Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen

Het doel van deze procedure is om de neuroprotectieve effecten van trophische peptiden te beoordelen in een foetaal alcohol-expositiemodel. Dit wordt bereikt door eerst de experimentele dieren te laten paren en vervolgens de zwangere vrouwtjes in een tweede stap te behandelen met trophische peptiden, de foetussen worden gedissecteerd om foetale hersenen te isoleren voor experimenteel gebruik. Vervolgens worden de foetale hersenen in gelatine ingebed voor sectioen, gevolgd door tunnelkleuring om de resultaten van celdood te bepalen.

Die aantonen dat prenatale alcoholblootstelling het aantal tunnel-positieve cellen in de ganglionische eminentie verhoogt. In vergelijking met de controlegroep verminderde toediening van het trophische peptide, een D en F negen de door alcohol geïnduceerde toename van tunnel-positieve cellen significant in vergelijking met controle alcoholbehandelde dieren. Visuele demonstratie van dit metaal is dus cruciaal, omdat de dissectie van foetale hersenen en de inbeddingsstappen moeilijk te leren zijn omdat foetale hersenen erg klein zijn om te dissecteren en te verwerken voor sectioen. Eerst fokken C 57 zwarte zes muizen door zes weken oude vrouwelijke muizen van ongeveer 20 gram twee uur lang in mannen thuiscages te plaatsen onmiddellijk na verwijdering.

Controleer elke vrouw op de aanwezigheid van een spermaplug om te bevestigen dat er paring heeft plaatsgevonden. Als er een spermaplug aanwezig is, stel dan deze embryonale dag nul in op E zeven weegt zwangere vrouwtjes in vier groepen. Een alcoholvloeibaar dieetgroep die als vrije toegang wordt geboden als enige bron van voedingsstoffen.

Twee Perfed controlegroep drie peptidebehandelingsgroep, die een intraperitoneale injectie van een DNF negen peptide zou moeten ontvangen naast alcoholblootstelling. Vloeibaar dieet. Noteer het volume vloeibaar dieet dat door de dieren wordt geconsumeerd in 24 uur van 30 milliliter graduele schroefdopbuizen om de dagelijkse hoeveelheid alcohol, vloeibaar dieet of gepaard vloeibaar dieet te bepalen die via een vrije overtollig als enige bron van voedingsstoffen kan worden geboden.

Zorg ervoor dat dagelijks vers bereid vloeibaar dieet wordt geboden van E zeven tot E 13 na het doden van de zwangere Myer E 13 door koolstofdioxide euthanasie, gevolgd door cervicale dislocatie. Leg het karkas op de dissectiebord in een rugligging en maak de buik schoon met 70% ethanol. Gebruik steriele schaar en pincetten om een buiksnede te maken.

Zodra de buik is geopend, houd de baarmoeder met pincetten vast en gebruik een tweede pincet om langzaam en voorzichtig het me-endotheel weg te scheuren van de baarmoeder zonder de embryo's te puncteren. Verwijder voorzichtig de embryo's uit de baarmoeder en breng ze over in Hank's balanssorteeroplossing In een 60 millimeter bij 15 milliliter celkweekschaal op nat ijs, plaats de schaal en ijscontainer op het podium van een stereomicroscoop met behulp van ultrafijne pincetten voor microdissectie. Trek de huid van de embryo's aan de bovenkant van het hoofd om de schedel bloot te leggen.

Zodra de schedel is blootgelegd en duidelijk zichtbaar onder de stereomicroscoop, grijpt u de basis van de schedel op het niveau van het ruggenmerg en de hersenstam met pincetten en begint u de schedel af te pellen. Blijf de schedel stuk voor stuk van de achterste naar de voorste delen van het hoofd afpellen. Zodra de hersenen volledig blootliggen, gebruikt u de pincetten om deze te extraheren.

Dissecteer vervolgens de foetale hersenen van de basis van de primordiale of fabriekbol tot de basis van de Met Postfix alle gedissekteerde foetale hersenen in 4% paraldhyde gedurende twee tot drie dagen. Foetale hersenen kunnen ook worden ingevroren als ze worden getest voor western blot of enzymatische assays. Na het bereiden van een 10% oplossing van A-kwaliteit gelatine bereid in gedistilleerd water, vul een wegschillende inbeddingsmal half en wacht tot de gelatine is gestold.

Plaats controle en prenataal behandelde foetale hersenen naast elkaar bovenop de gestolde gelatine. Dit is om consistente omstandigheden te behouden tussen zowel de controle- als experimentele groepen. Zorg ervoor dat de gelatine niet te heet is en voeg vloeibare gelatine bovenop de foetale hersenen toe om een complete mal te maken.

De uiteindelijke mal moet op deze afbeelding lijken, koel de voorbereide gelatine mal die de foetale hersenen bevat gedurende 15 minuten. Vervolgens schilt u de inbeddingsmal van kunststof af. De uiteindelijke mal moet er zo uitzien en breng vervolgens de gelatine met foetale hersenen over in 4% paraldehyde gedurende twee dagen.

Op de derde dag bevestigt u de gelatine blok met vaste foetale hersenen aan het podium van de viome. Sectie vervolgens de hersenen met een viome ingesteld op 25 tot 50 micron dikte voor coronale sectioen. Verzamel de foetale hersensecties in PBS, monteer vervolgens de foetale hersensecties op super frosts plus dia's in water en laat ze 15 minuten drogen.

Na het verstrijken van 15 minuten. Plaats de dia's in PBS voor testen van tunnelreactie de volgende dag. Dompel de dia's eerst vijf minuten lang in een oplossing van 20 microgram per milliliter proteinase K en PBS bij 37 graden Celsius.

Spoel vervolgens drie keer in PBS gedurende vijf minuten elk op een orbitale schudder. Incubeer de secties gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden in 3% waterstofperoxide in methanol. Was vervolgens de dia's zoals eerder.

Bekijk vervolgens de secties gedurende twee minuten in permeabele oplossing op ijs. Na de incubatie wordt twee keer in PBS gewassen. Gebruik zoals eerder een laboratoriumweefsel om het gebied van de dia rond de secties te drogen.

Gebruik vervolgens een pat pen om rond de secties op de dia te tekenen. Dit voorkomt lekkage van de kleuroplossing, waardoor een klein volume kan worden gebruikt. Incubeer één sectie in elk paar met tunnelreactie mengsel bereid volgens de instructies van de fabrikant.

Voeg een drageroplossing toe zonder tunnelreagens aan de negatieve controle sectie. Bewaar vervolgens de dia's gedurende één uur bij 37 graden Celsius.