionele rol van dat eiwit in het reguleren van de belangrijkste biologische processen 1. In de longen, dit is doorgaans bereikt door middel van genetische benaderingen transgene muizen 2,3 of virale of niet-virale vectoren die eiwitniveaus verhogen via verhoogde genexpressie 4 gebruiken. Transgene muizen zijn duur en tijdrovend te genereren en de willekeurige insertie van een transgen of chronische genexpressie kan normale longontwikkeling veranderen en hun uit bruikbaarheid van het model 5. Terwijl voorwaardelijke transgenen afwenden problemen met chronische genexpressie 6, omgekeerde tetracycline-gecontroleerde transactivator (rtTA) muizen, die worden gebruikt om voorwaardelijke expressie genereren, ontwikkelen spontaan luchtruim uitbreiding 7. Zoals bij transgene, het gebruik van virale en niet-virale vectoren is duur en 8 kunnen veroorzaken dosis-dependent ontstekingsreacties die beschamen resultaten 9 en expressie 10 belemmeren. Bovendien is de werkzaamheid van herhaalde doses worden beperkt door versterkte immuunreacties op de vector 11,12. Onderzoekers ontwikkelen adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren die minder ontstekingen veroorzaken en hebben meer expressie in de longen 13. Gebruik β-galactosidase, presenteren we een werkwijze voor het snel en effectief verhogen eiwitexpressie in de longen via een directe eiwit transfectietechniek. Dit protocol combineert een vaste hoeveelheid gezuiverd eiwit met 20 ul van een lipide-gebaseerde transfectie reagens (Pro-Ject, Pierce Bio) te laten binnendringen in het longweefsel zelf. De liposomale eiwitmengsel wordt vervolgens geïnjecteerd in de longen van de muizen via de trachea met een microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). De microsprayer genereert een fijne pluim van vloeibare aërosol in de longen. Met de techniekwe hebben aangetoond uniforme afzetting van het geïnjecteerde eiwit gedurende de luchtwegen en alveoli van muizen 14. De lipide transfectie techniek maakt gebruik van een kleine hoeveelheid eiwit effect. Dit beperkt de ontstekingsreactie die anders door eiwitrijk administratie zou worden uitgelokt. Inderdaad, deze techniek gepubliceerde we dat we konden PP2A activiteit in de long significant te verhogen zonder de long lavage cellulariteit 15. Long lavage cellulariteit genomen 24 uur na challenge was vergelijkbaar met de controles (27 ± 4 controle versus 31 ± 5 albumine getransfecteerde; N = 6 per groep). Bovendien verhoogt eiwitgehalte en zonder het long ontwikkelingsveranderingen of bouwkundige veranderingen die kunnen optreden in transgene modellen. Echter, de noodzaak voor herhaalde toedieningen deze techniek minder gunstig voor studies naar de effecten van langdurige toename in eiwitexpressie maken. Dit zou bijzonder true voor eiwitten met korte halfwaardetijden.

<html> Om de effectiviteit van onze techniek demonstreren we een microsprayer (Penn Century) de trachea van muizen te injecteren met 2 ug muizen albumine (Sigma) opgelost in 50 pl PBS dat 20 ul van Pro-Ject transfectie reagens bevatte. De albumine behandelde muizen vergeleken met muizen die werden behandeld op dezelfde wijze met 2 ug van beta-galactosidase eiwit (Pierce Bio). Na vierentwintig uur werden de muizen gedood en de longen werden verwerkt voor histologische analyse. Immunohistochemie voor beta-galactosidase wer...

Transgene muizen of virale vectoren zijn gebruikt om eiwitexpressie te verhogen in de longen. Echter, deze technieken zijn tijdrovend, technisch uitdagend en hebben off-target effecten die resultaten kan verwarren. Onze eiwit transfectie protocol gebruikt een lipide gebaseerde transfectiereagens en een ultrafijne microsprayer om actief eiwit uniform te leveren aan longcellen.

Protein Transfectie van Mouse Lung

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

Het algemene doel van deze procedure is om proteïne in de long van een muis te transfecteren. Dit wordt bereikt door eerst de proteïne van belang te suspenderen in een projecttransfectiereagens. Vervolgens wordt een muis geanestheseerd en op een speciaal platform voor injectie geplaatst.Een lichtbron wordt gebruikt om de invoering van de microsprayer in de trachea te vergemakkelijken. Ten slotte worden 50 µL vloeistof met het eiwit van belang geïnjecteerd. Uiteindelijk wordt deze eiwittransfectietechniek gebruikt om verhoogde eiwitniveaus in de longen van muizen aan te tonen.Hoewel deze methode is ontworpen voor gebruik bij chronisch obstructieve longziekte, kan deze ook worden toegepast bij andere ziektebeelden zoals astma of longfibrose. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel. Aangezien de stappen voor de intratracheale injectie moeilijk aan te leren zijn, is een correcte positionering van de luchtwegen van de muis en transilluminatie van de stembanden vereist.Begin met het voorbereiden van het proteïne-transfectiereagens. Voeg 250 µL methanol of chloroform toe aan de buis met het droge project.Film. Vortex vervolgens de buis gedurende 10 tot 20 seconden op maximale snelheid.Zodra het is opgelost, pipetteer 20 µL van het projectreagens in afzonderlijke microcentrifugebuisjes. Plaats deze buisjes onder een laminaire flowkast om het oplosmiddel gedurende minimaal zes uur te laten verdampen. Bij kamertemperatuur moeten de buisjes volledig droog zijn.Bewaar de buisjes bij -20 °C, waar ze gedurende één jaar stabiel blijven. Haal op de dag van transfectie een aliquot van het transfectiereagens op en voeg 50 µL PBS toe dat twee µg van het eiwit van interesse bevat. Meng de oplossing door drie tot vijf seconden op lage snelheid te vortexen en laat deze vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen voor gebruik.Wanneer het eiwit gereed is, wordt een muis geanestheseerd ter voorbereiding op intratracheale toediening. Voor de intratracheale injectie wordt een speciaal ontworpen platform gebruikt. Dit platform heeft een helling onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de basis en een metaaldraad die aan twee haken aan de bovenzijde hangt.Zodra de muis is geanestheseerd, wordt deze draad gebruikt om de muis aan de bovenste snijtanden op te hangen. Nadat de muis is vastgezet, plaatst u een lichtbron tegen de trachea om de visualisatie van de stembanden te vergemakkelijken met behulp van een pincet en een paperclip. Open de orofarynx als laryngoscoop en voer de katheter in.Bij het gebruik van de Micros-spuit is het belangrijk om voldoende kracht uit te oefenen bij het indrukken van de zuiger. Anders ontstaan er druppels in plaats van een fijne nevel, wat mogelijk kan leiden tot occlusie van de luchtwegen van de muis. Zodra alles is voorbereid, injecteert u 50 µL van het eiwitmengsel via de trachea met behulp van een Pen Century micro-spuit.In dit voorbeeld werden muizen intratracheaal geïnjecteerd met respectievelijk muisalbumine of bèta-galacto. 24 uur na proteïnetransfectie werd intense bèta-galacto-kleuring, hier aangeduid door de grote pijlen, gedetecteerd in de luchtwegen van de met bèta-galacto behandelde muizen, maar niet bij de met albumine behandelde muizen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 10 of 15 minuten worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een intratracheale injectie bij muizen uitvoert voor proteïnetransfectie.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a method to generate a mouse model of pleural dissemination by injecting lung cancer cell suspension into the thoracic cavity of an immunodeficient mouse.

Establishing a Mouse Model of Pleural Disseminated Lung Cancer

Primaire humane bronchiale epitheelcellen zijn moeilijk te transduceren. Dit protocol beschrijft de productie van lentivirussen en hun concentratie, evenals de optimale kweekcondities die nodig zijn om zeer efficiënte transductionen in deze cellen te bereiken tijdens differentiatie naar een pseudostratified epitheel.

Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van multifotonmicroscopie om longtermijn, hoog-resolutie, enkelcellimago van de intacte long in real time uit te voeren met behulp van een vacuüm gestabiliseerd beeldvormingsvenster.

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Hier beschrijven we een minimaal invasieve syngeneic orthotopic transplantatie model van muis Long adenocarcinoom cellen als een tijd - en kostenbesparende model om te studeren niet-kleincellige longkanker.

Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie

Dit protocol beschrijft de stappen die zijn genomen om KRAS longtumoren bij muizen te induceren, evenals de kwantificering van gevormde tumoren door echografie. Kleine tumoren worden gevisualiseerd in vroege tijdpunten als B-lijnen. Op latere tijdpunten worden relatieve tumorvolumemetingen bereikt door het meetinstrument in de echografiesoftware.

Detectie van longtumorprogressie bij muizen door echografie

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Dit protocol beschrijft een schaalbare intraductale CRISPR-screeningsbenadering die parallelle in vivo genknockout- en activatiestudies in de muismelkklier mogelijk maakt.

Parallelle in vivo screening van gen-knockout en activatie in de muismelkklier

Leer een efficiënte eiwittransfectiemethode voor muizenlongen met een lipide-gebaseerd reagens en een ultrafijne microverstuiver. Deze techniek minimaliseert off-target effecten en verhoogt eiwitexpressie in longweefsel.

Protein Transfectie van Mouse Lung

Meer video's verkennen