Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

In deze video wordt een zeer eenvoudig en efficiënt protocol gepresenteerd om binnen slechts 15 minuten een cellsuspensie van testmateriaal van knaagdieren te verkrijgen. De methode is toegepast op testmateriaal van muizen, ratten en cavia's en maakt gebruik van een meta-machine apparaat om het ingekapselde weefsel te desaggregeren. Na filtratie en kleuring is de cellsuspensie gereed voor flowcytometrie.

Cyto-analyse of sortering. Homogeniteit van celpopulaties is een voorwaarde voor de analyse van biochemische en moleculaire gebeurtenissen tijdens de differentiatie van mannelijke GA. De heterogeniteit van de testis, met meer dan 30 verschillende celtypen, vormt daarom een van de belangrijkste problemen bij het bestuderen van de moleculaire basis van spermatogenese bij zoogdieren. Om die reden zijn diverse methoden gebruikt om verrijkte of gezuiverde testiscelpopulaties te verkrijgen, waaronder PU en centrifugale illustratie.

De eerste stap voor elke methode voor celseparatie is de bereiding van een celsuspensie. De huidige protocollen zijn echter meestal tijdrovend en kunnen leiden tot verlies van kortlevende moleculen zoals RNA's, wat ongewenst is voor latere expressieanalyses. Het belangrijkste voordeel van het hier gepresenteerde protocol is dat het stappen tussen het offeren van het dier en sperma-stadiumspecifieke moleculaire studies elimineert, terwijl het tegelijkertijd een goede kwaliteit en een uitstekende representatie van celtypen in de celsuspensies waarborgt.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Ana Rodriguez, onderzoeker bij AL Laboratory die de methode heeft ontwikkeld, en Federico San Lopez flow cytometry, die verantwoordelijk waren voor de cytometrische analyse. Voor de procedure is een klein stuk apparatuur nodig, het meach-systeem, met de bijbehorende medicon- en fcon-accessoires. De fcon-accessoires kunnen echter probleemloos worden vervangen door nylon membranen met dezelfde poriegrootte.

De enige overige benodigde materialen en reagentia zijn een glazen spreider, twee petrischalen, een schaar en een pincet, een spuit van drie tot vijf milliliter, een bowel chamber, DMM-kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en NDA. Indien er downstream-applicaties zijn gepland waarbij RNA-manipulaties worden uitgevoerd, moeten alle materialen en oplossingen dienovereenkomstig worden behandeld om het protocol uit te voeren. Plaats de gedissecteerde testis in een glazen petrischaal van 96 millimeter op ijs, met 10 milliliter aangevuld, gekoeld dm.

Verwijder de TAL Virginia en snijd de gedecapeerde testis in vierkante stukjes van twee tot drie millimeter aan elke zijde. Plaats vier tot vijf van deze stukjes in een wegwerpbare, gedesegregeerde medicon samen met één milliliter code-gesupplementeerde D en verwerk dit in het meta-machinesysteem gedurende 50 seconden. Elke medicon-unit bevat een vast roestvrijstalen scherm met ongeveer honderd zeshoekige gaten, omringd door zes microbladen.

Het weefsel wordt door een metalen rotor in de medicon-kamer naar elk gat gebracht en gedesaggregeerd door over de scherpe gaten en door het metalen scherm te passeren, terwijl een micropomp onder het scherm vloeistof toevoert en de vliezen wegspoelt. Verzamel het resultaat in celsuspensie uit de medicon met een spuit van drie tot vijf millimeter zonder naald. Week vervolgens een nylon gaas van 50 micrometer in een falcon-buis of een vergelijkbare maat en filter de suspensie hierdoor met behulp van een halve milliliter medium.

Herhaal de stap, maar gebruik een nylon gaas van 25 micrometer of een equivalente falcon-unit en plaats deze op ijs. Neem een aliquot van de celsuspensie om te tellen in een neubauer-kamer en stel de celconcentratie in op één tot twee keer 10⁷ cellen per milliliter in kweekmedium. Voeg ten slotte NDA toe tot een eindconcentratie van 0,2% om celklontering te voorkomen en om verstoppingen van het systeem tijdens daaropvolgende flow-studies te vermijden. Indien de celviabiliteit moet worden geëvalueerd, kan dit worden gedaan met de live/dead viability kit voor dierlijke cellen; voeg voorafgaand aan de flowcytometrische analyse een fluorescerende kleurstof toe volgens de instructies van de fabrikant.

De keuze van het fluorochroom hangt af van de beschikbare lasers. In deze demonstratie wordt het gebruik van verschillende kleurstoffen getoond die binden aan DNA. Hoewel propidiumjodide de gebruikelijke kleurstof is voor gefixeerde of dode cellen bij lage concentraties, hebben we vastgesteld dat bij gebruik van hoge concentraties de kleurstof ongefixeerde testiculaire cellen binnendringt in de suspensies die zijn bereid volgens de hier gepresenteerde methode.

Dit is waarschijnlijk te wijten aan de veroorzaakte mechanische stress, die in combinatie met de sensorische aard van het seminale epitheel kan leiden tot het breken van de cel-celverbindingen bij minimale manipulatie. Voor kleuring met propidiumjodide wordt 10 minuten vóór de monsteranalyse een oplossing met een eindconcentratie van 50 µg/mL toegevoegd aan de celsuspensie, waarna deze wordt geïncubeerd bij 0 °C in het donker om de cellen met propidiumjodide te analyseren. Voor verdere sortering gebruiken we een FACS Vantage flowcytometer uitgerust met een coherente argon-ionlaser die is afgestemd op emissie bij 488 nm. Het laservermogen is ingesteld op 100 mW en de door propidiumjodide geëmitteerde fluorescentie wordt opgevangen door een FL2-detector met een 575/26 banddoorlaatfilter.

Gebruik een nozzle van 70 micrometer voor flowcytometrie-metingen en squa-software om de volgende parameters te analyseren: forward scatter, side scatter, totale geëmitteerde fluorescentie of pulsoppervlakte en de duur van fluorescente emissies of pulsbreedte. De resultaten worden gepresenteerd in grammen, die het aantal gebeurtenissen bij elk fluorescentieniveau vertegenwoordigen, en in D-plots die de side scatter versus de fluorescente pulsoppervlakte en de fluorescente pulsoppervlakte versus de breedte ervan weergeven.

Doubletten worden uitgesloten van de analyse met behulp van DO-plots van het fluorescentie-pulsareaal versus de breedte ervan voor het sorteren van SM-monocytenpopulaties, waarbij de fax vantage sorteermodus is ingesteld op normal R of normal C en drie gesorteerde druppels als envelope worden gebruikt. Pas het monsterdifferentiaal aan om cellen te analyseren met een snelheid van 500 tot 1500 per seconde. Houd de monster- en opvangbuisjes op drie tot vier graden celsius door gebruik te maken van een koelunit.

Als alternatief kunnen de cellen in de suspensie worden gekleurd met andere fluorochromen. Bijvoorbeeld kan de vitale kleurstof HER 3 3 3 4 2 worden gebruikt tot een eindconcentratie van 5 µg/mL en gedurende ten minste 10 minuten bij 37 °C lichtbeschermd worden geïncubeerd voor Hirsch.

3, 3, 3, 4, 2 gekleurde monsters. De celanalyse is uitgevoerd met een MO-flowcytometer, uitgerust met een UV-excitatielaser van 25 milliwatt en een nozzle van 70 micrometer. Gebruik Summit 4.3-software of vergelijkbare software om dezelfde parameters te analyseren als eerder aangegeven, waarbij de celsuspensies worden geanalyseerd onder fasecontrastoptiek om de kwaliteit van de suspensies te observeren.

De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn enerzijds dat testiculaire celsuspensies worden geprepareerd met behulp van de machine en anderzijds dat dit slechts 15 minuten in beslag neemt, inclusief de C-sectie van de testis, het snijden van weefsel, homogenisatie, machineverwerking en filtratie; deze tijdsduur is ongeveer een achtste van de tijd die gewoonlijk door andere protocollen in beslag wordt genomen. De kortstondigheid van dit protocol, samen met de minimale handelingen, draagt bij aan het goede behoud van kortlevende macromoleculen, wat cruciaal is wanneer een representatieve steekproef is vereist van de verbindingen die in de oorspronkelijke celpopulatie aanwezig zijn. Omdat de methode minimale handelingen vereist, is deze eenvoudig reproduceerbaar in deze tabel.

De relatieve percentages van de verschillende testiculaire celpopulaties voor zeven onafhankelijke experimenten, uitgevoerd met volwassen ratten en geanalyseerd via flowcytometrie, worden als voorbeeld gepresenteerd om de reproduceerbaarheid van de methode aan te tonen. In tegenstelling tot de meeste momenteel gebruikte methoden voor de bereiding van testiculaire celsuspensies, maakt de hier gepresenteerde methode geen gebruik van enzymatische werking. Hoewel collagenase-druppels in een RNAs, wat de over het algemeen gebruikte enzymen zijn, bijdragen aan een onvoldoende segregatie van het weefsel, kunnen ze de bewaring van macromoleculen van belang beïnvloeden.

Het ontbreken van enzymatische behandelingen bevordert niet alleen de preservatie van RNA en eiwitten, maar maakt een protocol ook goedkoper. Hoewel eerder werd gerapporteerd dat mechanisch bereide celsuspensies sneller klonteren dan getrypsiniseerde suspensies, hebben wij vastgesteld dat dit protocol leidt tot goed gedesegregeerde celsuspensies in afwezigheid van enzymatische werking. De toevoeging van NDA is zeer nuttig gebleken bij het voorkomen van celklontering.

De goede kwaliteit van de suspensies blijkt ook uit de cytometrische analyse van de monsters, gezien het minimale hoeveelheid celdebris die is waargenomen. Volgens gepubliceerde informatie wordt bij ongeveer 13% van de ronde spermatozoën een meerkernige structuur gevonden, zowel wanneer celsuspensies uitsluitend via een mechanische methode worden bereid als in aanwezigheid van trypsine. Echter vertonen veel machinaal bereide suspensies zeer weinig meerkernige cellen, zeer waarschijnlijk door verminderde klontering, aangezien is gesteld dat meerkernige cellen hoofdzakelijk ontstaan als gevolg van weefselmanipulatie.

In deze afbeelding is een voorbeeld te zien van een door een Minced Tissue Device geprepareerde celsuspensie uit rattestikels. Zoals te zien is, zijn de cytoplasma's goed behouden; de relatieve percentages van C2C- en C4C-celpopulaties in door een Minced Tissue Device geprepareerde testiculaire suspensies van verschillende knaagdieren kwamen overeen met die van de intacte testikels.

Dit ondersteunt de aanname dat de hier beschreven methode geen specifiek celtype selectief beschadigt. Verrassend genoeg blijft de representatie van celtypen in veel machinaal bereide suspensies veel beter behouden dan bij de klassieke druppelpreparatiemethoden. Zoals te zien is, wijken de cytografieën verkregen voor de op deze wijze verwerkte testiculaire celsuspensies niet wezenlijk af van eerder gerapporteerde resultaten.

In feite vertonen de verkregen histogrammen en dot plots de drie karakteristieke 4C tot 2C en C testiculaire celpopulaties op basis van DNA-gehalte, evenals de schijnbare sub-haploïde populatie, die de sterk gecondenseerde haploïde spermatozoa vertegenwoordigt. Deze profielen werden respectievelijk waargenomen voor suspensies gekleurd met Hoechst of propidiumjodide, en dit geldt zowel voor volwassen als voor juveniele exemplaren. De sortering van spermatogene cellen is succesvol uitgevoerd met een zuiverheid van meer dan 98%, zowel voor geselecteerde testiculaire populaties op basis van DNA-gehalte als voor subpopulaties met hetzelfde DNA-gehalte maar een verschillend chromatinecondensatieniveau, zoals leptoteen- en pyknotische spermatocyten.

Zoals we konden observeren in de test-suspensies van cavia's, leveren gesorteerde populaties een goede RNA-kwaliteit op aangezien het protocol geen RNA-behandeling omvat; dit maakt studies naar differentiële genexpressie mogelijk, zelfs voor populaties die met propidiumjodide zijn gekleurd. In dat opzicht is het zinvol om eraan te herinneren dat propidiumjodide, in tegenstelling tot andere kleurstoffen, zowel DNA als dubbelstrengs RNA kleurt. Echter, in deze grafieken van een analyse van een testiculaire suspensie van cavia's tonen de vergelijkbare profielen die zijn verkregen met propidiumjodide parallel aan Vibrant Dye Cycle Orange — een essentiële DNA-specifieke kleurstof — aan dat RNA-kleuring de cytometrische histogrampatronen niet significant beïnvloedt.

Deze lijst vat de belangrijkste voordelen van het beschreven protocol samen. De hier beschreven geoptimaliseerde methode maakt het mogelijk om in slechts 15 minuten geschikte testiculaire cel-suspensies voor cytometrische analyse van verschillende spermastadia van knaagdieren voor te bereiden, inclusief testisdissectie, weefsnede en verwerking via het ME-machinesysteem. De kortheid, hogere reproduceerbaarheidskwaliteit en de celtypeproporties in de celsuspensies maken dit een goed alternatief voor andere, meer omslachtige en tijdrovende zelfvoorbereidingstechnieken die momenteel in gebruik zijn.

Bovendien is deze methode, aangezien deze zeer weinig manipulatie vereist en enzymen en detergentia vermijdt, een ideale keuze voor delicate downstream-toepassingen zoals genexpressiestudies.