Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel
13 november 2012
Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.
Het algemene doel van het volgende experiment is om te screenen op melanoom-modificatoren met behulp van een zebravis autogeen tumormodel. Dit wordt bereikt door transgene dieren te creëren waarin de melanocyten een gen van belang tot expressie brengen en de vissen zijn gepredisponeerd voor melanoom. Vervolgens wordt de aanvang van melanoom gescored om te beoordelen of het gen van belang de tumorinitiatie verandert.
Vervolgens worden tumorinvasie en celspecifieke tests uitgevoerd om enig aanvullend effect van het gen van belang op melanomen en pre-maligne melanocyten te bepalen. Ten slotte worden melanoomcellen getransplanteerd om te meten hoe het gen van belang de frequentie van melanoominitierende cellen in gevestigde tumoren beïnvloedt. De resultaten laten zien hoe een kandidaatgen verschillende eigenschappen van melanocyten en melanomen beïnvloedt, inclusief aanvang, invasie en transplantatiemogelijkheid.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals germline transgenese voor het onderzoeken van kandidaatkankergenen is dat tijd, inspanning en kosten worden bespaard, en de doorvoer wordt verhoogd door middel van de test. Verschillende aspecten van tumorgenese in chimere transgene dieren Demonstratie van deze procedure zal sherania agar zijn, een afgestudeerde student in mijn laboratorium Om constructen voor injectie te genereren. Begin met het maken van gateway middle entry clones door PCR, het versterken van de volledige lengte open leesraam van genen van belang en recombinatie in P don R 2 21.
Gebruik vervolgens multi-site gateway technologie om de melanocyt specifieke mifa promotor gen van belang en polyadenyleringssignaal te recombineren in de mini Cooper vector om genen van belang onder de controle van de mifa promotor te plaatsen injecteer 25 picogram van elke clone, samen met 25 picogram TOL twee transposes mRNA in één cel transgene tripel homozygote zebravis embryo's. Mifa BRAF FP 53. Mutante dieren zijn melanocyt-deficiënt en vatbaar voor transformatie en melanoomvorming.
Samen met het gen van belang. De mini Cooper vector bevat een reddend MVA mini gen. Dus succesvol geïnjecteerde dieren zullen geredde melanocyten ontwikkelen, die het gen van belang tot expressie brengen.
Incubeer de geïnjecteerde embryo's op 28,5 graden Celsius op 24 uur na bevruchting of HPF. Verwijder alle dode embryo's op 72 uur na bevruchting met behulp van een dissectiemicroscoop onder incident licht tegen een witte achtergrond. Selecteer transgene dieren met geredde melanocyten.
Wanneer de dieren vier dagen na bevruchting bereiken, verplaats ze naar drie liter tanks in de kinderkamer van de zebravis faciliteit. Op twee maanden oud, selecteer de dieren met ten minste één gebied van melanocytredding groter dan vier millimeter vierkant. Screen de geselecteerde dieren wekelijks op de aanwezigheid van tumoren.
Isoleer tumordragende dieren voor studie. Teken melanoma-vrije overlevingscurven met leeftijd in weken op de absa en percentage melanoma-vrije overleving op de ordinaat. Vergelijk dieren met melanocyten die een gen van belang tot expressie brengen met controledieren die EGFP en melanocyten tot expressie brengen.
Gebruik een log-rank test om te bepalen of de twee curven statistisch verschillend zijn. Om een tumorinvasietest uit te voeren. Begin met het selecteren van geïsoleerde zebravissen die tumoren dorssaal ontwikkelen in een gebied tussen de achterste grens van de achterste hersenen en de voorste rand van de dorsale vin.
Twee weken na melanoomaanvang, gebruik trica om de vissen te euthanaseren na het fixeren en insluiten van de vissen in paraffine. Maak vijf micrometer dwarssecties door de laesies.Een. Elke 50 micrometer snijd door de gehele laesie zodat het punt van diepste invasie kan worden geïdentificeerd.
Gebruik hematine en eoin om de secties te kleuren. Beoordeel tumorinvasie door te meten of tumorcellen buiten de collageen stratu compactive blijven, in de dorsale musculatuur invaderen of verder in de spinale kolom invaderen. Bepaal het statistische verschil tussen de twee sets monsters om immunokleuring uit te voeren.
Anesthetiseer de vissen in 0,17 milligram per milliliter trica met incident licht onder een dissectiemicroscoop. Gebruik scherpe fijnpuntige pincetten om dorsale schubben te plukken. Zorg ervoor dat de melanocyt bevattende helft van de schub niet wordt beschadigd.
Plaats de schubben direct van de pincetten in één milliliter fixatief en incubeer bij kamertemperatuur terwijl gedurende meer dan of gelijk aan twee uur draaiend. Breng de vissen over in vissenwater en controleer de vissen om de succesvolle herstel van gebleekte gepigmenteerde melanocyten te bevestigen. Was eerst de gefixeerde schubben twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in PBST.
Voeg vervolgens één milliliter vers gemaakt bleekmiddel toe en dek af met parfum of cap locks om te voorkomen dat gas uit de buizen barst. Blijf bleken tot het pigment verdwenen is. Was vervolgens vier keer per vijf minuten in PBST bij kamertemperatuur.
Incubeer gedurende ten minste 30 minuten in blokoplossing, en vervolgens incuberen met ongeveer 400 microliter primaire antilichaam en blokoplossing overnacht Bij kamertemperatuur, was de volgende dag de schubben drie keer gedurende 30 minuten in PBS bij kamertemperatuur, incubeer met secundair antilichaam gedurende twee uur tot overnacht bij kamertemperatuur. Na het staan met dpi, breng een druppel vector schild toe op een glasplaat en monteer de schubben zodat de concave zijde van de schubben naar beneden tegen de plaat gericht is. Plaats een glas dekglas over de monsters.
Gebruik helder nagellak om de randen te verzegelen en observeer de plaatjes onder een fluorescentiemicroscoop. Na een stralende ontvanger, twee tot drie maanden oude Casper vissen met 25 grays gammastraling een dag voorafgaand aan transplantatie. Laat de vissen herstellen in vissenwater.
Gebruik trica om een tumordragende vis te euthanaseren, snij het tumor af en plaats het in een petrischaal met ongeveer vijf milliliter gefilterd gesteriliseerde 0,9 XPBS met 5%FBS met een scheermes snijdt het tumor terwijl het in oplossing is werken bij kamertemperatuur en met een P 1000 pipet itereert om enkele cellen te produceren
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor snelle screening van melanomamodificatoren met behulp van een autochtoon tumormodel in zebravis. De aanpak maakt gebruik van de miniCoopR-vector voor genexpressie in melanocyten, waardoor de initiatie en progressie van tumoren kunnen worden beoordeeld.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Genetica
Achtergrond
- Zebravismodellen zijn effectief voor het bestuderen van kankerbiologie.
- Transgene benaderingen maken het onderzoek naar specifieke genfuncties mogelijk.
- Melanoom is een aanzienlijk gezondheidsprobleem met complexe genetische factoren.
- Bestaande methoden voor gen-screening zijn vaak tijdrovend en kostbaar.
Doel van de studie
- Om een high-throughput methode te ontwikkelen voor het screenen van melanoom-modificatoren.
- Om de impact van kandidaatgenen op de initiatie en progressie van melanomen te evalueren.
- Om de efficiëntie van genfunctie-analyse in kankeronderzoek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Creatie van transgene zebravis die kandidaat-melanomagenen tot expressie brengen.
- Beoordeling van het ontstaan van melanomen en overlevingscurven.
- Invasie-assays om het gedrag van tumorcellen te evalueren.
- Immunokleuringstechnieken voor het analyseren van melanocytkenmerken.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van genen die de ontstaan en invasie van melanoom beïnvloeden.
- Demonstratie van een significant verschil in overlevingspercentages op basis van genexpressie.
- Succesvolle transplantatie-assays die wijzen op geneffecten op tumorinitiatiecellen.
- Verbeterd inzicht in de biologie van melanoom via zebravismodellen.
Conclusies
- De miniCoopR-vector biedt een waardevol instrument voor onderzoek naar melanomen.
- Deze methode maakt een snelle en efficiënte screening van kandidaatgenen mogelijk.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van genetische factoren bij melanomen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit autochtone tumor model in zebravissen maakt high-throughput functionele validatie van kandidaat-modificatoren voor melanomen mogelijk, waarmee de uitdaging wordt aangepakt om driver-mutaties te onderscheiden van passenger-mutaties in de cancer genomics. Door de effecten op tumorinitiatie, invasie en de frequentie van melanoom-initierende cellen kwantitatief te meten, biedt de assay voorspellende zekerheid voor targetvalidatie en lead-identificatie in oncologische geneesmiddelenontwikkeling. Deze benadering ondersteunt mechanische risicoanalyse en portfoliotriage door genetische alteraties te koppelen aan functionele fenotypes in een ziekterelevant systeem.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te testen of kandidaatgenen het ontstaan en de progressie van melanomen in vivo beïnvloeden.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door het herstel van melanocyt-deficiënte fenotypes in combinatie met genexpressie in het relevante celtype.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het voorspellende vertrouwen door effecten op tumorinitiatie te kwantificeren via melanoomvrije overlevingscurves en statistische vergelijking met behulp van log-rank tests.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door kandidaatgenen tot expressie te brengen onder de mitfa-promotor in geredde melanocyten.
- Operationele waarde: Pakt de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan via Tol2-gemedieerde transgenese en consistente injectieprotocollen in triple homozygote zebravissenembryo's.
- Schaalbaarheidswaarde: Benadrukt de gereedheid voor screening en het hergebruik van het platform door het mogelijk maken van de snelle generatie van transgene dieren voor grootschalige modifier-screens.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten via een autochtoon tumormodel dat de stappen omvat die nodig zijn voor de initiatie en instandhouding van melanomen.
- Preklinische continuïteit: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het meten van invasie, transplantatie en de frequentie van tumorinitiatiecellen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Faciliteert beslissingen over risico-gecorrigeerde vooruitgang door vergelijking van geneffecten op melanoomeigenschappen mogelijk te maken om go/no-go-criteria te onderbouwen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege ontdekking via lead-identificatie tot preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie bij de validatie van targets voor melanomen.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, padverduidelijking of biologische risicoreductie ondersteunt door de effecten van genen op tumorinitiatie en progressie te beoordelen.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay, de reproduceerbaarheid of kwantitatieve outputs via overlevingscurves zonder melanoom, invasie-assays en transplantatie-readouts.
- Analytics: Benadrukt metingen, readouts of statistische outputs die teams helpen om condities te vergelijken, inclusief overlevingsanalyse en invasiescoring.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming door de frequentie van tumorinitierende cellen en het invasieve potentieel te evalueren.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek via gestandaardiseerde workflows voor constructgeneratie en injectie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een late fase.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in moleculaire klonering, het houden van zebravissen en transgene technieken.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten micro-injectieapparatuur, fluorescentiemicroscopie en instrumenten voor overlevinganalyse.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor de validatie van constructen, consistentie van injecties en fenotypische scoring.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, in het bijzonder voor andere kankertypes of genetische achtergronden.
- Praktische beperkingen die worden ondersteund door het bronmateriaal omvatten de behoefte aan homozygote mutante embryo's en wekelijkse tumorscreening gedurende meerdere maanden.
