Gene Trapping behulp Gal4 in zebravis
29 september 2013
Dit protocol beschrijft de methode van de genetische val insertiemutagenese behulp Gal4-VP16 als primaire verslaggever en GFP / RFP als secundaire verslaggevers in zebravis. Ongeveer een op de tien high-uitdrukken F0 vis opbrengst gene trap nageslacht co-GFP en RFP. De screeningsprocedure kan gemakkelijk worden opgeschaald te passen aan de grootte van het laboratorium dat de insertie mutagenese scherm.
Het algemene doel van deze procedure is om mutante vissen te produceren met behulp van genbrekende transpositie op vectoren met GAL vier, VP 16 als de primaire genvangstreporter. Dit wordt bereikt door eerst het genvangstvector samen met de twee transposities in zebravisembryo's te co-injecteren. Geïnjecteerde embryo's worden gescreend op GFP-fluorescentie op drie dagen na bevruchting en ongeveer 30% van de helderste embryo's worden geselecteerd om het F nul-zwembad te vestigen.
Vervolgens worden de F nul-vissen gekruist met de U-A-S-M-R-F-P-testerlijn om te screenen op overdracht van genvangstgebeurtenissen in de kiemcellen. De laatste stap is om de F1 te kruisen om de F twee-generatie te vestigen en embryo's te genereren voor moleculaire karakterisering van genvangstgebeurtenissen door inverse PCR en vijf prime race. Uiteindelijk zou ongeveer één op de tien gescreende F nul-vissen genvangstnakomelingen moeten produceren.
Genbrekende transpositie werd ontworpen om geen mutaties te produceren bij integratie in entrees van eiwitcoderende genen. Onze GBT-vectoren gebruiken G vier P 16 als de primaire genvangstreporter. Deze wijziging verhoogt de gevoeligheid voor genen die op laag niveau worden tot expressie gebracht en maakt het mogelijk om genvangstmutanten te gebruiken zonder over vermeden fenotypes als G vier-drivers voor weefselspecifieke expressie van andere transgenen.
Wij geloven dat de belangrijkste bottleneck van onze methode ligt in het bereiken van voldoende hoge percentages van genvangstintegratie in de kiemcellen van F nul-vissen. In deze demonstratie zullen we verschillende cruciale stappen behandelen, DNA-voorbereiding, MICROINJECTIE en F nul-screening. De GBTB een genvangstvector gebruikt GAL vier VP 16 als de primaire genvangstreporter.
Minimale lange twee transposities op de uiteinden worden gebruikt voor genvangstintegratie. Genvangstgebeurtenissen worden direct gedetecteerd door een EGFP-reporter onder de controle van 14 X GAL vier UAS. De volledige genvangstcassette wordt geflankeerd door directe locks P-sites.
Dit maakt genvangstgebeurtenissen omkeerbaar door expressie van Cree combs om een bewijs van een causaliteitsrelatie tussen een specifieke genvangstintegratie en een waargenomen fenotype te vestigen. Bovendien wordt de U-A-S-E-G-F-P cassette geflankeerd door directe FRT-sites. Injectie van flip combs-mRNA zal leiden tot excisie van de U-A-S-E-G-F-P cassette, waardoor de genvangstmutatie ongemarkeerd blijft door EGFP-fluorescentie en de mogelijkheid biedt om deze te gebruiken in transgene lijnen die specifieke weefsels of ontwikkelingsgebeurtenissen markeren door GFP-fluorescentie vóór micro-injectie.
Bereid de transpositie op DNA en transposities mRNA voor. Bereid het GBTB een genvangstvector DNA voor. Bij gebruik van een standaard mini prep kit en volgens het protocol van de fabrikant, is het essentieel om de PB-wasstap op te nemen bij het voorbereiden van het DNA.
Anders zal het mini prep DNA worden besmet door RNA's, wat leidt tot afbraak van de transposities Mr.NA, verdun het DNA in RNA-vrij water tot 10 nanogram per microliter. Om de lange twee transposities mRNA voor te bereiden, lineairiseer eerst PT drie TS T twee met xbo een. Vervolgens transcribeer het lineaire DNA met behulp van een M-berichtmachine T drie in vitro transcriptiekit met één wijziging.
Voeg 0,5 microliter rib lock RNA's-remmer toe na de behandelingsstap van het DNA, zuiver mRNA met behulp van een standaardkit en beoordeel de kwaliteit van het in vitro getranscribeerd mRNA door middel van agros-gelelektroforese. Verdun het mRNA in RNA-vrij water tot 40 nanogram per microliter en bewaar als twee microliter-aliquots bij negatief 80 graden Celsius vlak voor de micro-injectie. Bereid het injectiemengsel voor door acht microliter verdund transpositie op DNA toe te voegen aan een twee microliter-aliquot van transposities mRNA.
Injecteer drie nanoliter van het D-N-A-R-N-A-mengsel in de dooier van één cel zebravisembryo's met behulp van standaard micro-injectietechnieken, gericht op de dooier-blasfemeer-interface. Na de injectie, laat vijf microliter resterende injectieoplossing draaien op een 1%-aros-gel voor kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat het transposities mRNA niet is afgebroken ongeveer zes tot acht uur na de injectie. Verwijder onbevruchte en dode embryo's en verdeel de embryo's over 60 tot 80 per 100 millimeter Petri-schaal. Abnormale en dode embryo's worden verwijderd op een dag na bevruchting, twee dagen na bevruchting en drie dagen na bevruchting. Op drie dagen na bevruchting onder een stereo-microscoop uitgerust met fluorescentie of een rechtopstaande microscoop.
Screen de embryo's en verwijder eventuele abnormale embryo's. Screen de overgebleven embryo's zonder overduidelijke defecten. Voor GFP-fluorescentie, selecteer de helderste F nul-embryo's en kweek ze op met behulp van standaard zebravis-kweekprocedures in dit laboratorium.
GBT's worden meestal geïnjecteerd in lijnen met wildtype of luipaardpigmentatiepatronen. Het is redelijk om te verwachten dat 20 tot 30% van de geïnjecteerde embryo's die voor kweek zijn geselecteerd, zullen overleven tot volwassenheid. Integratie van de GBTB een genvangstvector kan leiden tot EGFP-expressie door middel van twee verschillende mechanismen.
De eerste is een echte genvangstgebeurtenis. De vector integreert in een gen een fusietranscript tussen het vijf-prime van dat endogene gentranscript en de GAL vier VP 16 wordt gemaakt en vertaald in een fusie-eiwit dat het eindterminus van het eiwit bevat en bedekt door het ingebouwde gemuteerde gen en GAL vier, VP 16. Dit fusie-eiwit bindt aan de 14 XUAS en activeert transcriptie van EGFP.
Het tweede minder wenselijke gebeuren is een enhancer-val. De minimale promotor voor EGFP valt onder de controle van een enhancer in de buurt van de integratieplaats, wat leidt tot productie van EGFP in afwezigheid van GAL vier, VP 16. Om onderscheid te maken tussen deze twee klassen van gebeurtenissen, werd een 14 X-U-A-S-M-R-F-P transgene lijn gemaakt die
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor gene trap insertionele mutagenese in zebravissen met behulp van Gal4-VP16 als primaire reporter en GFP/RFP als secundaire reporters. De procedure maakt het mogelijk om gene trap nakomelingen die GFP en RFP co-exprimeren te identificeren, met een screeningsproces dat kan worden geschaald volgens de grootte van het laboratorium.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
- Transgene modellen
Achtergrond
- Gene trap insertionele mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om mutaties in specifieke genen te creëren.
- Gal4-VP16 dient als een gevoelige reporter voor genexpressie.
- GFP en RFP worden gebruikt om gene trap-gebeurtenissen te visualiseren.
- De methode beoogt ongewenste mutaties tijdens integratie te minimaliseren.
Doel van de studie
- Om mutante zebravissen te produceren voor functionele genanalyse.
- Om de gevoeligheid van genexpressiedetectie te verbeteren.
- Om een betrouwbare screeningsmethode voor gene trap-gebeurtenissen vast te stellen.
Gebruikte methoden
- Co-injectie van gene trap-vectoren en transposase-mRNA in zebravis-embryo's.
- Screening op GFP-fluorescentie drie dagen na bevruchting.
- Kruisen van F0-vissen met U-A-S-M-R-F-P testerlijnen om germline-transmissie te verifiëren.
- Uitkruisen van F1 om F2-generatie voor moleculaire karakterisering vast te stellen.
Belangrijkste resultaten
- Ongeveer 30% van de helderste embryo's werd geselecteerd voor verdere analyse.
- Ongeveer een op de tien F0-vissen produceerde gene trap-nakomelingen.
- Gene trap-gebeurtenissen werden bevestigd door co-expressie van GFP en RFP.
- Integratiemechanismen werden geïdentificeerd, inclusief echte gene trap en enhancer trap-gebeurtenissen.
Conclusies
- De methode genereert effectief zebravis-mutanten voor genfunctiestudies.
- Hoge percentages van gene trap-integratie zijn cruciaal voor succesvolle resultaten.
- Deze aanpak maakt reversibel markeren van gene trap-gebeurtenissen mogelijk voor verder onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
