Gene Trapping behulp Gal4 in zebravis

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van gemuteerde vissen met behulp van een gene-breaking transposon op vectoren met GAL4 en VP16 als primaire gene-trap-reporter. Dit wordt bereikt door eerst de gene-trap-vector samen met Tol2-transposases in zebravissenembryo's te co-injecteren. Geïnjecteerde embryo's worden drie dagen na bevruchting gescreend op GFP-fluorescentie en ongeveer 30% van de helderste embryo's wordt geselecteerd om de F0-pool vast te stellen.

Vervolgens worden de F zero vissen gekruist met de U-A-S-M-R-F-P testerlijn om te screenen op kiemlijntransmissie van gene trap-gebeurtenissen. De laatste stap is om de F1 terug te kruisen om de F two generatie te vestigen en embryo's te genereren voor moleculaire karakterisering van gene trap-gebeurtenissen via inverse PCR en five prime race. Uiteindelijk zou ongeveer één op de 10 gescreende F zero vissen gene trap-nakomelingen moeten produceren.

Gene breaking transposons werden ontworpen om geen mutaties te veroorzaken bij integratie in de beginsecties van eiwitcoderende genen. Onze GBT-vectoren gebruiken G4P16 als de primaire gene trap-reporter. Deze modificatie verhoogt de sensitiviteit voor genen die op een laag niveau worden tot expressie gebracht en stelt ons in staat om gene trap-mutanten zonder overbodige fenotypes te gebruiken als G4-drivers voor weefselspecifieke expressie van andere transgenen.

Wij geloven dat de belangrijkste flessenhals van onze methode ligt in het bereiken van voldoende hoge percentages gen-trap integratie in de kiemlijn van F0-vissen. In deze demonstratie behandelen we verschillende kritieke stappen: DNA-preparatie, MICROINJECTIE en F0-screening. De GBTB1 gen-trap vector maakt gebruik van GAL4 VP16 als de primaire gen-trap reporter.

Minimale tall two transpose on ends worden gebruikt voor genetrap-integratie. Genetrap-gebeurtenissen worden direct gedetecteerd door een EGFP-reporter onder controle van 14 X GAL four UAS. De volledige genetrap-cassette is geflankeerd door direct locks P-sites.

Dit maakt gene trap-gebeurtenissen omkeerbaar door expressie van Cre-recombinase om het bewijs van een causaal verband tussen een specifieke gene trap-integratie en een waargenomen fenotype vast te stellen. Daarnaast is de U-A-S-E-G-F-P-cassette geflankeerd door directe FRT-sites. Injectie van Flip-recombinase mRNA leidt tot excisie van de U-A-S-E-G-F-P-cassette, waardoor de gene trap-mutatie niet langer gemarkeerd is door EGFP-fluorescentie, wat het gebruik mogelijk maakt in transgene lijnen die specifieke weefsels of ontwikkelingsgebeurtenissen markeren door GFP-fluorescentie voorafgaand aan de micro-injectie.

Bereid het transposon-DNA en het transposon-mRNA voor. Bereid het GBTB one gene trap vector-DNA voor. Bij het voorbereiden van het DNA is het essentieel om de PB-wasstap in te voegen, met gebruik van een standaard mini prep-kit en volgens het protocol van de fabrikant.

Anders zal het miniprep-DNA besmet raken met RNA's, wat leidt tot degradatie van de transposes mRNA. Verdun het DNA in RNA-vrij water tot 10 nanogram per microliter. Om de twee transposes mRNA voor te bereiden, lineariseer eerst PT3 TS T2 met XboI. Transcribeer vervolgens het gelineariseerde DNA met een M message mMachine T3 in vitro transcriptiekit met één aanpassing.

Voeg 0,5 µL rib lock RNA-inhibitor toe na de behandelingsstap van het DNA, zuiver het mRNA met een standaardkit en beoordeel de kwaliteit van het in vitro getranscribeerde mRNA via agarosegelelektroforese. Verdun het mRNA in RNA-vrij water tot 40 ng/µL en bewaar dit als aliquots van 2 µL bij -80 °C tot vlak voor de micro-injectie. Bereid het injectiemengsel voor door 8 µL verdund transposase-DNA toe te voegen aan een aliquot van 2 µL transposase-mRNA.

Injecteer drie nanoliters van het D-N-A-R-N-A-mengsel in de dooier van één-cel zebravisembryo's met behulp van standaard microinjectietechnieken, waarbij wordt gemikt op de interface tussen de dooier en het blastomeer. Voer na de injectie vijf microliters van de resterende injectieoplossing uit op een 1% agarosegel voor kwaliteitscontrole om te controleren of het mRNA van het transposase niet is gedegradeerd. Onbevruchte en dode embryo's worden ongeveer zes tot acht uur na de injectie verwijderd, waarna de embryo's in groepen van 60 tot 80 per 100 millimeter Petrischaal worden verdeeld. Abnormale en dode embryo's worden verwijderd op één dag na bevruchting, twee dagen na bevruchting en drie dagen na bevruchting. Op drie dagen na bevruchting gebeurt dit onder een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentie of een rechtopstaande microscoop.

Screen de embryo's en verwijder alle abnormale embryo's. Selecteer de overgebleven embryo's zonder evidente defecten. Kies voor GFP-fluorescentie de helderste F nul embryo's en kweek deze op volgens de standaardprocedures voor het fokken van zebravissen in dit laboratorium.

GBT's worden gewoonlijk geïnjecteerd in lijnen met wildtype- of luipaardpigmentatiepatronen. Het is redelijk om te verwachten dat 20 tot 30% van de geselecteerde geïnjecteerde embryo's voor opkweek de volwassen leeftijd zullen bereiken. Integratie van de GBTB one gene trap-vector kan leiden tot EGFP-expressie via twee verschillende mechanismen.

De eerste is een echt gene trap-event. De vector integreert in een gen, waardoor een fusietranscript ontstaat tussen het 5'-uiteinde van dat endogene gentranscript en GAL4-VP16, dat vervolgens wordt vertaald in een fusie-eiwit bestaande uit het C-terminus van het eiwit, gecodeerd door het geïnserte gemuteerde gen en GAL4-VP16. Dit fusie-eiwit bindt aan de 14XUAS en activeert de transcriptie van EGFP.

De tweede, minder wenselijke gebeurtenis is een enhancer trap. De minimale promotor voor EGFP komt onder controle te staan van een enhancer nabij de integratieplaats, wat leidt tot de productie van EGFP in afwezigheid van GAL four, VP 16. Om onderscheid te maken tussen deze twee klassen van gebeurtenissen, is een 14 X-U-A-S-M-R-F-P transgene lijn gemaakt die is gemarkeerd door lens-specifieke gamma crystalline GFP.

Gene trap-gebeurtenissen worden geverifieerd door GBT-geïnjecteerde vissen te kruisen met homozygote U-A-S-M-R-F-P vissen en te screenen op co-expressie van GFP en RFP, wat alleen mogelijk is als GAL four, VP 16 wordt geproduceerd en U-A-S-M-R-F-P in trans activeert. Om de procedure voor het screenen van F zero-vissen te starten, worden individuele F zero-vissen gekruist met homozygote U-A-S-M-R-F-P vissen. Aangezien de GBT-geïnjecteerde vissen wild-type of leopard-pigmentatiepatronen hebben en de homozygote U-A-S-M-R-F-P lijn op een koperkleurige achtergrond staat, kunnen F zero-vissen gemakkelijk worden onderscheiden van de U-A-S-M-R-F-P vissen. Dit elimineert de noodzaak om vast te leggen of de gescreende F zero een mannetje of een vrouwtje was, alsook potentiële fouten die voortvloeien uit missers bij het registreren en/of bepalen van het geslacht van elke vis. De volgende dag.

Zet de brass U-A-S-M-R-F-P vissen terug in hun aquarium. Plaats de F0-vissen die embryo's hebben geproduceerd in individuele statische tanks terwijl de embryo's voor screening worden verzameld; breng de verzamelde embryo's in de middag van dag nul over naar nieuwe petrischalen. Screen de embryo's op GFP- en RFP-fluorescentie één dag na de bevruchting en drie dagen na de bevruchting.

Verwijder de embryo's die positief zijn voor zowel GFP als RFP en sorteer deze op basis van het GFP-RFP-expressiepatroon. Indien er in een clutch meer dan één patroon wordt waargenomen, worden deze opgekweekt om de F1-generatie te vestigen. Let op dat 3D PF-embryo's die positief zijn voor GFP maar niet voor RFP niet worden verwijderd, aangezien deze enhancer trap-events vertegenwoordigen.

Kruis de F0-vissen die GFP-RFP-positief nageslacht produceerden opnieuw om een tweede batch positieve vissen te verkrijgen. De F1-vissen worden gescreend om F2-families op te stellen om het expressiepatroon van de gene trap te documenteren en om batches embryo's in te vriezen voor moleculaire identificatie van de gene trap-loci. Kruis eerst individuele F1-vissen op de volgende dag met de homozygote UAS-MRP-vissen. Plaats de F1-vissen die embryo's gaven in individuele statische tanks, terwijl de embryo's worden verzameld voor screening op één dag na fertilisatie.

De RFP-labeling is mogelijk nog niet zichtbaar, dus screen de embryo's op GFP-fluorescentie en haal de GFP-positieve embryo's eruit. Screen drie dagen na bevruchting op zowel GFP- als RFP-fluorescentie en haal de dubbel positieve embryo's eruit. Fotografeer vervolgens de embryo's die positief zijn voor zowel GFP als RFP vijf dagen na bevruchting. Vries groepen van 20 GFP-RFP-positieve en 20 GFP-RFP-negatieve embryo's in voor de identificatie van insertiemutaties in genen middels inverse PCR en 5 prime race. Laat de overige GFP-RFP-positieve embryo's opgroeien om de F2-generatie te vestigen bij een succesvolle injectie.

Ten minste 80% van de embryo's die zijn geïnjecteerd met de gene trap DNA tall two transposes mRNA mix zal een bepaalde mate van GFP-fluorescentie vertonen. Een lage GFP-expressie duidt op een mislukte injectie of degradatie van het transposes RNA als gevolg van RNAse-contaminatie. Wanneer de helderste GFP-positieve embryo's worden geselecteerd om de F nul-pool vast te stellen, zal ongeveer één op de 10 gescreende F nul-vissen gene trap-nakomelingen opleveren onder de F nul-vissen waarvan de gene trap-gebeurtenissen worden hersteld.

De meeste zenden één enkel gene trap-event uit, naast verscheidene niet-expressieve transpose on-integraties. Omdat de gehele gene trap-cassette wordt geflankeerd door directe loxP-sites, zijn alle gene trap-mutaties die in dit diagram worden weergegeven (waarbij blauwe vakjes de exonen van het gemuteerde gen representeren) reversibel door expressie van Cre-recombinase. Deze afbeeldingen tonen de co-expressie van GFP en RFP in het zenuwstelsel van de NSF TP six gene trap-lijn; injectie van Cre-RNA in NSF TP six-embryo's leidt tot verlies van GFP- en RFP-expressie.

Let op dat er, zoals verwacht, geen vermindering van de GFP-expressie in de lens is. De meeste van de hier beschreven procedures zijn ook van toepassing op andere gene trap-screens en reguliere transgenese-experimenten met TOL two en andere transposonen. Met de hier beschreven gene trap-procedure zou het opzetten van 20 tot 30 F0-outcrossen per week moeten resulteren in het terugwinnen van één gene trap per week.

De procedure kan echter eenvoudig worden opgeschaald.