Name: Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Leer een snelle, enzymvrije methode voor het bereiden van testiculaire celopspensies van knaagdieren met behoud van celviabiliteit en macromoleculen voor stroomcytometrie en genexpressieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door CSIC (I + D project C022) en PEDECIBA. De auteurs willen Mariela Bollati en Valentina Porro bedanken van de Celbiologie Unit (Institut Pasteur de Montevideo) voor hun genereuze medewerking betreffende het MoFlo celsorteerder, en Merial-Montevideo voor zacht verstrekken van alle cavia exemplaren gebruikt in dit project. Figuur 1 werd gereproduceerd met toestemming van Biomed Central, figuren 2 en 3, en tabel 1 met toestemming van S. Karger AG, Basel, en de figuren 4 en 5 werden gereproduceerd of aangepast met toestemming van John Wiley &amp; Sons, Inc (copyright in handen van Wiley- Blackwell, 2011).

1. Bereiding van celsuspensies <ol><li> Offeren het monster te gebruiken naar aanleiding van de aanbevelingen van de gespecialiseerde commissies, zoals IACUC of gelijkwaardig (in Uruguay, de Nationale Commissie voor Dierproeven [CNEA]). In ons geval werd een overdosis pentobarbital toegediend. </li><li> Ontleden de testes volgens standaard goedgekeurde procedures en plaats ze in een 96 mm glazen petrischaal op ijs, met 10 ml ijskoude DMEM aangevuld met 10% foetaal kalf serum. </li><li> Verwijder de tunicaalbuginea en snijd de gedecapsuleerde testes in vierkante stukjes van 2 - 3 mm aan elke kant. </li><li> Deze stukken worden vervolgens in een Medimachine, een geautomatiseerde mechanische maalinrichting waarbij het weefsel wordt opgesplitst in een wegwerpbare eenheid een geperforeerde roestvrij stalen scherm en een metalen rotor. Om dit te doen, plaats 1 ml koude aangevuld DMEM en 4-5 van deze stukken in een 50 um wegwerpeenheid, schakel de disaggregator en proces<html> voor 50 sec na de eenvoudige instructies van de fabrikant. </li><li> Herstellen van de resulterende celsuspensie uit de opsplitsing apparaat met behulp van een 3 - 5 ml spuit zonder naald. </li><li> Filtreer door een 50 um nylon, eerder gedrenkt met 0,5 ml DMEM aangevuld. </li><li> Weer Filter de suspensie op met een doorweekte 25 pm nylon, en plaats op ijs. </li><li> Tellen in een Neubauer kamer en cellulaire concentratie aan te passen aan 1 - 2 x 10 7 cellen / ml met DMEM aangevuld. Ten minste 4 x 10 7 cellen / gram testis materiaal worden gewoonlijk verkregen. </li><li> Voeg tenslotte NDA (2-naftol-6 ,8-disulfonzuur, dikaliumzout) tot een uiteindelijke concentratie van 0,2% om cel klonteren te voorkomen. </li><li> Optioneel: check levensvatbaarheid van de cellen van de testis cel suspensies met een commercieel verkrijgbaar levensvatbaarheid kit voor dierlijke cellen, volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 2. Flowcytometrische Analyse ve_content &quot;&gt; We hebben een Becton-Dickinson FACSVantage flowcytometer met een Coherent argon ion laser afgestemd emitteren bij 488 nm voor de analyse van cellen gekleurd met hoge concentraties van propidiumjodide (PI) worden gebruikt. (De kwestie van PI entree in gefixeerde cellen onder stress is elders 9,10 aangepakt). <ol><li> Voor PI kleuring voeg fluorochroom bij een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml van de celsuspensie en incubeer gedurende 10 min bij 0 ° C in het donker. </li><li> Laservermogen is ingesteld op 100 mW en een 575/26 band pass filter wordt gebruikt om de PI-geëmitteerde fluorescentie te verzamelen in FL2. </li><li> We voeren FC metingen met een 70 um mondstuk. Voor het sorteren spermatocyt bevolking, ingesteld sorteren modus Normal-R of Normal-C, met 3 naargelang druppels als envelop. Houd monster en collectie buizen op 3 - 4 ° C met behulp van een koelunit. Pas monster differentiële om cellen te analyseren met een snelheid van 500 tot 1500 per seconde. </li><li> Gebruik CellQuest software (BD) te analyserende volgende parameters: voorwaartse verstrooiing (FSC-H), zijwaartse verstrooiing (SSC-H); totaal uitgezonden fluorescentie of pulse-gebied (FL2-A), en de duur van de fluorescentie-emissie of pulse-width (FL2-W). </li></ol> Als alternatief hebben we de vitale kleurstof Hoechst 33342 toegepast om een ​​uiteindelijke concentratie van 5 ug / ml en gedurende 10 min bij 37 ° C in het donker. Cell analyse werd uitgevoerd door middel van een MoFlo cytometer (DakoCytomation) met een UV excitatie golflengte laser ingesteld op 25 mW en met een 70 um nozzle. Data manipulatie werd uitgevoerd met Summit v4.3 software (DakoCytomation).

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

De geoptimaliseerde hier beschreven methode maakt de bereiding van celsuspensies van knaagdieren testisweefsel in een zeer snelle en reproduceerbare wijze voorkomen enzym en detergensbehandeling en onderhouden goede celintegriteit en soort verhoudingen. De korte duur van de procedure (de 15 min overspanning omvat testis dissectie, weefsel snijdende en verwerking), minimaal hanteren van toepassing en geen enzymatische behandelingen zijn enkele van de belangrijkste voordelen. Al deze goed zijn voor de goede conservering v...

<table><tbody><tr><td>Medimachine systeem</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>Medicon eenheid (50 &mu;m)</td><td>BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon eenheid (50 &mu;m)</td><td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Voorraad oplossing 5 mg/ml; gebruikt bij een eindconcentratie van 5 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>287075</td><td>Voorraad oplossing 1 mg/ml; gebruikt bij een eindconcentratie van 50 &mu;g/ml</td></tr></tbody></table>

eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels cell schorsingen

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Zoogdieren testes zijn zeer complexe organen die meer dan 30 verschillende soorten cellen, waaronder somatische testiculaire cellen en de verschillende stadia van germlinecellen bevatten. Deze heterogeniteit is een belangrijk nadeel met betrekking tot de studie van de grondslagen van zoogdieren spermatogenese, zoals zuivere of verrijkte celpopulaties in bepaalde stadia van spermaontwikkeling nodig voor twee moleculaire analyses 1. Verschillende strategieën zoals Staput 2,3 centrifugale elutriatie 1 en flowcytometrie (FC) 4,5 zijn gebruikt om verrijkte of gezuiverde celpopulaties testicular verkrijgen om differentiële genexpressie studies mogelijk. Het is vereist dat cellen in suspensie meeste verrijking / zuivering benaderingen. Idealiter zal de celsuspensie vertegenwoordiger van het oorspronkelijke weefsel, een hoog percentage levensvatbare cellen en enkele multinucleates - die meestal gevormd door desyncytieel aard van de seminifereus epitheel 6,7 - en gebrek celklonten 1. Eerdere rapporten had aangetoond dat testiculaire celsuspensies bereid door een uitsluitend mechanische methode samengeklonterd gemakkelijker dan getrypsiniseerde degenen 1. Anderzijds, enzymatische behandelingen met RNAsen en / of disaggregeren enzymen zoals trypsine en collagenase leiden tot specifieke macromoleculen afbraak, hetgeen ongewenst is voor bepaalde verdere toepassingen. De ideale proces moet zo kort mogelijk zijn en op minimaal manipulatie, teneinde een goede bewaring van macromoleculen plaats zoals mRNA bereiken. Huidige protocollen voor de bereiding van celsuspensies van vaste weefsels gewoonlijk tijdrovend, sterk afhankelijk van de operator, en kunnen selectief beschadigen bepaalde celtypen 1,8. De hier gepresenteerde protocol combineert de voordelen van een zeer reproduceerbare en uiterst korte mechanische disaggregatie met eenbsence enzymatische behandeling, wat leidt tot goede kwaliteit celsuspensies die kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyse en sortering 4 en latere genexpressiestudies 9.

Een voorbeeld van een goed opgesplitste celsuspensie van rattentestikels bereid met de hier beschreven protocol wordt getoond in figuur 1. In vergelijking met enzymatische behandelingen 6,8 en eerder beschreven mechanische uitsplitsing methoden 2, de ene hier gepresenteerde is veel sneller, gaat minder handling, is gemakkelijk reproduceerbaar (niet afhankelijk van de operator), en maakt schaarse celbrokstukken (vooral in vergelijking met andere mechanis...

Een nieuw protocol voor de mechanische voorbehandeling van testiculaire celsuspensies van knaagdieren materiaal vermijden enzymen en wasmiddelen wordt beschreven. De methode is eenvoudig, snel, reproduceerbaar en maakt goede kwaliteit celsuspensies, die geschikt zijn voor flow sorteren en RNA-extractie zijn.

Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

In deze video wordt een zeer eenvoudig en efficiënt protocol gepresenteerd om binnen slechts 15 minuten een cellsuspensie van testmateriaal van knaagdieren te verkrijgen. De methode is toegepast op testmateriaal van muizen, ratten en cavia's en maakt gebruik van een meta-machine apparaat om het ingekapselde weefsel te desaggregeren. Na filtratie en kleuring is de cellsuspensie gereed voor flowcytometrie.Cyto-analyse of sortering. Homogeniteit van celpopulaties is een voorwaarde voor de analyse van biochemische en moleculaire gebeurtenissen tijdens de differentiatie van mannelijke GA. De heterogeniteit van de testis, met meer dan 30 verschillende celtypen, vormt daarom een van de belangrijkste problemen bij het bestuderen van de moleculaire basis van spermatogenese bij zoogdieren. Om die reden zijn diverse methoden gebruikt om verrijkte of gezuiverde testiscelpopulaties te verkrijgen, waaronder PU en centrifugale illustratie.De eerste stap voor elke methode voor celseparatie is de bereiding van een celsuspensie. De huidige protocollen zijn echter meestal tijdrovend en kunnen leiden tot verlies van kortlevende moleculen zoals RNA's, wat ongewenst is voor latere expressieanalyses. Het

simple-efficient-technique-for-preparation-testicular-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel aggitation het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op nerual weefsel wordt uitgelegd.

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

This video demonstrates the isolation procedure of Sertoli cells from mouse seminiferous tubules, a component of the testes. Enzymatic digestion and repeated washes promote the release of Sertoli cells into the solution, which can be cultured further for proliferation and growth.

Isolation of Immune Regulatory Sertoli Cells from Mouse Seminiferous Tubules

The video demonstrates the preparation of a single-cell suspension of immune cells from a murine brain tissue. It involves enzymatic digestion to release cells from the brain tissue, followed by density gradient centrifugation to isolate the immune cells based on their densities to obtain the single-cell suspension.

Preparing a Single-Cell Suspension of Immune Cells from Murine Brain Tissue

Een eenvoudige methode voor het afleiden van en onderhouden van SSC en stamceltransplantatie lijnen van volwassen muizen wordt hier gepresenteerd. De werkwijze gebruikt voedingscellen afkomstig van de somatische cel compartiment van de volwassen muis testis. Deze techniek is voor het gemeenschappelijk muizenstammen, inclusief transgene, knock-out en knock-in muizen.

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC&#39;s) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.

Scheiding van spermatogene Cell typen met behulp van STA-PUT Velocity Sedimentatie

Het materiaal hier beschrijft een methode die is ontwikkeld om de driedimensionale chromatinestructuur van testiculaire kiemcellen te behouden. Dit wordt de driedimensionale (3D) diamethode genoemd. Deze methode verbetert de gevoeligheid voor detectie van subnucleaire structuren en is toepasbaar voor immunofluorescentie, DNA en RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Diavoorbereidingsmethode om driedimensionale chromatinearchitectuur van testiculaire kiemcellen te behouden

Primaire Sertoli cellen nodig zijn voor het bestuderen van testis-immune privilege, signaaltransductie tijdens ontsteking of infectie, en het gebruik van hun immunobeschermende eigenschappen. Hier beschrijven we een enzym-gebaseerd protocol voor de isolatie van zeer zuivere primaire Sertoli cellen en peritubulaire cellen van ratten testes.

Isolatie van Sertoli cellen en peritubulaire Cellen van Rat Testikels

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Leer een snelle, enzymvrije methode voor het bereiden van testiculaire celopspensies van knaagdieren met behoud van celviabiliteit en macromoleculen voor stroomcytometrie en genexpressieonderzoek.

Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

Meer video's verkennen