Name: Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Leer elektrofysiologische opname in de voorhersenen van larven van Danio rerio voor epilepsieonderzoek. Deze methode maakt monitoring van aanvalachtige hersenactiviteit in levende dieren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur wil Peter Castro en Matthew Dinday bedanken voor hun vroege pogingen om zebravis te vestigen in het laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health EUREKA subsidie ​​(# R01NS079214-01).

1. Ei en afhaling <ol><li> Zebravis veeteelt volgt standaardprocedures eerder beschreven 8. In het kort worden volwassen zebravis opgericht in kweekbakken met verdeelschotten op zijn plaats. Wanneer de verlichting in de kamer komen op de volgende ochtend, worden verdelers uit kweekbakken en vis zijn ongeveer 20 tot 60 minuten van de ongestoorde paartijd toegestaan. </li><li> Eieren van de fokkerij tanks worden verzameld in een zeef en gespoeld met ei water. Eieren worden vervolgens overgebracht naar een petrischaal met ei water. Onbevruchte eieren en vuil worden verwijderd met een transferpipet. </li><li> Place petrischaal de verzamelde eieren in een incubator (28-32 ° C). Na eitjes komen, ongeveer twee dagen na de bevruchting (DPF), verwijder chorion en alle ander vuil met een transfer pipet. </li><li> Op gewenste dagen na de bevruchting (3 tot 8 dpf) verwijderen petrischaal met vrij zwemmen larven en plaats op laboratoriumtafel bij kamertemperatuur. </li></ol><ol><li> Met behulp van een micropipet trekker, trek een 1,2 mm OD borosilicaatglas in twee naalden en bewaar ze op een 150 mm petrischaal of lege pipet box capillair door het leggen van meer dan Silly Putty hellingen. Naalden kunnen worden getrokken vooraf. OD verschillende glazen capillairen kunnen worden gebruikt afhankelijk van het type versterker headstage beschikbaar. </li><li> Obstructies de micro-elektrode met extracellulaire oplossing (2 M NaCl) met een 1 ml spuit met een Nalgene spuitfilter (4 mm) en Microfil filament (Warner Precision Instruments) gekoppeld. Schud of tik op de bolus in de richting van de naald totdat er weinig of geen luchtbellen blijven. </li></ol> 3. Immobilisatie in Agar <ol><li> Bereid een verse oplossing van 1,2% laag smeltpunt agar in water ei. Plaats agar oplossing in een waterbad bij ~ 37 ° C. </li><li> Bereid een dekglaasje met opname kamer en plaats in de vriezer (5-10 min). De opname kamer moet MATCh dat gebruikt op de elektrofysiologie rig. We maken gebruik van een low-profile open ruitvormige bad imaging kamer van Warner Instruments (Model RC-26GLP). </li><li> Met behulp van een Pasteur pipet of overdracht, plaats een larvale zebravis in een klein druppeltje van ei water in een schone petrischaal plaat. Deze druppel, voeg een druppel oplossing die een anestheticum (0,02% tricaine) en verlammende agent (1 mg / ml α-bungarotoxin). </li><li> Monitor zebravis voor het verlies van beweging (5 tot 10 min). </li><li> Verwijder het dekglaasje / opname kamer uit de vriezer. Plaats kamer op het podium van een stereomicroscoop. Met een transferpipet Meng enkele milliliters 1,2% laag smeltpunt agarose met druppeltje en overdracht oplossing (vis) het dekglaasje / opname kamer. </li><li> Met een pipetpunt of fijne stompe naald positie larven onder de stereomicroscoop zodat het dorsale aspect van de vis is blootgesteld aan de agarose gel oppervlak. Laat agarose uitharden (5-10 min), vervolgens met behulp van een platte spatel overdracht van de agar bvergrendelen om een ​​opname kamer opgezet op een elektrofysiologie rig. </li></ol> 3. Extracellulaire Field Recording <ol><li> Voeg 2-5 ml zebravis opnamemedium de opname kamer. Als drug wijzigingen nodig zijn, perfuseren kamer met opname oplossing bij een snelheid van ongeveer 1 ml / min. Nr. oxygenatie van de opname oplossing nodig. </li><li> Plaats een micro-elektrode (ongeveer 1 pm tip diameter, 2-7 MQ) in de versterker headstage gemonteerd op een driedimensionaal micromanipulator. Controleer of de micromanipulator in de juiste positie om een ​​bewegingsbereik en aanpassing. Breng de micro-elektrode tip in het vlak van uitzicht op de microscoop, hoog boven het podium, en het gebruik van grove afstelling lagere naar een punt net boven en iets in de voorkant van het hoofd van de zebravis. </li><li> Met de versterker in &quot;current-clamp&quot; mode nul de elektrode. </li><li> Met behulp van grove instelling lager de punt van de elektrode, zodat het net raakt de surface van de zebravis, iets voor de voorhersenen. </li><li> Met behulp van fijne afstelling stappen vooraf de punt van de elektrode tot het puncties de huid van de zebravis. Laat het bezinken en de elektrode vooraf enkele microns in voorhersenen. </li><li> Noteer elektrische activiteit in de huidige-klem modus met behulp van Axoscope software. De gegevens worden verkregen bij een bemonsteringsfrequentie van 10 kHz. </li></ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De extracellulaire methode hier gepresenteerde maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van de hersenactiviteit. Deze opnames zijn analoog aan elektro-encefalogram (EEG) monitoring vaak gebruikt om de aanwezigheid van abnormale elektrische ontlading (dat wil zeggen, in beslag) in diermodellen voor epilepsie 11 en patiënten van 12 te evalueren. Extracellulaire opnamen kunnen worden gecombineerd met farmacologische manipulaties, zoals hier getoond. Deze soorten opnamen kunnen ook worden ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Agarose laag smeltpunt </td><td> Fisher-Wetenschappelijke </td><td> BP1360-100 </td><td> Los op in embryo media op 1,2% </td></tr><tr><td> Opnamemedia </td><td> Fisher-Wetenschappelijke </td><td> BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 </td><td> 1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 10 mM dextrose, 2,1 mM CaCl2 pH op ongeveer 7,3 met 1 N NaOH </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Argent Labs </td><td> MS-222 </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 2133 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Capillaire buis van glas </td><td> Warner Instruments </td><td> G120TF-3 </td><td> Trek aan een weerstand van 2 -7 MQ </td></tr><tr><td> Patch-clamp-versterker </td><td> Warner Instruments </td><td> PC-505B </td><td> We gebruiken een Warner versterker in de huidige-klem-modus; Gain ingesteld op 2 mV / Pa en Bessel-filter ingesteld op 2K. Vergelijkbare modellen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. </td></tr><tr><td> Filter / versterker </td><td> Cygnus Technologie </td><td> FLA-01 </td><td> We gebruiken een Cygnus voorversterker; Gain vastgesteld op 10-20; Cut-off frequentie in te stellen op 1-2K; Notch filter IN. Vergelijkbare modellen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. </td></tr><tr><td> Axon A / D-board en Axoscope software </td><td> Molecular Devices </td><td> Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2 </td><td> De gegevens worden verzameld in Axoscope met behulp van gap-vrij acquisitie modus; bemonstering op 10 kHz. Vergelijkbare modellen en programma&#39;s kunnen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. </td></tr><tr><td> Egg water </td><td&gt; Instant Ocean </td><td></td><td> 3 g Instant Ocean zeezout, 2 ml 0,1% methyleenblauw op in 10 ml gedeïoniseerd water </td></tr></tbody></table>

voorhersenen elektrofysiologische opname in larvale zebravis

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsie treft bijna 3 miljoen mensen in de Verenigde Staten en tot 50 miljoen mensen wereldwijd. Gedefinieerd als het optreden van spontane niet-uitgelokte aanvallen, kan epilepsie worden verworven als gevolg van een beschadiging aan de hersenen of een genetische mutatie. Inspanningen om het model aanvallen bij dieren is in de eerste plaats gebruikt verworven beledigingen (convulsieve geneesmiddelen, stimulatie of hersenletsel) en genetische manipulaties (antisense knockdown, homologe recombinatie of transgenese) bij knaagdieren. De zebravis is een gewervelde modelsysteem 1 tot 3, dat een waardevol alternatief voor knaagdieren op basis van epilepsie onderzoek zou kunnen bieden. Zebravissen worden veel gebruikt in de studie van vertebrate genetica of ontwikkeling, een hoge mate van genetische gelijkenis met zoogdieren en drukken homologen voor ~ 85% van bekende menselijke enkel gen mutaties epilepsie. Vanwege hun geringe omvang (4-6 mm in lengte), zebravis larven worden gehandhaafd fluïdumvolumes zo laag als 100 ul tijdens de vroege ontwikkeling en arraYed in multi-well platen. Reagentia kunnen direct worden toegevoegd aan de oplossing waarin embryo&#39;s ontwikkelen, vereenvoudigen toediening en die een snelle in vivo screening van testverbindingen 4. Synthetische oligonucleotiden (morfolino), mutagenese, zinkvinger nuclease en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om snel genereren gen knockdown of mutatie in zebravis 5-7. Deze eigenschappen bieden zebravis studies een ongekende statistische power analyse voordeel ten opzichte van knaagdieren in de studie van neurologische aandoeningen zoals epilepsie. Omdat de &quot;gouden standaard&quot; voor epilepsie onderzoek is het monitoren en analyseren van de abnormale elektrische ontladingen die ontstaan ​​in een centrale structuur van de hersenen (dat wil zeggen, toevallen), een methode om efficiënt op te nemen hersenactiviteit in larvale zebravis wordt hier beschreven. Deze methode is een bewerking van conventionele extracellulaire meettechnieken en zorgt voor een stabiele lange-termijn monitoring van de hersenactiviteit in intacte zebravis larven. Sruime opnames worden getoond voor acute aanvallen geïnduceerd door bad toepassing van convulsieve geneesmiddelen en spontane aanvallen vastgelegd in een genetisch gemodificeerde vis.

Voorbeelden van elektrografische beslag-achtige ontlading opgenomen in de voorhersenen van een agar ingebedde zebravis larven worden getoond in Figuur 1. Grote amplitude multi-spike burst ontlading in deze monsters werd opgewekt door toepassing van een bad convulsant geneesmiddel, 40 mM pilocarpine (in A, 6 dpf) of 1 mM picrotoxin (in B, 8 dpf). In deze opnames geïmmobiliseerd en agar ingebedde zebravissen worden continu bewaakt tot 90 min. Vissen levensvatbaar blijven onder deze opnameomstandigheden to...

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een robuuste<em&gt; In vivo</em&gt; Lees-out van inbeslagneming-achtige activiteit. Deze techniek kan worden gebruikt met genetisch gemodificeerde zebravissen larven die epilepsie genen of aanvallen opgeroepen door toediening van convulsief drugs.

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Het algemene doel van deze procedure is om extracellulaire veldopnames te verkrijgen van de voorhersenen van een intacte larvale zebravis. Dit wordt bereikt door de larvale zebravis eerst te immobiliseren in een arosblok. Vervolgens wordt een opname-micro-elektrode onder directe visualisatie in de voorhersenen geplaatst.De laatste stap is het opnemen van elektrische activiteit in de voorhersenen. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden gebruikt om abnormale elektrografische aanvallenactiviteit in intacte zebravislarven te monitoren. Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik wilde aantonen dat aanvallen konden worden opgewekt in larvale zebravissen. Het houden van zebravissen volgt standaardprocedures die eerder zijn beschreven. In het kort.Volwassen zebravissen worden opgesteld in kweekbakken met verdelers op hun plaats. Wanneer de lichten in de kamer 's ochtends aangaan, worden de verdelers verwijderd en krijgen de vissen 20 tot 60 minuten ongestoorde kweektijd. Eieren worden vervolgens uit de tanks verzameld, overgebracht naar een petrischaal met eierwater en ontdaan van puin met een overdrachtpipet, plaats nu de eieren in een incubator, en in ongeveer twee dagen

forebrain-electrophysiological-recording-in-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het protocol beschrijft de procedure om elektrofysiologie uit te voeren bij volwassen zebravissen. Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van neurale activiteit in vivo.

Volwassen zebravis elektrofysiologie: een methode om de extracellulaire elektrische activiteit van neuronen in vivo te meten

This video demonstrates the recording of electrical signals from the afferent neurons in a paralyzed zebrafish larva by positioning a micropipette near the lateral line ganglion and forming a loose seal for signal capture. The extracellular solution maintains neuronal viability during this process.

Monitoring Electrical Signals from the Afferent Neurons in an Immobilized Zebrafish Larva

In deze video laten we zien hoe de elektrische activiteit van de geïdentificeerde enkele neuronen in een hele brein voorbereiding, waarin complexe neurale circuits behoudt opnemen. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch worden gelabeld met een fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte voorbereiding hersenen.

Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Hier presenteren we een protocol dat de meting van lichte evoked electroretinogram reacties van larvale zebrafish vereenvoudigt. Een roman kegelvormige spons-tip-elektrode kan helpen om de studie van visuele ontwikkeling in larvale zebrafish met behulp van de electroretinogram ERG gemakkelijker te bereiken met betrouwbare resultaten en lagere kosten.

Electroretinogram opname in larvale Zebrafish met behulp van A roman kegel-vormig spons-tip elektrode

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.

In Vivo Beeldvorming van de hele hersenen van zebravislarven met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie

Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.

Calciumbeeldvorming met twee fotonen van de activiteit van de voorhersenen bij zich gedragende volwassen zebravissen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

Leer elektrofysiologische opname in de voorhersenen van larven van Danio rerio voor epilepsieonderzoek. Deze methode maakt monitoring van aanvalachtige hersenactiviteit in levende dieren mogelijk.

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Meer video's verkennen