Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

In deze video wordt een zeer eenvoudig en efficiënt protocol gepresenteerd om in slechts 15 minuten een cellulaire suspensie van testmateriaal uit knaagdieren te verkrijgen. De methode is toegepast op testmateriaal van muis, rat, cavia's en gebruikt een meta-machine-apparaat om het ingekapselde weefsel te desaggregeren. Na een filtratie en kleuring is de celsuspensie klaar voor flow.

Cyto-analyse of sorteer Homogeneïteit van celpopulaties is een vereiste voor de analyse van biochemische en moleculaire gebeurtenissen tijdens mannelijke GA-differentiatie. Daarom vertegenwoordigt testiculaire heterogeniteit met meer dan 30 verschillende celtypen een van de grootste problemen met betrekking tot de studie van de moleculaire basis van zoogdierspermatogenese. Om die reden zijn verschillende methoden gebruikt om een verrijkte tot gezuiverde testiculaire celpopulatie te verkrijgen, inclusief PU en centrifugale illustratie.

De eerste stap voor elke celscheidingsmethode is de bereiding van een cellulaire suspensie. Echter, huidige protocollen zijn meestal tijdrovend en kunnen het verlies van kortlevende moleculen zoals RNA's inhouden, wat ongewenst is voor verdere expressie-analyse. Het grote voordeel van het hier gepresenteerde protocol is dat het stappen tussen dierenoffer en specifieke moleculaire studies in het spermastadium elimineert, maar tegelijkertijd goede kwaliteit en uitstekende weergave van celtypen in de cellulaire suspensies garandeert.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Ana Rodriguez, onderzoeker bij AL Laboratory die de methode ontwikkelde en Federico San Lopez flowcytometrie die verantwoordelijk waren voor de cytometrische analyse. De procedure vereist een klein stuk apparatuur, het meach-systeem, met zijn medicon en fcon-accessoires. De fcon-accessoires kunnen echter perfect worden vervangen door nylonmembranen met dezelfde poriëngrootte.

De enige andere vereiste materialen en reagentia zijn glazen verspreider, twee schalen, schaar en pincetten, een drie- tot vijf milliliterspuit, een annoy-darmkamer, DMM-kweekmedium gesupplementeerd met 10% foetaal hoestserum en NDA. Als downstream-toepassingen met RNA-manipulaties gepland zijn, moeten alle materialen en oplossingen dienovereenkomstig worden behandeld om het protocol uit te voeren. Plaats de gedissecteerde testis in een 96 millimeter glazen per data per ijs met 10 milliliter gesupplementeerd ijs genaamd dm.

Verwijder de TAL Virginia, snijd de gekapte testis in vierkante stukken van twee tot drie millimeter aan elke kant. Plaats er vier tot vijf van deze stukken in een wegwerpbare gedesintegreerde medicon samen met een milliliter gesupplementeerd D en verwerk in het meta-machinesysteem gedurende 50 seconden. Elke medische eenheid bevat een vaste roestvrijstalen scherm met ongeveer honderd zeshoekige gaten omgeven door zes microblades.

Het weefsel wordt naar elk gat gebracht door een metalen rotor in de medicon-kamer en gedesintegreerd door over de puntige gaten te passeren en door het metalen scherm terwijl een micropomp onder het scherm vloeistof toevoert en de holtes uitspoelt. Haal het resultaat in celsuspensie uit de medicon met een drie- tot vijf millimeter spuit zonder naald. Week vervolgens een 50 micrometer falcon of gelijkwaardig nylon gaas van vier grootte met een halve milliliter medium en filter de suspensie erdoorheen.

Herhaal de stap, maar gebruik een 25 micrometer nylon gaas of equivalent falcon-unit en plaats op ijs, neem een ALI-citaat van de celsuspensie om in een noyer-kamer te tellen en pas de cellulaire concentratie aan tot een tot twee keer 10 tot de zeven cellen per milliliter in kweekmedium. Voeg ten slotte NDA toe tot een eindconcentratie van 0,2% om celpomp en ook spierverstopping tijdens volgende flowstudies te voorkomen. Als cellevensvatbaarheid moet worden geëvalueerd, kan dit worden uitgevoerd door middel van de live dead viability kit voor dierlijke cellen volgens de instructies van de fabrikant voorafgaand aan flowcytometrische analyse, voeg een fluorescerende kleurstof toe.

De fluorochroomkeuze hangt af van beschikbare lasers. In deze demonstratie wordt het gebruik van verschillende kleurstoffen die document binden aan DNA getoond. Hoewel propidium jodiumdiet de gebruikelijke kleurstof is voor vaste of dode cellen bij lage concentraties, hebben we ontdekt dat wanneer het in hoge concentraties wordt gebruikt, de ROM onbevestigde testiculaire cellen in de suspensies binnenkomt die zijn bereid met de hier gepresenteerde methode.

Dit is waarschijnlijk te wijten aan de mechanische stress die wordt geïmpliceerd, wat in combinatie met de sensorische aard van het semiale epitheel kan leiden tot breuk van cel-naar-cel verbindingsbruggen met minimale manipulatie. Voor propidium jodide-kleuring 10 minuten vóór de monsteranalyse op de oplossing met een eindconcentratie van 50 microgram per milliliter naar de celsuspensie en incubeer bij nul graden Celsius in het donker. Voor het analyseren van propidium mu-kleuringscellen. Voor verdere sortering gebruiken we een fax vantage flowcytometer uitgerust met een coherente targon-ionlaser afgestemd op emissie bij 488 nanometer. Laservermogen is ingesteld op honderd milliwatt en de geëmitteerde propidium I-fluorescentie wordt verzameld op een FL twee-detector met behulp van een 5 7 5 slash 26 bandpass-filter.

Gebruik een 70 micrometer mondstuk voor flowcytometrie metingen en squa-software om de volgende parameters te analyseren. Voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing, totale uitgezonden fluorescentie of pulsgebied en duur van fluorescente emissie of pulsbreedte. De resultaten worden gepresenteerd in grammen die het aantal gebeurtenissen op elk fluorescentieniveau voorstellen en in D-plots die zijwaartse verstrooiing versus fluorescentiepulsgebied en fluorescentiepulsgebied versus de breedte weergeven.

Dubbels worden uitgesloten van de analyse met behulp van DO-plots van fluorescentiepulsgebied versus breedte voor het sorteren van SM-monocytpopulaties met de fax vantage set-sorteermodus in normale R of normale C en gebruik drie gesorteerd druppels als envelop. Pas de differentiële monster aan om cellen te analyseren met een snelheid van 500 tot 1500 per seconde. Houd monster- en opvangbuisjes drie tot vier graden Celsius door een koeleenheid te gebruiken.

Alternatief kunnen cellen in de suspensie worden gekleurd met andere fluorochromen. Bijvoorbeeld, de vitale kleurstof. HER 3 3 3 4 2 kan worden gebruikt tot een