Name: Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Leer het inkapselen van pancreas β-cellen in PEG-peptide hydrogelen met thiol-ene fotopolymerisatie. Deze methode maakt gecontroleerde terugwinning van celaggregaten mogelijk voor biologische karakterisering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gefinancierd door NIH (R21EB013717) en IUPUI OVCR (RSFG). De auteur dankt mevrouw Han Shih voor haar technische bijstand.

A. macromeer en Peptide Synthesis <ol><li> Synthetiseren 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) en foto-initiator Lithium arylphosphanate (LAP) met behulp van vastgestelde protocollen. 18,19 </li><li> Synthetiseren bis-cysteine ​​bevattende chymotrypsine-gevoelige peptide CGGY ↓ C (pijl geeft chymotrypsine splitsingsplaats) onder toepassing van standaard vaste fase peptide synthese in een magnetron peptide synthesizer (CEM Discover SPS). <ol class="lalpha"><li> Bereken de hoeveelheid hars (Rink-amide MBHA hars) nodig gebaseerd op de vervanging verhouding van de hars en de synthese schaal. Zwellen de hars in dimethylformamide (DMF) in een reactievat (RV) gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder Fmoc-beschermende groep van de hars met een oplossing die ontscherming 20% ​​piperidine en 0,1 M HOBt in DMF. Gebruik de parameters in de tabel voor microgolven Fmoc-ontscherming (voor Fmoc-aminozuren): <table border="1"><tbody><tr><td> Synthese schaal </strong&gt; </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td></tr><tr><td> Vermogen </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatuur </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Tijd </td><td> 3 min </td><td> 3 min </td></tr></tbody></table></li><li> Na ontscherming, spoel de hars met DMF en voer ninhydrinetest de verwijdering van Fmoc (blootstelling van N-eindstandige amine) bevestigen. Hars moet blauw wordt na 2 min bij 95 ° C. </li><li> Na succesvolle ontscherming, paar eerste Fmoc-aminozuur op het C-terminus (synthese loopt van C-tot N-terminus) in een activator base-oplossing (0,28 M Diisopropylethylamine (DIEA) in DMF) met de parameters in de onderstaande tabel . <table border="1"><tbody><tr><td> Synthese schaal </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td&gt; </tr><tr><td> Vermogen </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatuur * </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Tijd * </td><td> 5 min </td><td> 5 min </td></tr></tbody></table> * Voor Cyste en Zijn, gebruik 50 ° C en 10 min naar racemisatie te verminderen. </li><li> Spoel de hars en voer ninhydrinetest kwalitatief bevestiging van de voltooiing van de koppeling (verdwijning van N-eindstandige amine). Hars moet duidelijk na 5 min bij 95 ° C. Herhaal koppelingsstap (A.2.d) als Ninhydrin test keert positief resultaat (blauwe kleur). </li><li> Herhaal deprotectie (stap A.2.b) en koppeling (stap A.2.d) voor aanvullende aminozuren in de sequentie eindigend met een laatste ontschermingsstap. </li><li> Afvoer van de RV, spoel hars met 25 ml dichloormethaan (DCM). Deze stap is te spoelen DMF, een basis en zal belemmeren peptide splitsing. </li><li> Bereid decollete cocktail door het mengen van 250 mg fenol in 4,75 ml trifluorazijnzuur (TFA), 0,125 ml triisopropylsilaan (TIS) en 0,125 ml ddH 2 O. </li><li> Voeg splitsing oplossing in de RV en splitsen gedurende 30 minuten in de magnetron peptide synthesizer (Power = 20 W; Temperatuur = 38 ° C). </li><li> Verzamel de peptide-oplossing in een 50 ml centrifugebuis met vacuüm mondstuk. </li><li> Gesplitste peptide neerslag in 40 ml ether, de vortex en centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 5 minuten om de peptide te verzamelen. </li><li> Giet het supernatant en herhaal stap A.2.k tweemaal. </li><li> Verzamel en droog peptide in vacuüm. </li><li> Zuiver het peptide met HPLC en gekenmerkt met massaspectrometrie. </li></ol></li></ol> B. Materiaal Voorbereiding en sterilisatie <ol><li> Bereid 20 gew% oplossing in PBS PEG4NB, vortex het mengsel tot het macromeer volledig is opgelost en steriliseer het macromeer behulp van een spuit filter. Sla de gesteriliseerde oplossing bij -20 ° C (aliquotsvoor langdurige opslag). </li><li> Bereiden en steriliseren 2 gew% fotoinitiator (LAP) oplossing in PBS. Bewaar de gesteriliseerde oplossing bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. </li><li> Los het peptide (CGGYC) in PBS, vortex het mengsel en de oplossing spuitfilter gesteriliseerd. Aliquot de peptide oplossing en bij -20 ° C tot gebruik (voorkomen vries-dooi cycli). </li><li> Bepaal thiol (-SH) concentratie in de bereide oplossing met peptide Ellman&#39;s reagens (aanwijzingen van de fabrikant protocol). Deze stap geeft accurate peptide concentratie (bijv. [SH] / 2) die nodig is voor de berekening van het peptide te gebruiken hoeveelheid in thiol-een foto-click reacties. </li><li> Bereid gelering mallen door het snijden van het bovenste gedeelte af van steriele 1 ml wegwerpspuiten met behulp van een scheermesje (open tip voor gel verwijderen). Steriliseer de spuit matrijzen autoclaaf. </li><li> Gebaseerd op de gewenste gelformulering (thiol om buteen ratio = 1) en concentraties stock matematerialen Bereken het vereiste volume polymeer, peptide crosslinker, fotoinitiator en vereist bufferoplossingen. </li></ol> C. Bereiding Cell <ol><li> Equilibreren celkweekmedium (hoog glucose DMEM dat 10% foetaal bovine serum, antibiotica antimycoticum met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 250 ng / ml Fungizone en 50 uM β-mercaptoethanol) balanced salt Hank&#39;s oplossing ( HBSS, Ca2 +, Mg2 + vrij) en trypsine-EDTA tot 37 ° C. </li><li> Verwijder kolven met MIN6 β-cellen van CO 2 incubator en zet de maatkolven in de laminaire stroming kap. </li><li> Zuig celcultuurmedia uit de kolven en spoel de cel met HBSS. </li><li> Trypsinize de cellen met 3 ml 2X (0,1%) trypsine-EDTA en de kolven gedurende 4 min incuberen bij 37 ° C en 5% CO2. <ul><li> Opmerking: Gebruik 2X trypsine-oplossing maakt het mogelijk volledige dissociatie van MIN6 β-cellen in enkele celsuspensie. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> Na incubatie werden de kolven voorzichtig op het oppervlak van de kap volledig verwijderen van de cellen. Bevestig de onthechting en dissociatie van de cellen met behulp van een microscoop. </li><li> Voeg gelijke volume van het celkweekmedium de trypsine te neutraliseren. Meng de oplossing door voorzichtig pipetteren en breng het mengsel op een canonieke en centrifugeer gedurende 5 min bij 1000 rpm. </li><li> Zuig het supernatant en voorzichtig de cellen opnieuw te suspenderen in 4 - 5 ml van de cultuur media. </li><li> Bepaal celdichtheid met 50% Trypan blue buffer in een hemocytometer. </li></ol> D. Hydrogel Fabricage en Cell Encapsulation <ol><li> Zodra de cellen klaar zijn, mix (op basis van een 1:1 thiol aan ONO-verhouding) de vereiste hoeveelheden PEG4NB, CGGYC, LAP, cel-oplossing, en HBSS in een microcentrifuge buis. </li><li> Meng de oplossing voorzichtig met een pipet een homogeen mengsel en 25 pl van de verkregen oplossing tot een spuit vorm toevoegen. Maak de spuit aan UV-licht (365nm, 5 mW / cm 2) gedurende 2 minuten. </li><li> Na fotopolymerisatie duik gels in een steriele 24 wells plaat met celcultuurmedium en hydrogels incuberen in 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Was de cel-beladen hydrogelen in celkweekmedium gedurende 30 minuten af ​​te spoelen losjes bevestigde cellen en niet-verknoopt macromeren. Breng de gel in vers medium. </li><li> Vernieuwen celcultuurmedia om de 2 tot 3 dagen. </li></ol> E. levensvatbaarheid van de cellen Assay Ingekapselde celmorfologie kan worden waargenomen met behulp van de lichtmicroscoop (sinds de gesynthetiseerde hydrogels transparant zijn). Levensvatbaarheid van de cellen kunnen worden gevisualiseerd en kwalitatief gemeten met behulp van Live / Dead kleuring en kwantitatief met behulp van AlamarBlue reagens. E.1. Live / Dead vlekken <ol><li> Ontdooi Live / Dead kleurstoffen bij kamertemperatuur. </li><li> In een canonieke buis toe PBS volgens het aantal samples (n) te worden gemerkt: <strong&gt; Totaal volume PBS = n × 500 pi </li><li> Pipetteer 0,25 pl Calcein AM en 2 pl EthD-1 per 1 ml PBS met de canonieke buis met PBS. Vortex de oplossing om de componenten te mengen. </li><li> Incubeer cellen beladen hydrogels in Live / Dead kleuroplossing (0,5 ml / monster) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat. </li><li> Met een Pasteur pipet verwijderen kleurstofoplossing en tweemaal spoelen van het monster met PBS. </li><li> Plaats monster op een dekglaasje of objectglaasje. Houd u aan het beeld cellen met behulp van een confocale microscoop. </li></ol> E.2. AlamarBlue Assay <ol><li> Bereid 10 v / v% AlamarBlue oplossing in celkweekmedium. </li><li> Verwijder hydrogelen van incubator en zuig de media uit elk putje zonder enig contact met de hydrogel. </li><li> Incubeer cellen beladen hydrogels en een lege put (negatieve controle) in 500 ui 10% AlamarBlue oplossing gedurende 16 uur. </li><li> Na incubatie pipet 200 piAlamarBlue van de oplossing in een plaat met 96 putjes en meet fluorescentie met behulp van een microplaatlezer (excitatie: 560 nm, emissie: 590 nm). <ul><li> Hogere cellulaire metabole activiteit vermindert de kleurstof hogere fluorescentie lezing te geven. </li><li> Zorg ervoor dat ten minste twee putjes van 10% AlamarBlue oplossing blanks zijn. Bij het analyseren van de data, trekt de gemiddelde fluorescentie blanco waarde van de fluorescentie lezing van de monsters. </li></ul></li></ol> F. Chymotrypsine gemedieerde Gel Erosie en Spheroid Recovery <ol><li> Bereid 1 mg / ml trypsine-vrije α-chymotrypsine oplossing HBBS en steriele filter de oplossing. </li><li> Incubeer hydrogels in chymotrypsine oplossing (500 ul per gel) bij kamertemperatuur onder zacht schudden totdat volledige gel erosie bereikt. <ul><li> Voor een 25 pi gel, de tijd voor volledige erosie ongeveer 5 minuten. </li></ul></li><li> Plaats de plaat op ijs gedurende enkele minuten om de activiteit van verminderingchymotrypsine. </li><li> Breng de celoplossing in 1 ml en centrifugeer bij 300 rpm, 4 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een weiland pipet en voorzichtig resuspendeer de sferoïden in HBSS. </li><li> Breng de herstelde bolvormige oplossing voor een 24-well plaat en plaats de plaat op ijs, zodat de bolletjes om te settelen. </li><li> Voor maat-analyse, verwerven fasecontrast beelden van de vaste sferoïden met behulp van een lichtmicroscoop. Meet hersteld sferoïde diameters met behulp van software zoals Nikon Element software of ImageJ. </li></ol> G. functionele test van Hersteld sferoïden G.1. Glucose gestimuleerde insuline secretie van de herstelde cel sferoïden <ol><li> In een plaat met 24 putjes, incubeer de gels in 500 ui 2 mM glucose laag trottoirbanden-Ringer buffer (KRB) gedurende 1 uur. </li><li> Eroderen de gel en herstellen cel sferoïden met stappen F.1 te F.6. </li><li> Zorgvuldig Zuig het supernatans zonder enigecontact met de cellen en resuspendeer de sferoïden sferoïden in 500 ui 2 mM glucose laag KRB. </li><li> Breng 100 pl van cel sferoïden oplossing voor een 0,6 ml buis en plaats het op het ijs voor intracellulaire ATP kwantificering. </li><li> Splitsen de resterende cel sferoïde oplossing helft (in twee microcentrifugebuizen) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 300 rpm en 4 ° C. </li><li> Zuig supernatant (bijna tot op de bodem) en resuspendeer de eerste helft van de cel sferoïden in 1 ml 25 mM hoge glucose KRB en de tweede helft in 1 ml van 2 mM lage glucose KRB. </li><li> Voorzichtig pipetteren en breng de oplossing die herstelde cel sferoïden om een ​​24-well plaat. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na incubatie, breng de oplossing een microcentrifuge en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1000 rpm en 4 ° C. </li><li> Breng 500 pi van het supernatant van gecentrifugeerde buis naar een andere microcentrifugebuis en bewaar bij 4 ° C voor insulineELISA. </li><li> Voer insuline ELISA volgende fabrikant protocol. </li></ol> G.2. CellTiter Glo Assay <ol><li> ATP normen: Bereid een 10 uM ATP oplossing en seriële verdunningen een reeks van 8 standaardoplossingen voeren. </li><li> Om een ​​witte plaat met 96 putjes, voeg 50 ul van de cel sferoïde (uit stap G.1.6) en normen. </li><li> Aan elk putje bevattende monsters en standaarden, voeg 50 ul CellTiter Glo reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Na incubatie meten van de luminescentie aantal monsters en standaarden met een microplaatlezer en kalibreren monster ATP-concentraties met een lineaire regressie kromme gegenereerd door de ATP normen. </li><li> Bepaal de totale ATP-concentratie in de steekproef en vermenigvuldig dit met het monster verdunningsfactor van de intracellulaire ATP-concentratie te krijgen in een cel-beladen hydrogel. </li></ol> G.3. Bepaal insulinesecretie <ol><li> Bereken de Amount van insuline afgescheiden van de gewonnen sferoïden door de verhouding van de hoeveelheid insuline afgescheiden in hoog glucose medium te hoeveelheid insuline afgescheiden in laag glucose medium. </li><li> Normaliseren gekwantificeerde insulinegehalte van cel Steroiden met respectieve hoeveelheid intracellulair ATP van de herstelde cel sferoïden. </li></ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Metters, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+controlled+release+formulations%3A+network+design+and+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling.</a> Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7, 830-838 (2011).</li>
<li>Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neutrophil+elastase+responsive+delivery+from+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+beta-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments.</a> Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+functionalized+PEG+hydrogels+promote+survival+and+function+of+encapsulated+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells.</a> Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+mimicry+with+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+enhancing+beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).</li>
<li>Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+inhibits+apoptosis+of+insulin-secreting+cells+via+a+cyclic+5%27-adenosine+monophosphate-dependent+protein+kinase+A-+and+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cell-matrix+interactions+on+encapsulated+beta-cell+function+within+hydrogels+functionalized+with+matrix-derived+adhesive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides.</a> Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).</li>
<li>Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+K-sensitive+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+degradation+in+response+to+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).</li>
<li>Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently-immobilized+vascular+endothelial+growth+factor+promotes+endothelial+cell+tubulogenesis+in+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+science.+Polymer%22%5BJournal%5D)">Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels.</a> Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).</li>
<li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels+with+biomolecules+to+regulate+and+guide+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).</li>
<li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).</li>
<li>Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-click+chemistry%3A+a+multifaceted+toolbox+for+small+molecule+and+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis.</a> Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005(2009).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+release+from+hydrolytically+degradable+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De beschreven protocol bevat details over eenvoudige inkapseling van cellen in thiol-hydrogelen gevormd door stap-groei fotopolymerisatie. Terwijl een stoichiometrische verhouding van 1:1 van norborneen met thiol functionele groepen werd in dit protocol kan de verhouding worden aangepast afhankelijk van de experimenten. Naast een juiste formulering is belangrijk om homogeniteit in de pre-polymeeroplossing. Met name het gebruik zacht pipetteren opdat cellen zijn goed verdeeld in de pre-polymeeroplossing om klonteren voor...

Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren uitzonderlijk potentieel steigers materialen voor reparatie en regenererende weefsels. 1-3 De hoge watergehalte van hydrogels maakt eenvoudige diffusie van zuurstof en uitwisseling van voedingsstoffen en cellulaire metabole producten, die cruciaal zijn voor handhaving van cellevensvatbaarheid. Bovendien hydrogelen uitstekende dragers voor gecontroleerde afgifte en cel productietijd wegens hun hoge tunability. Twee synthetische hydrogels zoals die bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) worden steeds meer gebruikt in tissue engineering toepassingen, voornamelijk vanwege hun cytocompatibility, weefsel- zoals elasticiteit en hoge tunability in materiaal fysische en mechanische eigenschappen. 4-6 Hoewel een veelgebruikte hydrogel-platform, hebben studies aangetoond dat PEG-diacrylaat (PEGDA) hydrogelen gevormd door ketting-groei photopolymerizations de neiging tot schade ingekapseld cellen Duri hebbenng netwerk en verknoping in situ cel inkapseling. 7 De celschade werd grotendeels toegeschreven aan radicalen gegenereerd door de foto-initiator moleculen, die door de vinylgroepen aan PEGDA propageren verknopen polymeerketens in hydrogels. Helaas zijn deze radicalen veroorzaken ook stress en cellulaire beschadiging tijdens cel inkapseling, vooral voor radicaal-gevoelige cellen zoals pancreatische β-cellen. 8-10 Om een hogere maaswijdte verkrijgen betere verspreiding en celoverleving, hogere molecuulgewichten PEGDA worden vaak gebruikt voor cel inkapseling. Dit is echter afbreuk polymerisatiekinetiek en veroorzaakt suboptimale gel biofysische eigenschappen. 7,11,12 Naast de bovengenoemde nadelen, is het zeer moeilijk om celstructuren herstellen van PEGDA hydrogels door de heterogeniteit en niet-afbreekbare aard de verknoopte netwerken. Terwijl protease-gevoelige peptiden kunnen worden opgenomenPEG macromeer in de ruggengraat anders inert PEGDA hydrogels gevoelig voor enzymatische splitsing maken, de conjugatie gebruikt vaak dure reagentia en de resulterende netwerken bevatten nog aanzienlijke heterogeniteit vanwege de aard van ketting-groei polymerisatie. 13-15 Onlangs hebben PEG-peptide hydrogelen gevormd via stap-groei thiol-fotopolymerisatie aangetoond preferentiële eigenschappen voor cel inkapseling vertonen dan hydrogels gevormd door chain groei fotopolymerisatie. 7 De superieure gelering kinetiek van thiol-hydrogels wordt toegeschreven aan de &#39;click &#39;aard van de reactie tussen thiol en buteen functionaliteiten. In vergelijking met ketting-groei polymerisatie van PEGDA, thiol-reactie is minder zuurstof geremd wat resulteert in een snellere gelering tarief. 16,17 thiol-hydrogels ook hogere polymerisatie efficiëntie en een betere gel biofysische eigenschappen in vergelijking met ketting-groei PEGDA hydrogels, 7 hebben , 18 &lt;/ Sup&gt; wat resulteert in beperkte cellulaire schade veroorzaakt door radicalen tijdens fotopolymerisatie. Voorheen thiol-hydrogelen gevormd door 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) macromeer en bis-cysteine ​​bevattende peptide crosslinkers, zoals protease-gevoelige peptiden zijn gebruikt voor cel inkapseling. 7,18 High tunability van PEG hydrogel netwerken biedt flexibel en controleerbaar 3D micro-omgeving voor onderzoek celoverleving en activiteit, terwijl het gebruik van protease-gevoelige peptide sequentie is een mild middel voor het terugwinnen van celpreparaten natuurlijk gevormd in hydrogels. In dit protocol gebruiken we stap-groei photopolymerized thiol-hydrogelen gefabriceerd met 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) en een chymotrypsine-gevoelige peptide crosslinker (CGGY ↓ C) voor het inkapselen van MIN6 β-cellen. Dit protocol uitgewerkt systematisch technieken voor het bestuderen van de overleving, proliferatie en bolvormige formatie van MIN6β-cellen in thiol-hydrogels. We Verder dient werkwijze voor β-cel sferoïde herstel en biologische karakterisering van teruggewonnen sferoïden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 4-arm PEG (20 kDa) </td><td> Jenkem Technology USA </td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-aminozuren </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Live / Dead levensvatbaarheid van de cellen kit </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Inclusief Calceïne AM en ethidiumhomodimeer-1 </td></tr><tr><td> AlamarBlue reagens </td><td> Abd Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo reagens </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Zonder Ca +2 en Mg +2 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> ZonderCa +2 en Mg +2 </td></tr><tr><td> High Glucose DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotica-Antimycoticum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-free α-chymotrypsine </td><td> Worthington Biochemical Corp </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Muis Inusin ELISA kit </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml wegwerpspuit </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en terugwinning van β-cel sferoïden van step-groei peg-peptide hydrogelen

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren die een driedimensionale micro met weefsel-achtige elasticiteit en hoge permeabiliteit voor het kweken van therapeutisch relevante cellen of weefsels te verschaffen. Hydrogelen bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) derivaten worden steeds meer gebruikt voor een verscheidenheid van tissue engineering toepassingen, mede dankzij hun afstembare en cytocompatible eigenschappen. In dit protocol, gebruikten we thiol-stap-groei photopolymerizations aan PEG-peptide hydrogels fabriceren voor het inkapselen pancreas MIN6 b-cellen. De gels werden gevormd door 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) macromeer en een chymotrypsine-gevoelige peptide crosslinker (CGGYC). De hydrofiele en aangroeiloze aard van PEG biedt cytocompatible micromilieu voor celoverleving en proliferatie in 3D, terwijl het gebruik van chymotrypsine-gevoelige peptidesequentie (C GGY ↓ C, pijl enzym klievingsplaats, terwijl klem cysteeine residuen werden toegevoegd voor thiol-crosslinking) maakt snel herstel van celpreparaten vormt binnen de hydrogel. De volgende protocol uitgewerkt technieken: (1) inkapseling van MIN6 β-cellen in thiol-hydrogels, (2) Kwalitatieve en kwantitatieve cellevensvatbaarheidsassays bepalen celoverleving en proliferatie (3) Herstel van cel Steroiden met chymotrypsine-gemedieerde gel erosie, en (4) Structurele en functionele analyse van de gerecupereerde sferoïden.

<html> Figuren 1-4 tonen representatieve resultaten voor inkapseling, overleving, proliferatie, vorming sferoïdaal en sferoïde herstel van thiol-hydrogels. Figuur 1 toont schematisch de reactie van (1) stap-groei thiol-fotopolymerisatie met PEG4NB en CGGYC en ( 2) chymotrypsine gemedieerde gel erosie die een erosie mechanisme volgt. figuren 2 en 3 aanwezig levensvatbaarheid resultaten met Live / Dead kleuring en AlamarBlue assay. We merken op dat cellen ...

Het volgende protocol biedt technieken voor het inkapselen van pancreatische β-cellen in stap-groei PEG-peptide hydrogels gevormd door thiol-een foto-click reacties. Dit materiaal platform niet alleen een cytocompatible micro voor cel inkapseling, maar maakt ook de gebruiker gecontroleerde snelle herstel van celstructuren gevormd binnen de hydrogels.

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Het algemene doel van deze procedure is om technieken te demonstreren voor het inkapselen van cellen in je fotopolymeriseerbare hydrogels, evenals de daaropvolgende herstel van natuurlijk gevormde bètacellen pH uit de enzymgevoelige hydrogels uit biologische karakterisering. Dit wordt bereikt door eerst de mins zes bètacellen te mengen met een voorarmspen, norbertine macer, en een enzymgevoelig peptideverbindingsmiddel. De cellen worden vervolgens ingekapseld met behulp van vrij radicaal gemedieerde thne fotopolymerisaties om een hydrogel te vormen.De tweede stap is om ingekapselde cellen in je hydrogels te kweken in een koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Nadat de cellen zijn geprolifereerd om aggregaten te vormen, worden de celgevulde hydrogels gespoeld met bufferoplossing en vervolgens geïncubeerd in chia trypsin-oplossing. Onder zacht schudden voor gelerosie, worden de herstelde aggregaten zorgvuldig gewassen om de enzymoplossing en het geërodeerde polymeer te verwijderen.Uiteindelijk kunnen deze celaggregaten worden gebruikt voor structurele en functionele analyse. Dus het grote voordeel van stapgroei thne fotochemie is dat de reactieomstandigheden milder zijn dan de traditionele ketengroei PEG dde. Daarom bieden de je hydrogels een uitstekende micro-omgeving voor veel celtypen, inclusief pancreas bètacellen.De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar verschillende cel-gebaseerde therapieën omdat dit DIN-systeem een uitstekende micro-omgeving biedt voor in vitro-experimenten en een geweldige platform voor celbezorging. Terwijl we de peptiden die in deze experimenten worden gebruikt in ons lab synthetiseren, zijn er veel bedrijven waaruit de peptide cross linkers die we hebben beschreven verkregen kunnen worden. Om deze procedure te starten, bereid een 20%PEG vier NB-oplossing in PBS voor en draai het mengsel tot de rimer volledig is opgelost.Laat vervolgens de Kermer-oplossing door een spuitfilter lopen om het te steriliseren en bewaar Eloqua bij min 20 graden Celsius tot het nodig is. Bereid vervolgens een 2%-oplossing van de foto-initiator lithium arol fosfonaat in PBS. Laat de foto-initiatoroplossing door een spuitfilter lopen en bewaar de gesteriliseerde oplossing bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.Een andere voorbereidende stap is om het chrysine gevoelige peptideverbindingsmiddel in PBS op te lossen en de oplossing door een spuitfilter te lopen voor sterilisatie. Extra aliquots worden bewaard bij min 20 graden Celsius. Bepaal de Sulf hydro groepconcentratie in de bereide peptidoplossing met behulp van elman's reagens volgens het protocol van de fabrikant.Bereid vervolgens de ation mallen voor door de bovenste centimeter van steriele wegwerpspuiten af te snijden. Gebruik een scheermes om de spuit mallen opnieuw te steriliseren. Gebruik een autoclaaf om een spreadsheet met berekeningen van de gewenste gelformulering te maken, inclusief volume en concentratie van stockmaterialen, inclusief polymeerpeptide, verbindingsmiddel, foto-initiator en bufferoplossingen.Verwarm eerst de celcultuur, medium hank's balanced salt oplossing en twee x trips in EDTA voor tot 37 graden Celsius. Vervolgens verwijderen van flessen met min zes bètacellen uit de incubator en plaats ze in de laminar flow hood. Na het aspireren van het celcultuurmedium uit de flessen, spoel de cellen met voorverwarmde tanks, balanceer zout oplossing.Probeer vervolgens de cellen te bevriezen met drie milliliter voorverwarmde, twee x trips in EDTA en incubeer de flessen gedurende vier minuten. Na incubatie, tik zachtjes de flessen op het oppervlak van de hood om de cellen volledig los te maken. Bevestig de loslating en dissociatie van de cellen onder een microscoop.Voeg vervolgens een gelijk volume celcultuurmedium toe. Om het trypsine te neutraliseren, meng de oplossing goed door voorzichtig op en neer te pipetten. Breng vervolgens het mengsel over in een steriele conische buis en centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 200 RCF. Na de centrifugatie, aspireer het supernatant en suspendeer de cellen voorzichtig in vier tot vijf milliliter voorverwarmde cultuur.Media.Bepaal tenslotte de celdichtheid door wat van de celsuspensie te mengen met 50%trian blauw en cellen te tellen met een hemo cytometer. Zodra de cellen klaar zijn, meng de vereiste volumes van PEG vier en B peptide verbindingsmiddel foto-initiator op een eindconcentratie van één millimolar cellen en HBSS in een micro centrifugeerbuis op basis van een één-op-één TH naar EEN-verhouding en meng voorzichtig door te pipetten. Een 4%PEG vier en B wordt gebruikt in deze demonstratie.Pipet vervolgens 25 microliter van de resulterende oplossing in elke spuit mal. Stel de spuit mallen bloot aan 365 nanometer UV-licht met een vermogen van vijf milliwatt per centimeter vierkante voor twee minuten. Om de gel na fotopolymerisatie te polymeriseren, dompel de gels in een steriele 24-wellplaat met één milliliter celcultuurmedium en incubeer de hydrogels bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide gedurende 30 minuten om eventueel losjes bevestigde cellen of onverbonden macro's weg te spoelen.Verwijder na 30 minuten de plaat uit de incubator en breng de gels over in één milliliter vers medium. Ververs het medium elke twee tot drie dagen. Bereid een enzymoplossing van één milligram per milliliter voor door Hanks balanced salt oplossing toe te voegen aan trypsine-vrije alfa chimi trypsine.Steriliseer vervolgens het mengsel met een spuitfilter. Verwijder vervolgens de cultuurplaat uit de incubator en spoel de gels met Hank's balanceer zout oplossing. Voeg vervolgens 500 microliter chimi trypsinoplossing toe aan elke put en incubeer vervolgens bij kamertemperatuur met zachtjes schudden op een shaker gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten om volledige gelerosie te bereiken.Zodra de gel volledig is gedissocieerd, plaats de plaat enkele minuten op ijs om de activiteit van de CH trypsine te verminderen. De volgende stap is om de celsuspensie over te brengen in een buis van één milliliter en langzaam te centrifugeren bij 45 RCF en vier graden Celsius gedurende twee minuten. Na centrifugatie, verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een PEI-pipet en suspendeer het steroïde voorzichtig in Hank's balanceer z

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

Hier presenteren we de methodologie om belangrijke verbindingsbevattende poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microsferen te genereren en toe te dienen aan intacte muis-eilandjes in cultuur met daaropvolgende immunofluorescentie-analyse van β-cel proliferatie. Deze methode is geschikt voor het bepalen van de werkzaamheid van kandidaat β-cel mitogenen.

Aanhoudende toediening van β-cel mitogenen om Intact Mouse Islets<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Bioafbreekbare poly (melkzuur-co-glycolzuur) Microspheres

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.

Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat

Hier presenteren we een protocol dat snelle, robuuste en goedkope fabricage van tumorsferoïden mogelijk maakt, gevolgd door hydrogel-inkapseling. Het is breed toepasbaar omdat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is. Het zou met name nuttig zijn voor het onderzoeken van sferoïde-matrixinteracties en het bouwen van in vitro weefselfysiologische of pathologiemodellen.

Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

Alvleesklierkanker blijft een van de moeilijkste vormen van kanker om te behandelen. Daarom is het van cruciaal belang dat preklinische modellen die de werkzaamheid van de behandeling evalueren, reproduceerbaar en klinisch relevant zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudige co-cultuurprocedure om reproduceerbare, klinisch relevante desmoplastische sferoïden te genereren.

Groeiende desmoplastische driedimensionale alvleesklierkankersferoïden uit co-cultuur

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

Leer het inkapselen van pancreas β-cellen in PEG-peptide hydrogelen met thiol-ene fotopolymerisatie. Deze methode maakt gecontroleerde terugwinning van celaggregaten mogelijk voor biologische karakterisering.

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Meer video's verkennen