Name: Drosophila Adult Olfactory Shock Learning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T19:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer geheugentesten bij volwassen Drosophila met een olfactieve schokassay. Deze methode meet associatief leren door geuren te koppelen aan elektrische schokken en het geheugen 24 uur later te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Bloomington voorraad centra voor de vlieg stam. Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​uit onderzoek BBSRC (BB / G008973 / 1).

1 Fly Voorbereiding <ol><li> Outcross alle mutanten, Gal4 / UAS en andere lijnen met een wildtype stam, zoals CSw-, ten minste zes generaties vóór de gedragsexperimenten te controleren voor genetische achtergrond 26. </li><li> Kweek vliegen op een standaard maïsmeel, gist en melasse dieet onder een 00:12 uur licht-donker cyclus bij 25 ° C tenzij specifieke manipulaties vereisen een andere temperatuur. <ol><li> Om de effecten van transgene expressie bepalen: Gebruik 18 ° C om de expressie van transgenen in Gal4 GAL80 ts (TARGET-systeem) door middel van ontwikkeling te voorkomen en vervolgens naar de vliegen tot een 30 ° C incubator 1-2 dagen voor de gedrags-experiment. Uitvoeren van het experiment bij 30 ° C om de effecten van transgene expressie 3,4,6,7,14 bepalen. </li><li> Voor experimenten met warm geactiveerde TRPA1 kanalen neuronen stimuleert Til de vliegen bij 23 ° C, hetgeen een temperatuur bekendeen inactieve kanaal behouden en vervolgens verschuiven naar een gedrag kamer bij 30 ° C om de TRPA1 expressie neuronen activeren. </li><li> Voor experimenten met Shibire temperatuur gevoelig voor synaptische uitgang 11, 14,24 blokkeren: Achter de vliegen bij 18 ° C en uit te voeren testen bij 30 ° C. </li></ol></li><li> Verzamel de vliegen 1-2 dagen voor het experiment en tel ze in groepen van ongeveer 25 onder lichte CO 2 anesthesie. Bewaar de vliegen tenminste O / N in levensmiddelen flacons (zonder gist) bij 25 ° C (tenzij er specifieke manipulaties vereist een andere temperatuur) en 70% relatieve vochtigheid in een milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte met 00:12 uur licht: donker totdat de tijd van het experiment. Opmerking: Deze opslag laat de vliegen om te acclimatiseren aan het verder leren-test uitgevoerd in de milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte, die de optimale omstandigheden voor Drosophila leren had en, belangrijker nog, verwijdert alle dagelijkse ENVIronmental variaties die de gedragsfenotype zou hebben beïnvloed. </li></ol> 2 Voorbereiding voor het experiment <ol><li> Voer de experimenten in een maat Perspex T-doolhof (figuur 1). </li><li> Controleer regelmatig de buis aanbrengen om ervoor te zorgen dat een luchtdichte afdichting wordt verkregen tijdens het experiment. Wijzig indien nodig de O-ringen die de compartimenten van de T-doolhof te dichten. </li><li> Plaats op maat gemaakte koperen roosters in de training buizen. Controleer en reinig deze netten regelmatig en vervang deze indien geoxideerd. Bevestig de koperen roosters draden via krokodillebekken die lopen een schakelkast verbonden met een elektrische stimulator. Gebruik een voltmeter om te waarborgen dat de inrichting de verlangde shock. </li><li> Gebruik G-klemmen om het doolhof stevig vasthouden om de lucht lekkage te voorkomen. </li><li> Bevestig de T-doolhof aan buizen die loopt op een luchtpomp, zodat geuren over de vliegen aan te trekken en vervolgens van de T-doolhof verwijderd. Onderhouden milde luchtvloei bij ~ 2 L / min </li></ol> 3 Geur verdunningen <ol><li> Gebruik twee verschillende geuren in concentraties zodanig dat de vliegen tonen een gelijke voorkeur beide geuren. Gebruik 4-methylcyclohexanol (1:67) en 3-octanol (1: 100) verdund in minerale olie 7,13. Let op: bepaal zorgvuldig deze concentraties, die verschillen per laboratorium. Bijvoorbeeld anderen gebruiken 01:10 beide geuren 24. Andere veel gebruikte geuren omvatten ethylacetaat en iso-amyl acetaat. </li><li> Pipetteer 30 ul van de verdunde geur een maat geur cup geplaatst in een geur blok onder een plastic buis met een geperforeerde top waarmee lucht via geur in de beker te trekken, waardoor de vliegen blootstellen aan een geur pluim. </li></ol> 4 Training Protocol (figuren 1 en 2) <ol><li> Voor volwassen olfactorische shock conditionering, presteren alle experimenten onder een gedimd rood licht (dwz., Rode LED), die het mogelijk maakt de onderzoeker om te zien, maar voorkomt dat de fly van het zien, waardoor de vliegen te concentreren op reukzin tegenover visuele inputs. </li><li> Introduceren de vliegen in de opleiding buis en dan hechten aan de T-doolhof en hen in staat stellen zich aan te passen aan de buis en de luchtstroom gedurende 90 sec. </li><li> Presenteer de eerste geur (4-methylcyclohexanol, MCH) met een 60-V shock (bestaande uit twaalf 1.25 sec pulsen met 3.75 sec inter-puls interval) voor een totale duur van 60 sec. </li><li> Volg de schok met een 30 seconden rustperiode zonder geur of shock. </li><li> Presenteer de tweede geur (3-octanol, oktober) gedurende 60 seconden zonder een schok. </li><li> Volg de schok met een 30 seconden rustperiode zonder geur of shock. </li><li> Beweeg de vliegen van de training kamer in de centrale kamer van het T-doolhof door de T-doolhof op zijn kant en voorzichtig slaande de onderkant van het T-doolhof op een zachte ondergrond zoals een oude muis mat. Handhaaf de vliegen in de centrale kamer voor 90 sec. </li><li> Bevestig de keuze buizen in de bottom van de inrichting op de T-labyrint vormen. </li><li> Om het leren te meten, verplaatsen de vliegen om de keuze van het T-doolhof, waar ze tegelijkertijd werden blootgesteld aan zowel de geuren en de stap naar een. Voer een testperiode van 120 sec. </li><li> Trap de vliegen in de keuze buizen door omhoog schuiven van de centrale kamer waardoor het blokkeren van de uiteinden van de buizen keuze. Verzamel de vliegen in elke arm van het T-doolhof en in het centrale compartiment in voedsel flesjes en tellen. </li><li> Om het geheugen te meten, verzamelen de vliegen na de training (4,6) en over te brengen van de T-doolhof om voedsel flacons zonder gist. WINKEL vliegt in het donker bij 25 ° C en 70% vochtigheid gedurende de resterende tijd die nodig is om het geheugen fase plaats bepalen (zie inleiding). Opnieuw de vliegen de T-doolhof als in stap 4.7. </li><li> Voor de lange-termijn geheugen, gebruik dan een op maat gebouwde doolhof die het mogelijk maakt verschillende batches van vliegen tegelijk worden opgeleid. Dien 5 cycli van de opleiding met een 15 min inter-cyclus interval (spaCED) of zonder een inter-cyclus interval (massale). Handhaaf de vliegen bij 18 ° C en 70% vochtigheid in het donker totdat de tests. Voorafgaand aan het testen, bewegen de vliegen tot 25 ° C en laat ze acclimatiseren voor minstens 1 uur. Beoordelen op lange termijn geheugen 24 uur na de training. </li><li> Na de gedragsexperimenten, het reinigen van de geur kopjes met heet water en reukloos wasmiddel. Na het drogen, de vacht van de cups met 10 ul Sigmacote. Droog de Sigmacote door verwarmen in een magnetron. Af en toe reinigen van de T-doolhof perspex buizen en geur blokken met warm water en reukloos wasmiddel. </li></ol> 5 Berekening van de Performance Index: een maatstaf voor Memory the Flies &#39; <ol><li> Bereken de-index (PI) voor elke conditie als het aantal vliegen vermijden van de shock-gepaarde geur (CS -) minus het aantal vliegen de keuze-shock gepaarde geur (CS +) gedeeld door het totale aantal vliegen (CS - + CS +) 1. Performance index (PI) = (# CS - vliegt - # CS + vliegt) / (# totaal vliegen) </li><li> Bereken de laatste PI van het experiment door het middelen van de PI van het experiment waarin MCH was-shock gepaard geur en een waarin oktober was-shock gepaard geur. Dit verwijdert alle vooringenomenheid van de vliegen met een grotere voorkeur voor een geur. </li></ol> 6 Sensomotorische Controls <ol><li> Voeren geur scherpte door de invoering van ~ 40-50 vliegen in de T-doolhof 6,7,17. </li><li> Na 90 sec, bewegen de vliegen om de keuze punt, en laat ze 2 minuten om te kiezen tussen pure geuren en lucht. </li><li> Verzamelen en tel de vliegen. Bereken het percentage vermijden door het totaal aantal vliegen die de geur gekozen door degenen die aan de test. </li><li> Voor shock reactiviteit 6,7,17, introduceren de vliegen in de shock kamer. </li><li> Na 90 seconden rust, bestuurt een 60 V DC elektrische schok, waarvan de vliegen kan ontsnappen naar een soortgelijkebuisje zonder een schok. </li><li> Laat 2 min voor de vliegen om uit te kiezen; verzamelen en tel de vliegen. Bereken het percentage shock voorkomen door het aantal vliegen die de schok voorkomen door te ontsnappen aan de schokbuis door het totale aantal vliegen in het experiment verdelen. Neem de vliegen die nog in de centrale kamer van het totaal van die elektrische schok ontsnapt. </li></ol>

<ol><li>Tully, T., Quinn, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+and+retention+in+normal+and+mutant+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Physiology A. 157, 263-277 (1985).</li>
<li>Bolduc, F. V., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+and+intellectual+disability%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Fruit flies and intellectual disability.</a> Fly (Austin). 3, 91-104 (2009).</li>
<li>McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+olfactory+learning+and+memory+research+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster.</a> Prog Neurobiol. 76, 328-347 (2005).</li>
<li>Keene, A. C., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+olfactory+memory%3A+single+genes+to+complex+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits.</a> Nat Rev Neurosci. 8, 341-354 (2007).</li>
<li>Chiang, H. C., Wang, L., Xie, Z., Yau, A., Zhong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3+kinase+signaling+is+involved+in+Abeta-induced+memory+loss+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">PI3 kinase signaling is involved in Abeta-induced memory loss in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7060-7065 (2010).</li>
<li>Kanellopoulos, A. K., Semelidou, O., Kotini, A. G., Anezaki, M., Skoulakis, E. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+deficits+consequent+to+reduction+of+the+Fragile+X+mental+retardation+protein+result+from+metabotropic+glutamate-mediated+inhibition+of+cAMP+signalling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning and memory deficits consequent to reduction of the Fragile X mental retardation protein result from metabotropic glutamate-mediated inhibition of cAMP signalling in Drosophila.</a> J Neurosci. 32, 13111-13124 (2012).</li>
<li>Malik, B. R., Gillespie, J. M., Hodge, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASK+and+CaMKII+function+in+the+mushroom+body+a%E2%80%99%2F%C3%9F%E2%80%99+neurons+during+Drosophila+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">CASK and CaMKII function in the mushroom body a’/ß’ neurons during Drosophila memory formation.</a> Front Neural Circuits. 7, 52(2013).</li>
<li>Gerber, B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larva+as+a+model+for+studying+chemosensation+and+chemosensory+learning%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review.</a> Chem Senses. 32, 65-89 (2007).</li>
<li>Gillespie, J. M., Hodge, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASK+regulates+CaMKII+autophosphorylation+in+control+of+synaptic+growth+and+appetitive+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CASK regulates CaMKII autophosphorylation in control of synaptic growth and appetitive learning.</a> Front Molecular Neuroscience. 6, 27(2013).</li>
<li>Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appetitive+associative+olfactory+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (72), e4334(2013).</li>
<li>Tonoki, A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+impairs+intermediate-term+behavioral+memory+by+disrupting+the+dorsal+paired+medial+neuron+memory+trace%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Aging impairs intermediate-term behavioral memory by disrupting the dorsal paired medial neuron memory trace.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 6319-6324 (2012).</li>
<li>Yamazaki, D., Horiuchi, J., Nagano, S., Tamura, T., Saitoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+DCO+mutation+suppresses+age-related+memory+impairment+without+affecting+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila DCO mutation suppresses age-related memory impairment without affecting lifespan.</a> Nat Neurosci. 10, 478-484 (2007).</li>
<li>Cavaliere, S., Malik, B. R., Hodge, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+channels+regulate+age-related+memory+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">KCNQ channels regulate age-related memory impairment.</a> PLoS One. 8, e62445(2013).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li>
<li>Isabel, G., Pascual, A., Preat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+consolidated+memory+phases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exclusive consolidated memory phases in Drosophila.</a> Science. 304, 1024-1027 (2004).</li>
<li>Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking+revelations+and+saccharin+sweetness+in+the+study+of+Drosophila+olfactory+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory.</a> Curr Biol. 23, R752-R763 (2013).</li>
<li>Tully, T., Preat, T., Bonyton, S. C., Del Vecchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+consolidated+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila.</a> Cell. 79, 35-47 (1994).</li>
<li>Lyons, L. C., Roman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+short-term+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+memory%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of short-term memory in Drosophila.</a> Learning and memory. 16, 19-27 (2009).</li>
<li>Le Glou, E., Seugnet, L., Shaw, P. J., Preat, T., Gouguel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+consolidated+memory+retrieval+following+sleep+deprivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of consolidated memory retrieval following sleep deprivation in Drosophila.</a> Sleep. 35 (10), 1377-1384 (2012).</li>
<li>Placais, P. Y., Preat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+favour+survival+under+food+shortage%2C+the+brain+disables+costly+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">To favour survival under food shortage, the brain disables costly memory.</a> Science. 339, 440-442 (2012).</li>
<li>Hirano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+launches+CRTC+to+faciltate+long-term+memory+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fasting launches CRTC to faciltate long-term memory formation in Drosophila.</a> Science. 339, 443-446 (2012).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li>
<li>Claridge-Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Writing+memories+with+light-addressable+reinforcement+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry.</a> Cell. 139, 405-415 (2009).</li>
<li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dopamine+pathways+induce+aversive+odor+memories+with+different+stability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Three dopamine pathways induce aversive odor memories with different stability.</a> PLoS Genetics. 8, e1002768(2012).</li>
<li>Connolly, J. B., Tully, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConnolly%2C+JB+%22Drosophila%3A+a+Practical+Approach%22">Drosophila: a Practical Approach</a>. Roberts, D. B. , Oxford University Press. 265-319 (1998).</li>
<li>Connolly, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+disrupted+by+impaired+Gs+signaling+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Associative learning disrupted by impaired Gs signaling in Drosophila mushroom bodies.</a> Science. 274, 2104-2107 (1996).</li>
<li>Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traces+of+Drosophila+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Traces of Drosophila memory.</a> Neuron. 70, 8-19 (2011).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+synaptic+transmission+in+adult+Drosophila+kenyon+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila kenyon cells in situ.</a> J Neurosci. 26, 265-272 (2006).</li>
<li>Young, J. M., Wessnitzer, J., Armstrong, J. D., Webb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+and+non-elemental+olfactory+learning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Elemental and non-elemental olfactory learning in Drosophila.</a> Neurobiol Learn Mem. 96, 339-353 (2011).</li>
<li>Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. .A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+model+for+alcohol+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila model for alcohol reward.</a> Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).</li>
<li>Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+reveals+neural+circuit+mechanisms+of+fly+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine reveals neural circuit mechanisms of fly memory.</a> Trends Neurosci. 33, 457-464 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De Drosophila volwassen olfactorische shock leren test hier gepresenteerde maakt een analyse van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de verschillende fasen van het geheugen, inclusief lange-termijn geheugen 15-17. Evenals de bepaling van het effect van de circadiane ritmes 18, slapen 19, dieet 20,21, veroudering 11-13, neurodegeneratieve ziekte 5 en medicamenteuze behandelingen 5,6,19 op het geheugen. Vele krachtige benaderingen zijn recent ontwikkeld voor de functionele beeldvorming van de neurale circuits die olfactorische geheugen vliegen 3,4,7,11,16,27 mediëren. Deze optogenetische technieken gebruik maken van de enorme repertoire van de verschillende promotors beschikbaar in Drosophila 14,16. Deze promoters worden gebruikt om genetisch gecodeerde calcium en cAMP reporters in het geheugen neuronen 16,27 drukken om het effect van specifieke genmutaties studie over herinneringssporen. The gebruik van voorwaardelijke promoters en mutaties bij volwassenen maakt het onderzoek mogelijk van de postontwikkelingsonderzoek rol van een genproduct in geheugen 3,4,6,7,13,14. Visualisatie gedragsbenaderingen te combineren met lichte en warmte geactiveerde kanalen stimuleren of remmen verschillende neuronen in de geheugenschakeling 11,14,16,22-24 hun functie verder te onderzoeken. Bovendien paddestoel lichaam geheugen neuronen zijn toegankelijk voor whole-cell patch clamp opnamen 28, en wiskundige en computationele technieken worden gebruikt voor het model Drosophila olfactorische geheugen 29. Deze experimentele vooruitgang, in combinatie met de verschillende vormen van associatief geheugen protocollen here ingevoerd, zodat Drosophila worden gebruikt om de moleculair-en circuit-level veranderingen in associatief geheugen die optreden als gevolg van beloning, straf, motivatie, verslaving modelleren, veroudering en ziekte 5,6,11-13,16,30-31.

De hier gepresenteerde methode is beschreven door Tully en Quinn met enkele kleine aanpassingen 1. Het experiment werd uitgevoerd in twee fasen: de vliegen getraind in de eerste fase en de getrainde vliegen worden getest in de tweede fase. Tijdens de training, zijn een groep van vliegen tegelijkertijd blootgesteld aan geur 1 (CS +) en een elektrische schok (US) in een training buis. De vliegen dan ontvangt geur 2 (CS -) zonder een elektrische schok. Deze single koppeling van een bepaalde geur met een schok wordt genoemd 1-cyclus opleidingen, en de geuren die het meest worden gebruikt zijn 4-methylcyclohexanol (MCH) en 3-octanol (OCT). Een cyclus training leidt tot de vorming van een labiele fase geheugen dat kan worden gedetecteerd tot 7 uur; echter, wordt het geheugen meestal onmiddellijk getest om te bepalen wat wordt genoemd het leren, de verwerving of 2 min geheugen. Geheugen gemeten bij 30 min of 1 uur is bedoeld als korte-termijn geheugen, terwijl3 hr geheugen wordt aangeduid als tussentijdse geheugen. De blootstelling van vliegen om repetitieve training cycli met openingen tussen de opleiding cycli (gespreid opleiding) leidt tot een geconsolideerde vorm van lange-termijn geheugen, dat is CREB transcriptie afhankelijk en duurt maximaal een week. Training zonder gaten (massale training) leidt tot de vorming van anesthesie-resistente geheugen (ARM), die vergelijkbaar langetermijngeheugen wordt meestal gemeten 24 uur na 5 cycli van training 7,13,15-17,20,21. Met deze benadering kan het effect van verschillende genmutaties op deze verschillende fasen van het geheugen worden bepaald. De promotor gedreven uitdrukking van licht-of temperatuurgevoelige transgenen te activeren of blokkeren van de neurale activiteit van specifieke neuronen maakt het mogelijk om te onderzoeken welke neuronen nodig zijn voor het geheugen acquisitie, consolidatie en retrieval 3,4,11,15,16,20, 22-24. Geheugen op 1 uur wordt meestal gemeten bij het bestuderen van leeftijd gerelateerde geheugenverlies, omdat deze form van het geheugen lijkt bijzonder kwetsbaar voor de gevolgen van de vergrijzing 11-13. Een reeks gedrags-en genetische Controles die met geheugen experimenten, bijvoorbeeld, te bepalen of een prestatie defect is door een centraal geheugen defect of perifere sensorische gebrek dat de vlieg voorkomt waarnemen van de schok of olfactorische cue 5 -7, 1 7, 25,26.

<table><tbody><tr><td>3-Octanol</td><td>Sigma</td><td>218405</td><td></td></tr><tr><td>4-Methyl cyclohexanol</td><td>Sigma</td><td>15309-5</td><td></td></tr><tr><td>Benzaldehyde</td><td>Sigma</td><td>418099</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Fluka</td><td>BP2629-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexyl acetate</td><td>Sigma</td><td>108154</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>Sigma</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila adult olfactory shock learning

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila zijn gebruikt in klassieke conditionering experimenten meer dan 40 jaar, dus sterk ons begrip van het geheugen te bevorderen, met inbegrip van de opheldering van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij cognitieve aandoeningen 1-7. Leren en geheugen kunnen worden getest in larven het effect van neurologische genen 8-10 bestuderen en vliegt de bijdrage van volwassen plasticiteit genen 1-7 meten. Bovendien, de korte levensduur van Drosophila vergemakkelijkt de analyse van genen mediëren leeftijd gerelateerde geheugenstoornis 5,11-13. De beschikbaarheid van verschillende induceerbare promoters die het Drosophila zenuwstelsel verdelen maakt het mogelijk om te bepalen wanneer een gen van belang wordt vereist voor normaal geheugen en relay verschillende aspecten van de versterkingssignaal 3,4,14,16. Studeren geheugen bij volwassen Drosophila zorgt voor een gedetailleerde analyse van degedrag en circuits betrokken en een meting van lange-termijngeheugen 15 -17. De lengte van het volwassen stadium geschikt genetische, gedrags-, dieet en farmacologische manipulaties geheugen langere termijn, naast bepalen van het effect van veroudering en neurodegeneratieve ziekten geheugen 3-6,11-13,15-21. Klassieke conditionering wordt veroorzaakt door de gelijktijdige presentatie van een neutrale geur cue (geconditioneerde stimulus, CS +) en een versterking stimulus, bijvoorbeeld., Een elektrische schok of sucrose, (ongeconditioneerde stimulus, VS), die geassocieerd worden met elkaar door het dier 1,16. Een tweede geconditioneerde stimulus (CS -) wordt vervolgens weergegeven zonder de VS. Tijdens de testfase, worden Drosophila gelijktijdig gepresenteerd met CS + en CS-geuren. Nadat de Drosophila worden voorzien tijd om te kiezen tussen de geuren, is de verdeling van de dieren geregistreerd. Deze procedure aldieptepunten associatieve aversieve of appetitief conditionering betrouwbare wijze te meten zonder vertekening die door de aangeboren voorkeur voor een van de geconditioneerde stimuli. Verschillende controle-experimenten worden ook uitgevoerd om te testen of alle genotypen reageren normaal op geur en wapening alleen.

De prestatie-index (PI) dient als een maat van het geheugen. Tabel 1 illustreert een representatieve berekening van PI. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCH gepaard met shock </td><td> 3-oktober gepaard met shock </td></tr><tr><td> Vliegen vermijden MCH (in oktober buis) = 80 Vliegen liever MCH (in MCH buis) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6 </td><td> Vliegen vermijden oktober (in MCH buis) = 75 Vliegen liever oktober (in oktober buis) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0.5 </td></tr><tr><td> PI van het experiment = (0,6 + 0,5) /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1: Een vertegenwoordiger berekening van de prestatie-index met illustratieve gegevens. Prestatie-indices voor de verschillende experimenten is te vergelijken met het geheugen effecten op te helderen. Zodra dezevergelijking wordt getoond in figuur 3, waarin het resultaat van een reeks experimenten uitgevoerd met wildtype Canton S volwassen vliegen (WT) en dunce leren mutant volwassen vliegen 1 bevat. Het gemiddelde van 10 PI&#39;s is voorzien, met fout bars die de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Deze resultaten demonstreren dat dunce vliegen tonen een vermindering leren opzichte van wildtype. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> Figuur 1 De volwassen experimentele opstelling. De vliegen worden getraind en getest in een T-doolhof. De training behelst opname van een geur Een elektrische schok gevolgd door een tweede geur B zonder elektrische schok. Na een rustperiode in de middelste kamer de vliegen worden met zowel de geuren tegelijk. De vliegen worden gevangenin de twee buizen en verzameld en geteld om te leren / geheugen scores te verkrijgen. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> Figuur 2 De volwassen training protocol. De vliegen zijn opleiding in twee stappen. De eerste stap waar vliegen krijgen een geur (CS +) gekoppeld aan een elektrische schok (US) voor 60 sec. In de volgende stap vliegen ontvangt een tweede geur (CS) zonder elektrische schok. De vliegen worden dan met rust gelaten gedurende 90 seconden waarna ze getest op hun keuze tussen CS + en CS. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> Figuur 3 Een vertegenwoordiger grafiek die domkop en wildtype leren bij volwassen Drosophila. </strong&gt; WT en dunce vliegen werden getest na een sessie van training. Dunce vliegen tonen een vermindering leerproces in vergelijking met de WT (n = 10).

Werkwijze volwassen Drosophila associatief geheugen meten wordt beschreven. De assay is gebaseerd op het vermogen van de vlieg een geur gepresenteerd met een negatieve bekrachtiger (elektrische schok) koppelen en vervolgens oproepen deze informatie op een later tijdstip, waarbij het geheugen te meten.

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Het algemene doel van deze procedure is om het associatieve geheugen te meten met behulp van de olfactorische shock-assay bij volwassen drosophila. Dit wordt bereikt door eerst vliegen te verzamelen onder koolstofdioxide-anesthesie. De tweede stap is om de vliegen gelijktijdig bloot te stellen aan een elektrische schok en een eerste geur A in team A. Vervolgens worden de vliegen blootgesteld aan de tweede geur B zonder schok.Ten slotte worden de vliegen naar het keuzepunt in de T-maze gebracht, waar ze gelijktijdig worden blootgesteld aan zowel geur A als B. Na een distributietijd van twee minuten worden de vliegen die voor geur A kozen en die voor geur B kozen afzonderlijk verzameld en onder koolstofdioxide geteld. Dit maakt de berekening van de prestatie-index (PI) voor elke geur mogelijk. De uiteindelijke PI wordt verkregen door het gemiddelde te nemen van de PI van twee afzonderlijke experimenten: één waarin geur A is gekoppeld aan een schok, en een tweede waarin geur B is gekoppeld aan een schok.Deze methode kan inzicht bieden in het effect van de interne toestand van het dier en het geheugen. Bijvoorbeeld, door de leeftijd, het dieet en de slaap te variëren, kan deze methode ook worden toegepast op andere systemen. Zo is het analoog aan assays voor angstconditionering bij knaagdieren of in een laboratoriumomgeving, aangezien de genen en mechanismen van leren sterk geconserveerd zijn tussen insecten en zoogdieren.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het voorbereiden van de vliegen voor de assay en het vervolgens verplaatsen van de vliegen in en uit de teammates moeilijk aan te leren is en lastig te begrijpen enkel op basis van een geschreven protocol. Om te beginnen: kweek vliegen op een standaard voedingsdieet onder een licht-donkercyclus van 12 uur bij 25 °C. Narcoseer de vliegen één tot twee dagen voor het experiment met kooldioxide en verdeel ze over vier groepen van 25. Bewaar de vliegen gedurende de nacht in voedingsbuisjes zonder gist bij 25 °C en 70% luchtvochtigheid in een gecontroleerde ruimte onder een licht-donkercyclus van 12 uur.Bereid vervolgens een op maat gemaakt Perspex-team MAs voor en controleer regelmatig de fitting van de buis om er zeker van te zijn dat er tijdens het experiment een luchtdichte afsluiting is gewaarborgd; plaats op maat gemaakte koperen roosters in de trainingsbuizen. Reinig de roosters regelmatig en vervang ze als ze geoxideerd raken. Gebruik krokodillenklemmen om de koperen roosters te bevestigen aan draden die lopen naar een schakelkast die is aangesloten op een elektrische stimulator.Gebruik vervolgens een voltmeter om te controleren of het apparaat de vereiste schok afgeeft. Zet daarna het doolhof stevig vast met G-klemmen. Om luchtlekkage te voorkomen, wordt het T-doolhof verbonden met slanglijnen die naar een vacuumpomp lopen, zodat geuren over de vliegen heen worden getrokken en uit het systeem worden verwijderd.Handhaaf een milde luchtstroom van 2 liters per minuut, verdun vervolgens 4-methylcyclohexanol of MCH in een verhouding van 1:67 en 3-octanol of OCT in een verhouding van 1:100 in minerale olie. Pipetteer daarna 30 µL van de verdunde geurstof in het geurcupje. Bereid een op maat gemaakt geurcupje voor en bedek een geurblok met een plastic buisje met een geperforeerde bovenkant.Plaats de op maat gemaakte geurcup in het geurblok. Dit mechanisme zorgt ervoor dat lucht over de geur in de cup wordt getrokken, waardoor de vliegen worden blootgesteld aan een geurpluim. Voer alle experimenten met olfactorische shock-conditionering bij volwassen vliegen uit onder een zwak rood licht; dit stelt de onderzoeker in staat om te zien, maar voorkomt dat de vliegen dit zien, waardoor wordt gewaarborgd dat de vliegen zich concentreren op geuren in plaats van op visuele prikkels.Breng vervolgens de vliegen over naar de trainingsbuis die aan de TMA's is bevestigd en laat ze 90 seconden wennen aan de buis en de luchtstroom. Presenteer de eerste geur MCH samen met een schok van 60 volt, bestaande uit 12 pulsen van 1,25 seconden met interpulsintervallen van 3,75 seconden gedurende een totale duur van 60 seconden.Volg de schok met een rustperiode van 32 s. Presenteer de tweede geur van OCT gedurende 60 seconden zonder schok. Volg de schok met een rustperiode van 32 s.Kantel de teammates vervolgens op hun zij en tik voorzichtig met de onderkant op een muismat om de vliegen van de trainingskamer naar de centrale kamer te verplaatsen. Nadat de vliegen 90 seconden in de centrale kamer zijn gehouden, plaatst u de keuzebuisjes in de onderkant van het apparaat om team A te vormen om het leerproces te meten. Verplaats de vliegen naar het keuzepunt van de teammates en stel ze gelijktijdig gedurende 120 seconden bloot aan beide geuren.Vang de vliegen in de keuzebuisjes door de centrale kamer omhoog te schuiven. Verzamel vervolgens de vliegen uit het centrale compartiment en uit elke arm van de keuzebuisjes in afzonderlijke voedingsbuisjes. Label op het buisje duidelijk om welke vliegen het gaat en wat hun geurkeuze was, en tel ze vervolgens om het geheugen te meten.Verzamel de vliegen na de training en breng ze over van de teamgenoten naar voedingsvials zonder gist. Bewaar de vliegen in het donker bij 25 °C en 70% luchtvochtigheid, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Introduceer de vliegen vervolgens opnieuw bij de teamgenoten.Voor het langetermijngeheugen. Gebruik een op maat gemaakt labyrint waarmee meerdere groepen vliegen gelijktijdig getraind kunnen worden. Voer vijf trainingscycli uit.Houd de vliegen bij 18 °C en 70% luchtvochtigheid in het donker tot aan de test. Verplaats de vliegen voorafgaand aan de test naar 25 °C en laat ze minimaal één uur acclimatiseren.Beoordeel het langetermijngeheugen. 24 uur na de training. Reinig na de gedragsexperimenten de geurekopjes met warm water en geurdloos detergent.Breng na het drogen 10 µL sigma coat aan op de geurbekers. Verwarm de geurbekers vervolgens in een magnetron om de sigma coat te laten stollen. Voer de geuracuïteitstest uit door 100 vliegen na 90 seconden in de team aze te brengen, verplaats de vliegen naar het keuzepunt en geef hen twee minuten de tijd om te kiezen tussen pure geuren en lucht.Verzamel daarna de vliegen en tel ze. Voor de schokreactiviteit: plaats de vliegen in de schokkamer.Na 90 seconden rust wordt een elektrische schok van 60 volt DC toegediend. Sommige vliegen zullen ontsnappen naar een vergelijkbare buis zonder schok. Geef de vliegen twee minuten de tijd om een keuze te maken.Verzamel vervolgens de vliegen die uit de schokbuis zijn ontsnapt en tel deze om de leereffecten te verduidelijken. Er is een reeks experimenten uitgevoerd met volwassen vliegen van het Canton s wildtype en het leren bij volwassen DS-mutante vliegen. Duns-vliegen vertonen een vermindering in het leervermogen vergeleken met vliegen van het wildtype.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om nauwkeurig bij te houden welke vliegen welke zijn en wat er met hen is gedaan. Houd er rekening mee dat vliegen gemakkelijk gestrest kunnen raken tijdens de voorbereiding, training en het testen. Zorg ervoor dat u stress minimaliseert en consistent te werk gaat.Houd er rekening mee dat het leervermogen van Joslin dagelijkse variaties kan vertonen. Neem daarom de voorzorgsmaatregel om uw controle- en experimentele procedures ongeveer op hetzelfde tijdstip van de dag en onder dezelfde omstandigheden uit te voeren. Als uw controles stoppen met leren, probeer dan te analyseren wat er anders is gedaan in vergelijking met de dagen waarop het experiment wel werkt.Zodra u de variabele heeft geïsoleerd, probeer dan consistenter te zijn met die variabele wanneer u de geheugenassay uitvoert. Veel succes in de toekomst.

drosophila-adult-olfactory-shock-learning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Drosophila larven zijn in staat om geur stimuli associëren met smaak beloning. Hier beschrijven we een eenvoudige gedragsmatige paradigma dat de analyse van appetitieve associatief olfactorische leren mogelijk maakt.

Appetitieve Associatieve Olfactorische Learning in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Deze video beschrijft een klassieke conditioneringstest die leren en geheugen test in Drosophila, verkeringsconditionering genoemd. De test is gebaseerd op de vermindering van mannelijke verkering na het ervaren van een afwijzing door een niet-ontvankelijke voorafgemateerde vrouw. Het voorbeeldprotocol toont een instelling voor de procedure die kan worden gebruikt om het kortetermijngeheugen en het langetermijngeheugen te beoordelen.

Drosophila Verkeringsconditionering: een methode om leren en geheugen in vliegen te testen

Wij stellen een keuze test om de invloed van geurstoffen op Drosophila gedrag via een Y-doolhof test onthullen.

Testen<em&gt; Drosophila</em&gt; Reukzin met een Y-doolhof Assay

We beschrijven hier een gedragsopstelling en methode voor gegevensanalyse voor het meten van reukresponsen van maximaal 100 azijnvliegen (Drosophila melanogaster). Dit systeem kan worden gebruikt met enkele of meerdere reukstimuli en is aanpasbaar voor optogenetische activering of het tot zwijgen brengen van neuronale subsetten.

Olfactorische gedrag getest door Computer Tracking Of<em&gt; Drosophila</em&gt; In een vier-kwadrant olfactometer

Smaak is een belangrijk sensorisch proces dat de aantrekking tot heilzame stoffen en het vermijden van giftige stoffen vergemakkelijkt. Dit protocol beschrijft een eenvoudige innametest voor het bepalen van de Drosophila smaakpreferentie voor een bepaalde chemische verbinding.

Taste Voorkeur Assay voor Volwassenenonderwijs<em&gt; Drosophila</em

Dit protocol beschrijft een Drosophila- leer- en geheugenassessie, genaamd courtship conditioning. Deze klassieke test is gebaseerd op een vermindering van mannelijk hofgedrag na seksuele afwijzing door een non-receptive premated female. Deze natuurlijke vorm van gedragsplasticiteit kan worden gebruikt om leer, kortlopend geheugen en langdurig geheugen te testen.

Drosophila Courtship Conditioning als een maat van leren en geheugen

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Dit werk beschrijft een eenvoudig gedragsparadigma dat de analyse van aversief associatief leren bij volwassen fruitvliegen mogelijk maakt. De methode is gebaseerd op het onderdrukken van het aangeboren negatieve geotaxisgedrag als gevolg van de associatie gevormd tussen een specifieke omgevingscontext en een elektrische schok.

Drosophila Passief vermijdingsgedrag als een nieuw paradigma om associatief aversief leren te bestuderen

We beschrijven hier methoden voor het induceren en analyseren van olfactorische ervaring-afhankelijke remodellering van synaptische glomeruli van de antennekwab in de juveniele hersenen van Drosophila .

Ervaringsafhankelijke hermodellering van juveniele reukbare sensorische neuronen Synaptische connectiviteit van de hersenen in een kritieke periode in het vroege leven

Een belangrijke barrière voor het bestuderen van cellulaire activiteit tijdens cognitieve processen zoals leren en geheugen is het gebruik van anesthetica voor in vivo beeldvormingsvoorbereiding. Anesthesie schaadt het kortetermijngeheugen en de cognitie in meerdere modellen, waaronder Drosophila. Deze studie presenteert een unieke methode voor het bereiden van volwassen Drosophila voor in vivo beeldvorming zonder verdoving.

In vivo Beeldvorming van neurale activiteit bij onverdoofde Drosophila-volwassen vliegen

Leer geheugentesten bij volwassen Drosophila met een olfactieve schokassay. Deze methode meet associatief leren door geuren te koppelen aan elektrische schokken en het geheugen 24 uur later te evalueren.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Meer video's verkennen