Name: Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Leer hoe trofische peptiden de neuroprotectieve effecten tegen alcoholgeïnduceerde apoptose in foetale hersenen van C57BL/6 muizen beoordelen. Deze methode toont aan dat ADNF-9 de celsterfte significant vermindert.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door Award Aantal R21AA017735 (YS) van de National Institutes on Alcohol misbruik en alcoholisme. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteur en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute on Alcohol Abuse en Alcoholisme of de National Institutes of Health. De auteur wil ook Charisse Montgomery bedanken voor het bewerken van dit manuscript.

1. Dieren Fokkerij en Trofische Peptide behandeling <ol><li> Breed C57BL/mice door het plaatsen van de vrouwelijke muizen (~ 6 weken oud, gemiddeld gewicht 20 gram) in mannelijke huis kooien voor 2 uur. </li><li> Controleer voor een zaadcel stekker en / of vaginaal uitstrijkje onmiddellijk daarna. </li><li> Indien positief, wijzen dit tijdstip als embryonale dag 0 (E0). </li><li> Op E7, gewicht-match drachtige vrouwtjes om de controle en behandeling groepen (3 groepen) worden toegewezen zoals recent beschreven 4: 1) Alcohol (ethanol) vloeibaar dieet groep (ALC); 2) paarsgewijs gevoerde controlegroep (PF); 3) Peptide behandelgroep, die intraperitoneale (ip) injectie van ADNF-9 peptide moeten krijgen naast de blootstelling aan alcohol vloeibaar dieet (ALC/ADNF-9). De details van de voorbereiding van de ALC en PF diëten en de procedure van het ip-injecties kan worden gevonden in onze recente werk 4. </li><li> Meet dagelijks alcohol vloeibaar dieet dat kan worden geleverd als gratis toegang als de enige bron van voedingsstoffen. PF vloeibaar dieet individueel t juko een ALC dam kan dagelijks worden gemeten als goed. </li><li> Het volume van de vloeibare voeding verbruikt tijdens de voorafgaande 24 uur kan worden opgenomen uit 30-ml afgestudeerd schroefdop buizen en vers bereide voeding moet dagelijks worden verstrekt vanaf E7 tot E13. </li></ol> 2. Dissectie van Foetussen en Microdissectie van Foetale Brains <ol><li> Offeren zwangere muizen op E13 door diep euthanizing de muizen met een CO 2 procedure gevolgd door een cervicale dislocatie. </li><li> Reinig de abdominale plaats van incisie met 70% ethanol. </li><li> Maak een abdominale incisie met steriele schaar en pincet. </li><li> Zodra de buik open is, ontleden uit de baarmoeder door vast te houden met een pincet en het gebruik van de andere tang om de mesometrium weg van de baarmoeder scheurt. Zorg ervoor dat u deze procedure langzaam te doen om te voorkomen dat aanprikken van de embryo&#39;s. </li><li> Verwijder het embryo uit de baarmoeder en breng ze in een celkweek schotel (60 mm x 15 mm) met Hanks &#39;Balanced Salt oplossing<html> (HBSS) in ijskoud water. </li><li> Ontleden foetale hersenen van de gehele embryo&#39;s onder stereomicroscoop voor microdissection. </li><li> Met behulp van ultra-fijne tang voor microdissection, trek de huid van de embryo&#39;s in het bovenste gedeelte van het hoofd tot de schedel bloot te leggen. </li><li> Zodra de schedel bloot en duidelijk zichtbaar onder de stereomicroscoop microdissectie, trek het schedel vanaf het achterste deel van de hersenen in het ruggenmerg en de hersenstam gebieden. </li><li> Zorg ervoor dat u afpellen van de schedel stuk voor stuk van posterior naar anterior delen van het hoofd. </li><li> Zodra foetale hersenen visueel worden blootgesteld, doorgaan met het extraheren van hen. </li><li> Ontleden de foetale hersenen van de basis van de primordium bulbus olfactorius aan de basis van de metencephalon. </li><li> Postfix alle ontleed foetale hersenen in 4% paraformaldehyde voor 2-3 dagen. U kunt ook invriezen andere foetale hersenen van elke dam als je ze testen voor Western blot of enzymatische assays. </li></ol>nt &quot;&gt; NB: De procedures voor het dier toepassingen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Toledo, die in overeenstemming zijn met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de National Institutes of Health en de Gids voor de zorg en gebruik van proefdieren. 3. Inbedding Foetale Brains in Gelatine voor Snijden <ol><li> Bereid 10% van gelatine leerjaar A. </li><li> Vul een peel-away inbedding schimmel halverwege en wacht tot de gelatine stolt. </li><li> Controlesystemen en prenataal behandelde foetale hersenen naast elkaar bovenop de gestolde gelatine. Dit is om vaste condities van immunodetectie van celdood houden tussen zowel de controle-en experimentele groepen. </li><li> Voeg vloeibare gelatine op de top van de foetale hersenen om een ​​compleet mal te maken (zorg ervoor dat de gelatine niet te heet). </li><li> Koel de bereide gelatine schimmel die foetale hersenen houdt gedurende 15 minuten. </li><li> Afschillende inbedding mal plastic en vervolgens over de pre-made gelatinehoudende foetale hersenen in 4% paraformaldehyde voor twee dagen. </li><li> Plaats en deel gefixeerd foetale hersenen in gelatine met behulp vibratome snijden machine (Leica VT 1000S) bij 50 micrometer dik voor coronale coupes. Deze dikte wordt getest in onze studies omdat het een betere anatomische kenmerken. Bovendien dikten van 25 urn en groter kunnen ook getest met deze techniek waarbij ingesloten foetale hersenen in 10% gelatine. Merk op dat coronale secties werden gesneden met behulp vibratome in de basale ganglia eminence niveau op de voorhersenen </li><li> Verzamel de foetale hersenen secties in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing. </li><li> Monteer de foetale hersenen secties in Superfrost Plus dia&#39;s in het water. </li><li> Droog de gemonteerde secties voor 15 minuten. </li><li> Plaats de dia&#39;s (gemonteerd met de foetale hersenen secties) in PBS voor de volgende dag het testen van TUNEL reactie. </li></ol> 4. TUNEL Reaction voor Debescherming van de Cell Death of Apoptosis (TUNEL: TdT-gemedieerde dUTP Nick Einde Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase). Deze test is bedoeld om celdood te bepalen. <ol><li> Behandel foetale hersenen secties, in Superfrost Plus objectglaasjes met Proteinase K (20 ug / ml) gedurende 5 min bij 37 ° C (300 pl proteinase K gemengd in 20 ml PBS). Dia&#39;s worden geassembleerd in 5-Plend geopend maile). </li><li> Spoel foetale hersenen secties (gemonteerd in dia&#39;s) met PBS drie keer voor 5 min onder Orbital shaker. </li><li> Incubeer de secties met 3% H 2 O 2 in methanol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (3 ml 30% H 2 O 2 in 27 ml 100% methanol) (dia mag niet in een shaker). </li><li> Spoel secties met PBS drie keer voor 5 min in orbitaalschudder. </li><li> Incubeer secties in permeabilisatie-oplossing (0,1% Triton X-100 in 0,1% natriumcitraat) gedurende 2 minuten op ijs (4 ° C) (100 pl Triton + 0,1 g natriumcitraat + 99,9 ml gedestilleerdd water). </li><li> Spoel secties in PBS twee keer gedurende 5 min in orbitaalschudder. </li><li> Droge omgeving secties in de dia. </li><li> Teken barrière op Superfrost Plus dia&#39;s met behulp van PAP Pen. Hiermee moet voorkomen lekken van de oplossing die wordt gebruikt om de secties voor de detectie van TUNEL-positieve cellen te behandelen. </li><li> Incubeer de secties met TUNEL reactiemengsel (50 pi van fles 1 en 450 pl van fles 2) gedurende 1 uur bij 37 ° C, wordt de knop gebruikt door incubatie in oplossing uit de fles 2. </li><li> Spoelen met PBS drie keer 5 min onder Orbit shaker. </li><li> Droge gebied rond weefsel. </li><li> Incubeer secties met converter-POD gedurende 30 min bij 37 ° C. </li><li> Spoel de secties driemaal gedurende 5 minuten met Tris-HCl (pH 7,5, 0,05 M). </li><li> Incubeer de secties gedurende 7 min in 0,05% 3&#39;-3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) en 0,003% H 2 O 2 (25 ml Tris HCI, pH 7,5, 0,05 M + 25 gl 3% H 2 0 2 + 500 pl DAB) Onder Oribtal schudder bij 4 ° C (in ijs) en in het donker (zorg ervoor om deze procedure te doen in nieuwe 5-Plend geopend mailer). </li><li> Spoel de secties met PBS drie keer 5 min onder Orbital shaker. </li><li> Houd de dia secties in PBS voor niet meer dan 24 uur in PBS, dan verwerken ze voor Nissl kleuring zoals beschreven in de volgende paragraaf protocol. </li></ol> Opmerking: DAB is een kankerverwekkende stof. Gebruik handschoenen en reinig alle gerechten gebruikt met het bleekmiddel eenmaal klaar met alle experimenten. 5. Nissl kleuring voor Voorbereiding van de foetale hersenen secties voor Microscopische waarneming <ol><li> Nissl kleuringsprocedure moet worden gedaan in een biologische veiligheid kap. </li><li> Spoel de dia secties met gedemineraliseerd water gedurende 2 minuten. </li><li> Incubeer de secties in 70% ethanol gedurende 2 minuten. </li><li> Incubeer de secties in 95% ethanol gedurende 6 minuten. </li><li> Incubeer de secties in 70% ethanol gedurende 2 minuten. </li><li> Spoel de secties in gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten. </li><li> Incubeer de secties in Cresyl Violet Stain gedurende 3 minuten. </li><li> Spoel de secties in gedemineraliseerd water gedurende 2 minuten. </li><li> Incubeer de secties in 70% ethanol gedurende 2 minuten. </li><li> Incubeer de secties in 95% ethanol + 3 ml ijsazijn gedurende 3 minuten. </li><li> Incubeer de secties in 95% ethanol gedurende 2 minuten. </li><li> Incubeer de secties in 100% ethanol gedurende 2 minuten driemaal. </li><li> Incubeer de secties in xyleen gedurende 10 minuten drie keer. </li><li> Dia&#39;s die de foetale hersenen secties kan worden gemonteerd met behulp van Permount en dekglas glasplaatjes. </li><li> Laat de gemonteerde dia&#39;s nachts voorafgaand aan microscopische observatie en analyse. </li><li> Microscopische observatie en microfiches kunnen worden uitgevoerd onder Leica microscoop rechtop. </li></ol>

<ol><li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide%2C+NAP%2C+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+peptide%2C+colivelin%2C+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mice%3A+signaling+pathway+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL%2F6+mice%3A+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li>
<li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis%2C+in+part%2C+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li>
<li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL%2F6+mice%3A+a+proteomic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li>
<li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li>
<li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor%3A+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li>
<li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li>
<li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected%2C+in+part%2C+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li>
<li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li>
<li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li>
<li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoactive+intestinal+peptide+%28VIP%29+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures%3A+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li>
<li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li>
</ol>

Geen onthullingen worden gedaan.

De en-technieken die in deze studie tonen de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen en de rol van trofische peptiden in de preventie van deze effecten. Deze kunnen informatie over hoe u andere drugs van misbruik of andere giftige chemicaliën in de foetale hersenen tijdens de verschillende stadia zwangerschap bestuderen bieden. Met betrekking tot het paradigma kweken, in sommige gevallen de detectie van het sperma stekker mogelijk niet waarneembaar. Op dit moment...

Het doel van het hier beschreven experimentele methoden is om de neuroprotectieve effecten van trofische peptiden beoordelen in een foetale blootstelling model alcohol met behulp van verschillende technieken met fokkerij, voeding, microdissecting, en het opsporen van celdood. Werken vanuit ons laboratorium heeft betrekking op een vloeibaar dieet gemengd met alcohol als een model van matig alcohol drinken, die vergelijkbaar is met een menselijke paradigma drinken in termen van de hoeveelheid alcohol kan zijn geconsumeerd 1-5. Wij en anderen hebben drie peptide derivaten die neuroprotectieve tegen de schadelijke effecten van blootstelling foetaal alcohol geïdentificeerd. Onderzoeken naar blootstelling aan alcohol tijdens de embryonale stadia die dierlijke modellen kunnen leiden tot de identificatie van potentiële mechanismen van neuroprotectie en zorgen voor de ontwikkeling van de interventie procedures. Dit kan voldoende informatie over de neuroprotectieve effecten en verzwakking van de schadelijke effecten van blootstelling aan alcohol tijdens de zwangerschap verschaffen. Mogelijke preventie van de effecten van prenatale alcohol kan de behandeling van zwangere muizen met peptiden die zijn getoond te zijn betrokken bij neuroprotectie in vitro en in vivo 6,7 1,2,4,8,9 betrekken. Onder deze peptiden, is SALLRSIPA, bekend als ADNF-9 of SAL, afgeleid van de activiteit-afhankelijke neurotrophic factor (ADNF) 7,10. Ander peptide met de sequentie NAPVSIPQ peptide, genoemd NAP, afgeleid van de activiteit-afhankelijke neuroprotectief eiwit (ADNP) 6,11, toonde een krachtige beschermende werking tegen oxidatieve stress in verband met blootstelling aan alcohol 12,13. Bovendien hebben we recent geïdentificeerde een nieuw peptide gesynthetiseerd, colivelin dat blijkt een belangrijke neuroprotectieve rol in de foetale alcoholblootstelling model 2. Colivelin is samengesteld uit ADNF-9 en AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Het belang van het gebruik van deze peptiden is dat ze de mogelijkheid omsteek de hersen-bloed barrière om de effecten van alcohol-geïnduceerde apoptose en de hersenen tekorten groei te voorkomen. De experimentele methoden C57BL / 6 muizen voor het testen van de neuroprotectieve effecten tegen alcohol-geïnduceerde apoptose. Wij hebben een 2-uur-venster in plaats van &#39;s nachts fokken om nauwkeurig inschatten van de embryonale dag 0 (E0), als het kan onthuld worden door detectie van een zaadcel plug en vaginaal uitstrijkje 1-5 aangenomen. We hebben gebruik gemaakt van een vloeibaar dieet met voeding buizen, omdat dit wordt beschouwd als gratis toegang in plaats van levering van alcohol door middel van sondevoeding route, die spanning kunnen veroorzaken aan zwangere muizen. Anderzijds kan microdissectie een uitdaging vanwege de zachtheid van het foetaal hersenweefsel, die zouden kunnen optreden bij het ontleden foetale hersens vroege embryonale stadia. Hier laten we zien gevisualiseerd technieken om te gaan met alle uitdagingen met betrekking microdissection. Aangezien de foetale hersenen snijden ook kan lastig zijn, hebben we aangenomeneen techniek die inhoudt dat het verankeren van de foetale hersenen in gelatine met behulp van peel-away inbedding mallen. We zijn succesvol geweest bij het terugdringen van de foetale hersenen in vrij zwevende secties 50 micrometer dik. Dit stelt ons in staat om wijzigingen van eiwitgehalte onderzoeken in foetale hersenen secties, waaronder de identificatie van celdood.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>PAP PEN</td><td>Research Products Int. Corp.</td><td>195506</td><td></td></tr><tr><td>5-Plend Open Mailer </td><td>Heathrow Scientific, LLC</td><td>HS 15983G</td><td></td></tr><tr><td>Peel away embedding molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>In situ cell death detection kit, POD</td><td>Roche Diagnostics, Inc</td><td>11684817910</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Type A</td><td>FisherScientific</td><td>G8-500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>Leica M60, KL 200 LED</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Vibratome</td><td>Leica, Inc</td><td>Leica VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Moria Ultra Fine Forceps </td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>2 paar</td></tr><tr><td>Graduate 30 ml feeding tubes</td><td>Dyets, Inc</td><td>900012</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin Mix </td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>F8031</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Mix</td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>F8598</td><td></td></tr><tr><td>Maltose Dextrin</td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td><td>111000190-SS05</td><td>Pharmco-AAPER</td><td></td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>LEICA DM 4000</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentele methoden voor het testen van de effecten van neurotrophic peptide, adnf-9, tegen alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in c57bl / 6 muizen

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Experimentele ontwerpen voor onderzoek naar de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol tijdens de vroege embryonale stadia in de groei van de foetus hersenen zijn uitdagend. Dit is vooral te wijten aan de moeilijkheid van microdissectie van foetale hersenen en het snijden voor het bepalen van apoptotische cellen door prenatale blootstelling aan alcohol. De hier beschreven experimenten geven gevisualiseerd technieken muizen fokken tot de identificatie van celdood in foetaal hersenweefsel. Deze studie gebruikte C57BL / 6 muizen als diermodel voor de studie van foetaal alcohol blootstelling en de rol van trofische peptide tegen alcohol-geïnduceerde apoptose. De kweek bestaat uit een 2-uur venster matten om de exacte fase van de embryonale leeftijd. Een gevestigde foetale model alcoholblootstelling is gebruikt in deze studie om de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen bepalen. Het gaat om de vrije toegang tot alcohol of paargevoede vloeibaar dieet als de enige bron van voedingsstoffen voor de zwangere muizen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De technieken waarbij dissectie van foetussen en microdissection van foetale hersenen worden zorgvuldig beschreven, omdat deze laatste kan een uitdaging zijn. Microdissection vereist een stereomicroscoop en ultra-fijn pincet. Stap-voor-stap procedures voor het ontleden van de foetale hersenen zijn visueel verstrekt. De foetale hersenen worden ontleed uit de basis van de primordium bulbus olfactorius aan de basis van de metencephalon. Voor het onderzoeken van apoptose, worden foetale hersenen eerst ingebed in gelatine met behulp van een schil-weg mal om hun snijden met een vibratome apparatuur te bevorderen. Foetale hersenen ingebed en gefixeerd in paraformaldehyde zijn gemakkelijk doorgesneden, en de vrij zwevende secties kunnen in superfrost plus dia&#39;s worden gemonteerd voor bepaling van apoptose of celdood. TUNEL (TdT-gemedieerde dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase) assay werd gebruikt om celdood of apoptotische cellen te identificeren. Het is opmerkelijk dat apoptosis en celgemedieerde cytotoxiciteit wordt gekenmerkt door DNA fragmentatie. Dus de gevisualiseerde TUNEL-positieve cellen indicatief celdood of apoptotische cellen. De experimentele ontwerpen hier vindt u informatie over het gebruik van een gevestigde vloeibaar dieet voor het bestuderen van de effecten van alcohol en de rol van de neurotrofe peptiden tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Het gaat om het fokken en voederen zwangere muizen, microdissecting foetale hersenen, en het bepalen van apoptose. Samen kunnen deze visuele en tekstuele technieken een bron voor het onderzoeken van prenatale blootstelling aan schadelijke stoffen in de foetale hersenen zijn.

De experimentele methoden hier beschreven tonen aan dat een 2-uur-venster fokken is van essentieel belang om in te schatten nauwkeurige zwangerschapsduur podium. We hebben de dissectie van de embryo&#39;s gedemonstreerd op de leeftijd van E13. We hebben ook aangetoond microdissection van foetale hersenen bij E13. De procedure meerdere fasen (ac), zoals beschreven in figuur 1. Foetale hersenen worden ontleed uit de basis van de primordium bulbus olfactorius aan de basis van de metencephalon (figu...

De experimentele ontwerpen voorgesteld hier richten op het bestuderen van de effecten van blootstelling aan alcohol in apoptose en de toepassing van neurotrophic peptide tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Een gedetailleerde beschrijving van de kweek tot de verzameling van foetale hersenen beschreven. Technieken voor de bepaling van apoptose nader omschreven.

Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Het doel van deze procedure is om de neuroprotectieve effecten van trophische peptiden te beoordelen in een foetaal alcohol-expositiemodel. Dit wordt bereikt door eerst de experimentele dieren te laten paren en vervolgens de zwangere vrouwtjes in een tweede stap te behandelen met trophische peptiden, de foetussen worden gedissecteerd om foetale hersenen te isoleren voor experimenteel gebruik. Vervolgens worden de foetale hersenen in gelatine ingebed voor sectioen, gevolgd door tunnelkleuring om de resultaten van celdood te bepalen.Die aantonen dat prenatale alcoholblootstelling het aantal tunnel-positieve cellen in de ganglionische eminentie verhoogt. In vergelijking met de controlegroep verminderde toediening van het trophische peptide, een D en F negen de door alcohol geïnduceerde toename van tunnel-positieve cellen significant in vergelijking met controle alcoholbehandelde dieren. Visuele demonstratie van dit metaal is dus cruciaal, omdat de dissectie van foetale hersenen en de inbeddingsstappen moeilijk te leren zijn omdat foetale hersenen erg klein zijn om te dissecteren en te verwerken voor sectioen. Eerst fokken C 57 zwarte zes muizen door zes weken oude vrouwelijke muizen v

experimental-methods-for-testing-effects-neurotrophic-peptide-adnf-9

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om de moleculaire mechanismen van de ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsschade begrijpen, hebben we een zebravis model van ethanol blootstelling en het verkennen van de fysieke, cellulaire en genetische veranderingen die optreden na blootstelling aan...

Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

We tonen de bouw van alcohol damp kamers met behulp van gemakkelijk beschikbare materialen die tegelijk huisvesten 6 muis kooien. We gebruik ervan verder te beschrijven in een muismodel van foetale blootstelling aan alcohol gelijk aan alle 3 trimesters van de zwangerschap bij de mens. Dit paradigma bloot dieren tijdens de dracht en postnatale dagen 1-12.

Bouw van Vapor Chambers gebruikt om muizen bloot te stellen aan alcohol tijdens het equivalent van alle drie trimesters van Menselijke Ontwikkeling

Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om procedures te beschrijven om ratten bloot te stellen aan matige niveaus van alcohol tijdens de prenatale hersenontwikkeling en om de resulterende veranderingen in sociaal gedrag tijdens de volwassenheid te kwantificeren.

Matige Prenatale blootstelling aan alcohol en kwantificering van sociaal gedrag bij volwassen ratten

Trace eyeblink klassieke conditionering (ECC) werd gebruikt om te beoordelen hippocampal-afhankelijke associative leren bij volwassen ratten die waren toegediend een hoge concentratie (11,9% v/v) van alcohol tijdens de vroege ontwikkeling van de neonatale hersenen. In het algemeen, zijn ECC procedures diagnostische hulpmiddelen voor het opsporen van hersenen dysfunctie over vele psychologische en biomedische instellingen voor geluid.

Het gebruik van Trace Eyeblink klassieke conditionering te beoordelen Hippocampal dysfunctie in een Rat Model van Fetal Alcohol Spectrum Disorders

De voorbijgaande receptor potentieel vanilloid type 1 (TRPV1) in de supraspinale regio is voorgesteld om een aantal rollen te spelen in de hersenfunctie. Hier beschreven is een protocol voor intracerebroventriculaire injectie van harsatoxine voor supraspinale TRPV1 desensibilisatie bij muizen. Procedures voor sommige pijntests worden ook gepresenteerd.

Intracerebroventriculaire behandeling met resiniferatoxine en pijntests bij muizen

Dit werk beschrijft een protocol om ethanolniveaus in een embryo van zebravissen te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie van de juiste blootstellingsmethoden voor embryoverwerking en ethanolanalyse.

Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

In dit protocol beschrijven we een methode voor gelijktijdige verzameling van foetaal hersenweefsel en hoogwaardig, niet-gehemolyseerd serum uit hetzelfde muizenembryo. We hebben deze techniek gebruikt om te onderzoeken hoe maternale blootstelling aan voeding de macronutriëntenprofielen en de foetale neurologische ontwikkeling beïnvloedt bij muizen die heterozygoot zijn voor Nf1 (neurofibromatose type 1).

Gelijktijdige verzameling van hersenen en serum van foetale muizen om de effecten van maternale voeding op voeding en neurologische ontwikkeling bij neurofibromatose type 1 te beoordelen

Naarmate de wettelijke beperkingen veranderen, wat resulteert in een grotere toegankelijkheid van cannabinoïdeproducten, is het van cruciaal belang om modellen te ontwikkelen om de impact van deze blootstellingen te bestuderen, vooral tijdens de zwangerschap. Er is een preklinisch model ontwikkeld voor matige prenatale blootstelling aan cannabinoïden door vrijwillige inname, waardoor diepgaander onderzoek mogelijk is.

Preklinisch model van prenatale blootstelling aan delta-9-tetrahydrocannabinol om de impact ervan op neurologische ontwikkelingsresultaten te beoordelen

Het artikel biedt een uitgebreid protocol om een muizenmodel voor moederlijke immuunactivatie (MIA) te genereren om de effecten van vroege zwangerschapsontsteking op de neuroontwikkeling te bestuderen, inclusief belangrijke meetwaarden om betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te waarborgen.

Generatie van het vroeg-zwangerschapsmodel van moederlijke immuunactivatie om prenatale ontsteking op de neuroontwikkeling te beoordelen

Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Dit model is ideaal voor het uitvoeren van een aantal experimentele manipulaties die het netvlies doel wereldwijd of direct de doelstelling van de gewonden neuronale populatie van retinale ganglioncellen.

Methoden voor experimentele manipulaties na Optic Nerve doorsnijding in het zoogdier CZS

Leer hoe trofische peptiden de neuroprotectieve effecten tegen alcoholgeïnduceerde apoptose in foetale hersenen van C57BL/6 muizen beoordelen. Deze methode toont aan dat ADNF-9 de celsterfte significant vermindert.

Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen (Video) | JoVE Journal

Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen

Meer video's verkennen