Name: Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Leer buigstijfheid meten van microtubuli met een kinesine-gedreven zweefvliegenassay. Deze methode bepaalt de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar voor actine-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Melissa Klocke voor hulp bereiden Figuur 1 en Anna Ratliff voor het aantonen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door de Research Corporation for Science Advancement.

1. Microtubuli Zweefvliegen Assay Stock Solutions Bereid voor op zweefvliegen test. <ol><li> Polymeriseren 0,5 mg microtubuli dun gelabeld met heldere organische fluorofoor 22. Het doel etiket concentratie is 1 fluorofoor per micrometer van microtubuli, of een etikettering dichtheid van ongeveer 1 fluorofoor per 1.500 tubuline-dimeren. Bewaren bij kamertemperatuur, licht beschermd met aluminium, folie voor maximaal twee weken. </li><li> Zuiveren biotine-kinesine 21 ongeveer 1 uM. Bij -80 ° C in 5 pi aliquots voor gebruik in afzonderlijke experimenten. </li><li> Bereid de assay buffer (AB) van 50 mM imidiazole, 50 mM kaliumchloride (KCl), 4 mM magnesiumchloride (MgCl2), 2 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), pH 6,7. Steriel filter en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Los gebiotinyleerde bovine serum albumine (BSA-biotine) tot 2 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter.Bij -80 ° C in 100 ul aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. </li><li> Los streptavidine (SA) tot 10 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 20 pi aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende twee weken. </li><li> Los α-caseïne tot 5 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 100 ul aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende twee weken. </li><li> Los dithiothreitol (DTT) in gedeïoniseerd water bij 200 mM. Bij -20 ° C in 100 ul aliquots binnen 8 uur na ontdooien. Kan opnieuw worden ingevroren. </li><li> Los paclitaxel (PT) in HPLC-grade dimethylsulfoxide (DMSO) bij 4 mM. Bewaren in 10 ul aliquots bij -80 ° C op lange termijn, -20 ° C op korte termijn. Gebruik binnen 8 uur na ontdooien. Kan opnieuw worden ingevroren. </li><li> Los glucose in gedeïoniseerd water bij 120 mg / ml. Store in 100 ul aliquots bij -20 ° C. Kan opnieuw worden ingevroren. </li><li> Dislossen adenosine trifosfaat (ATP) in gedeïoniseerd water bij 150 mM, pH 7,0. Store in 5 pi aliquots bij -80 ° C binnen 8 uur na ontdooien. </li><li> Bereid 100x zuurstofwegvangende voorraad 25 door het oplossen van 10.000 eenheden glucose-oxidase en katalase 156.000 eenheden in 600 ul totaal assay buffer. Centrifugeer kort in een microcentrifuge om pellet vaste stoffen; filter supernatant met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 10 pi aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende maximaal een week. </li></ol> 2. Microtubuli Zweefvliegen Assay, Same Day Solution Voorbereiding Bereid de oplossingen 2,1-2,6 op de dag van het experiment. Met wat oefening kun oplossingen 2,2-2,6 worden voorbereid tijdens de flow-cel wassen. Tenzij anders vermeld, houden voorraad oplossingen op ijs. <ol><li> Bereid AB, 1 ml assaybuffer met 10 ul DTT stock (AB met 2 mM DTT). Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid bio-BSA buffer, 40 &amp; mu, L van een 1:1 mengsel van de biotine-BSA stock en AB. Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid BSA buffer, 645 pl mengen AB met 5,5 ul BSA (1 mg / ml BSA in AB). Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid SA buffer, mengen 57 pl AB met 3 ui streptavidine stock (0,5 mg / ml streptavidine in AB). Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid α-caseïne buffer, mengen 200 ul BSA buffer, 50 pl stock caseïne en 0,8 pi 15 uM ATP (1 mg / ml α-caseïne, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid fluorescentie anti-bleach buffer, 95 pi mengen α-caseïne buffer, 2,5 pl stock glucose, 1 pi 100x zuurstofvanglaag mix, 1 ul paclitaxel stock, 1 pi 2-mercaptoethanol (βME). Voeg βME onder zuurkast. Gebruik fluorescentie anti-bleach buffer binnen 1 uur van voorbereiding. LET OP: βME is zeer giftig en ruikt verschrikkelijk. Zorg ervoor dat u alleen open onder de zuurkast. Bewaar fles in deafwezigheid van licht, licht degradeert βME en zijn vermogen om fotobleken te verminderen. </li></ol> 3. Microtubuli Gliding Assay <ol><li> Construct ongeveer vier stromen banen tussen een 24 x 60 mm dekglaasje en 22 x 22 mm dekglaasje onder vacuüm vet, uit een spuit geëxtrudeerd door een pipetpunt, een spacer. Elke stroom rijstrook moet ongeveer 10 ul in volume (schaal volgende delen daarvan) zijn. </li><li> Wassen 10 ul van bio-BSA buffer in elke baan. Incubeer 5 min te laten BSA de vacht van de glazen oppervlakken. </li><li> Was elke baan drie keer met 15 ul BSA-buffer te verwijderen vrij biotine-BSA, terwijl u de schuif oppervlak te blokkeren. Gebruik een Kimwipe of filtreerpapier om buffer te verwijderen uit tegenovergestelde kant van stroom-kamer, en zorg ervoor dat niet toe te staan ​​luchtbellen om te gaan door de stroom kamer. </li><li> Was de 15 ul SA-buffer in elke baan. Wacht 10 minuten, of tot 2 uur. De streptavidine binden aan het oppervlak gebonden biotine-BSA. </li><li> Was elke baan drie keer met 15 ul BSA-buffer om gratis SA te verwijderen terwijl u de schuif oppervlak te blokkeren. </li><li> Was elke baan met 15 ul α-caseïne buffer. α-caseïne helpt verder niet-specifieke binding van kinesine en microtubuli blokkeren het glas. </li><li> Verdun kinesine tot 10 nM in α-caseïne buffer en was elke baan met 15 ul van deze kinesine - α-caseïne-oplossing. Wacht 15 min (of tot een uur) voor de gebiotinyleerde kinesine specifiek binden aan het oppervlak gebonden streptavidine. De kinesine motorische domeinen blijft vrij om te binden microtubuli. </li><li> Verdun paclitaxel tot 40 uM in de kamer-temperatuur α-caseïne buffer, en was elke baan met 15 ul van deze oplossing uit te spoelen vrij kinesine en Aan een aanvoer kamer vooraf te laden met een paclitaxel-oplossing aan microtubuli voorkomen depolymeriseren. Koud ook microtubuli depolymeriseert, dus zorgen dat deze stappen uitgevoerd te maken bij kamertemperatuur met ruimte temperare oplossingen. </li><li> Verdunde fluorescent gelabelde microtubuli 1:100-1:1,000 in fluorescentie anti-bleach-buffer met 1 mM ATP. Was de 15 ul in een rijstrook en neem binnen 30 minuten. </li></ol> 4. Data Collection <ol><li> Let op de microtubuli zweefvliegen met behulp van fluorescentie microscopie, een microscoop kan oplossen enkele fluoroforen zoals een commerciële of home-build TIRF installatie vereist 26 (figuur 2). De microtubules worden aangedreven door de motoren kinesine op het substraat ongeveer 0,5 um / s, afhankelijk van de temperatuur. Als het veld-of-view van de microscoop is 50 urn moeten individuele microtubuli zichtbaar voor ongeveer 100 sec. Stel lichtintensiteit zodat enkele fluoroforen niet photobleach sneller dan 100 sec. Bij gebruik laserexcitatie een vermogensinstelling van ongeveer 3-5 mW geschikt. </li><li> Verzamel sequenties van beelden voor analyse. 600 beelden op5 Hz (2 min totaal) werkt goed. Gebruik sequenties lang genoeg dat microtubuli het gehele veld-of-view doorkruisen. </li></ol> 5. Data-analyse Een IDL routine, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , is bevestigd. Deze routine geeft een persistentielengte waarde op basis van alle microtubuli zweefvliegen in een bepaalde sequentie van beelden. Ofwel het uitvoeren van deze routine op elk beeld reeks, wijzigen intensiteit parameters afhankelijk van uw specifieke microscoop setup, of doe het volgende: <ol><li> Houd elke fluorofoor bevestigd aan een microtubule om fluorofoor trajecten te creëren. </li><li> Combineren alle trajecten van fluoroforen op een bepaalde microtubule in een algemeen microtubule traject; herhalen voor elk microtubule in de reeks beelden (figuur 3). </li><li> Bereken de tangens hoek elk punt langs de baan (figuur 4)En berekenen &lt;cos θ s&gt; in Eq. Een door het gemiddelde cosinus van de hoek verschil voor elk paar punten gescheiden door een weglengte s (Figuur 5). Vind de persistentie lengte voor een enkele microtubule of een groep van microtubuli door het aanbrengen van &lt;cos θ s&gt; aan Eq. 1, weging van de afzonderlijke gegevenspunten in de pasvorm van het aantal onafhankelijke waarden van cos θ s die worden gebruikt om het gemiddelde te berekenen. </li></ol>

<ol><li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li>
<li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102(2008).</li>
<li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li>
<li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li>
<li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li>
<li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li>
<li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li>
<li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+physical+chemistry+b%22%5BJournal%5D)">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li>
<li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li>
<li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Gliding+assays%22+for+motor+proteins%3A+A+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li>
<li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627(2011).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li>
<li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li>
<li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+tensegrity+in+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biomech%22%5BJournal%5D)">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li>
<li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+nanoscience%22%5BJournal%5D)">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li>
<li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li>
<li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li>
<li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li>
<li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+R+%22Physical+biology+of+the+cell%22">Physical biology of the cell</a>. , Garland Science. (2008).</li>
<li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li>
<li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific%2C+high-precision+label+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li>
<li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+modified+tubulins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li>
<li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curve+reconstruction+from+unorganized+points%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+aded+geometric+design%22%5BJournal%5D)">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li>
<li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Persistentielengte metingen een goede karakterisering van de mechanische eigenschappen van individuele biopolymeren. In dit artikel hebben we een methode beschreven voor het meten van de persistentielengte van microtubuli. Zoals vermeld in de inleiding, is deze werkwijze gemakkelijk uitgebreid onderzoek microtubule mechanische eigenschappen in verschillende omstandigheden eenvoudigweg door het variëren van de reagentia, temperatuur of viscositeit in de laatste stap van de assay glijden, 3.9, of door polymerisatie van mi...

Het cytoskelet, een netwerk van biopolymeren in de meeste eukaryotische cellen een rol speelt in cellulaire organisatie, intracellulair transport en cel mechanica. De mechanische eigenschappen van de biopolymeren van het cytoskelet (voornamelijk actine en microtubuli) spelen een belangrijke rol bij het ​​bepalen van de mechanische eigenschappen van de cel als geheel 12. Sinds hele cel mechanica kunnen karakteriseren gezonde en zieke cellen 13,14 en is betrokken bij cellulaire motiliteit 15, zijn de mechanische eigenschappen van de onderliggende cytoskelet componenten al een actief gebied van onderzoek voor de afgelopen twee decennia 1. De flexibiliteit (of stijfheid) van biopolymeren wordt gekenmerkt door de persistentielengte de lengte polymeer dat bochten met ongeveer een radiaal onder thermische fluctuaties bij omgevingstemperatuur. Een aantal technieken zijn ontwikkeld om persistentielengte 16, voor meten voorble actieve technieken die erin buigen het polymeer met hydrodynamische stroming, optische vallen of elektrische velden 4,17,18 en passieve technieken die fluctuaties van vrije polymeren in oplossing 5,6 meten. De actieve metingen vereisen echter speciale opstellingen om bekende krachten te passen op de micrometer schaal, en de free-fluctuatie metingen kan een uitdaging zijn als gevolg van diffusie uit het vlak van de focus van de gebruikte microscoop. In dit artikel beschrijven we een complementaire, passief, techniek om de persistentie lengte van microtubuli, een cytoskelet polymeer te meten. De techniek bestaat glijden assays die ervoor zorgen dat het polymeer altijd in het brandvlak 19. Bovendien gaat volgen enkele fluoroforen permanent aan het polymeer van belang, zodat specifieke locaties langs de polymeerketen goed gekarakteriseerd. Een cartoon van de methode wordt in Figure 1. Kinesine beweegt specifiek in de richting + einde van de microtubuli, dus de microtubuli in een glijdende assay zijn unidirectioneel aangedreven. Het voorste einde van de microtubuli, voorbij de laatste bevestigd kinesine, vrij fluctueren onder de thermische krachten van de omringende oplossing. Omdat de microtubule naar voren gestuwd, het einde fluctueert tot binding aan een nieuwe kinesine molecule verder langs het glaasje bevriest in een bepaalde fluctuatie. Omdat kinesine hecht zeer sterk microtubules wordt de microtubule beperkt tot het pad van het leidende einde volgen. Derhalve zullen de fluctuaties in de bevroren microtubule traject zijn dezelfde als de statistische fluctuaties van het vrije uiteinde van microtubuli 11 en kan dus worden gebruikt om de persistentielengte berekenen volgens conclusie 20 <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; waarbij l p de persistentielengte van het microtubule, θ de hoek is tussen raaklijnen aan de baan gescheiden door een contour lengte s en &lt;&gt; duidt een gemiddelde van alle paren posities gescheiden door een contour lengte s. De glijdende test zelf maakt gebruik van kinesine gebiotinyleerd aan het opgerolde spoel 21 specifiek gebonden aan het glasplaatje via een streptavidine-biotine koppeling. Deze bevestiging zorgt ervoor dat de motor vrij domeinen bindt aan microtubuli stuwen. Met het oog op microtubuli trajecten volgen, zijn microtubuli dun gelabeld met organische fluoroforen 22,23 - de etiketten moeten worden schaars genoeg dat enkele fluoroforen zijn oplosbaar met behulp van single molecule fluorescentie microscopie. Single fluoroforen worden bijgehouden met behulp van beeldanalyse routines geschreven in IDL. De banen van elk fluorofoor gebonden aan een bepaalde microtubule gecombineerd tot een samengesteld microtubule traject automatisch 24. De raaklijn hoeken θ elk punt langs een traject berekend en uit deze raaklijn loodrecht op &lt;cos s&gt; waarde berekend voor elke contour lengte s. Tot slot worden deze gegevens aanpassen aan Eq. 1 om een ​​persistentielengte extraheren voor een bepaalde microtubule of vele microtubuli in dezelfde assay glijden. De werkwijze is robuust genoeg om bij microtubuli bereid in een grote verscheidenheid van aandoeningen (met verschillende stabilisatoren of andere kleine moleculen gebonden aan de microtubuli, met gebonden microtubule-geassocieerde eiwitten (MAP&#39;s), of met verschillende viskeuze oplossingen). In ons laboratorium werd de techniek gebruikt om de persistentielengte van microtubuli karakteriseren als functie van lengte langs de microtubuli en microtubules met verschillende stabilisatoren. De belangrijkste beperking is dat de microtubuli moet nog sTEUN kinesine motiliteit. Omdat kinesine is een robuuste motor enzym, dit is een vrij losse beperking. Door het vervangen van microtubuli met actine en myosine kinesine een familie enzym kan de persistentielengte van actine wordt gemeten met dezelfde techniek.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reagentia</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kaliumchloride</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Magnesiumchloride</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gebiotinyleerd BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseïne</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidine</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dithiothreitol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratories</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose oxidase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoethanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Koop klein bedrag.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60 mm No 1 1/2 afdekglas</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm nr. 1 afdekglas</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; High Vacuum Grease</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Apparatuur</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF microscoop</td&gt;<td&gt; Veel</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; De TIRF microscoop gebruikt in deze methode was zelfgemaakt.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Kan vervangen MATLAB, ImageJ, of andere software voor beeldanalyse.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

buigstijfheid metingen van biopolymeren gebruik zweefvliegen assays

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules cytoskelet polymeren die een rol spelen in celdeling, mechanica en intracellulair transport. Elk van deze functies is microtubules die stijf en recht genoeg om een ​​aanzienlijk deel van de celdiameter overspannen. Daardoor is het microtubule persistentielengte, een maat van stijfheid, actief onderzocht voor de laatste twee decennia 1. Niettemin, open vragen blijven: kort microtubuli zijn 10-50 keer minder stijf dan lange microtubuli 2-4, en zelfs lang microtubuli hebben gemeten persistentie lengten die variëren van een orde van grootte 5-9. Hier presenteren we een methode om microtubule persistentie lengte te meten. De methode is gebaseerd op een kinesine aangedreven microtubule gliding assay 10. Door het combineren van schaarse fluorescente labeling van individuele microtubuli met enkel deeltje volgen van individuele fluoroforen aan de microtubuli, de gliding trajecten van enkele microtubuli worden bijgehouden met nanometer-niveau precisie. De persistentielengte van de trajecten is hetzelfde als de persistentielengte van het microtubule onder de gebruikte 11. Een geautomatiseerde volgen routine wordt gebruikt microtubule trajecten maken van fluoroforen aan individuele microtubuli, en de persistentielengte van dit traject wordt berekend op basis routines geschreven in IDL. Deze techniek is snel uitvoerbaar en staat om de persistentielengte van 100 microtubuli in een dag experimenten. De werkwijze kan worden uitgebreid tot persistentielengte meten onder verschillende omstandigheden, waaronder persistentielengte als functie van lengte langs microtubuli. Bovendien kan de gebruikte analyse routines worden uitgebreid tot myosine-based assays werkende glijden, de persistentielengte van actine filamenten maatregel.

Een momentopname van een glijdende assay is weergegeven in figuur 2. Een goede microtubuli dichtheid is 1 tot 10 microtubuli per gezichtsveld; aanzienlijk meer zal resulteren in Haperingen als microtubuli elkaar kruisen. Een grafiek van de 11 microtubule trajecten van de glijdende assay in figuur 2 is weergegeven in figuur 3. Typische trajecten zijn 10 tot 30 micrometer lang, sommige trajecten hebben gaten waar een microtubule kruist elkaar. Deze trajecten kunnen worden...

Een methode om de persistentielengte of buigstijfheid van biopolymeren meten beschreven. De methode gebruikt een kinesine aangedreven microtubule gliding assay experimenteel bepalen de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar aan actine gebaseerde assays glijden.

Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Het algemene doel van deze procedure is om een glij-assay te gebruiken om de UAL-stijfheid van microtubuli te meten. Dit wordt bereikt door eerst specifiek het motoreiwit kinesin aan een microscoopglas te hechten met motordomeinen die vrij zijn om microtubuli te binden. De tweede stap is het toevoegen van fluorescent gelabelde microtubuli aan het monster, die door de kinesin worden vertaald.Vervolgens worden video's van glijdende microtubuli verzameld met behulp van fluorescentiemicroscopie. De laatste stap is het analyseren van de glij-assay video's om de buigstijfheid van microtubuli te berekenen. Uiteindelijk worden de glij-assays gebruikt om de buigstijfheid van enkele microtubuli te bepalen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cytoskeletmechanica, zoals de buigstevigheid van individuele cytoskeletalpolymeren. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Anna Ratliff, een student uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, bereidt u de werkzame assaybuffer voor door 10 microliter van 200 millimol DIO drie atol of DTT toe te voegen aan één milliliter van de stockoplossing van de assaybuffer en te mengen.Bewaar dit en alle andere werkoplossingen op kamertemperatuur tijdens de procedure. Bereid vervolgens met behulp van de werkzame assaybuffer 40 microliter biotin BSA-buffer door gesteriliseerd gefilterd biotinyleerd bovien serumalbumine in een verhouding van twee milligram per milliliter met de werkzame assaybuffer te combineren en de oplossing te mengen. Bereid vervolgens de BSA-buffer voor door 645 microliter van de assaybuffer te combineren met 5,5 microliter van 117 milligram per milliliter BSA en de oplossing te mengen.Bereid ook de tritin-buffer voor door 57 microliter van de assaybuffer te mengen met drie microliter gesteriliseerd gefilterd strep din bij 10 milligram per milliliter in assaybuffer. Bouw vervolgens de stroombanen op een 24 bij 60 millimeter dekglas door vijf dunne lijnen vacuümvet van een 10 milliliter spuit uit te drukken. Gebruik een 200 microliter pipettip om de stroom te regelen, de lijnen moeten ongeveer vier millimeter uit elkaar liggen.Plaats een 22 bij 22 millimeter dekglas bovenop het vacuümvet en druk lichtjes naar beneden om de kanalen te vormen. Met een geschatte volume van 10 microliter, moeten de vacuümvetlijnen zich verspreiden tot ongeveer twee keer de oorspronkelijke breedte. De volgende stap is om de banen te bedekken met biotinyleerd bovien serumalbumine door 10 microliter van de bioTE BSA-buffer in elke stroombaan te pipetten met behulp van capillaire kracht om de buffer in te brengen, incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.Spuit vervolgens elke baan drie keer door 15 microliter van de BSA-buffer in één kant van elke baan te injecteren terwijl de oplossing uit de andere kant wordt gezogen met behulp van een Kim-doek of filterpapier. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen in de banen introduceert. Stroom vervolgens 15 microliter streptavidinebuffer in elke baan en incubeer gedurende maximaal twee uur met een minimum van 10 minuten.Tijdens de incubatie, bereidt u de alfa KC in buffer voor door 200 microliter BSA-buffer, 50 microliter gesteriliseerd gefilterd alfa KC in bij vijf milligram per milliliter in assaybuffer en 0,8 microliter van 15 micromolair a TP bij pH zeven te mengen. Bereid ook de kinesin-oplossing voor door de alfa KCM-buffer in een nieuwe buis te pipetten en de biotin kinesin toe te voegen tot 10 nanomolair en vervolgens te mengen na incubatie met de streptavidinebuffer. Spoel elke baan drie keer af met 15 microliter BSA-buffer.Spuit vervolgens elke baan met 15 microliter van de alfa kcn-buffer om niet-specifieke binding van kinesin en microtubuli aan het glas te verminderen. Voeg vervolgens 15 microliter kinesin-oplossing toe aan elke baan en incubeer gedurende 15 minuten tot een uur. Gedurende deze tijd zal de biotin kinesin een sterke binding vormen met de aan het oppervlak gebonden streptavidine en de kinesin-motordomeinen toegankelijk maken voor het binden van microtubuli.Bereid ondertussen een oplossing van 40 micromolair paclitaxel en alfa KC en buffer. De Paclitaxel is belangrijk om te voorkomen dat microtubuli depolymeriseren. Bereid in een afzuigkap de fluorescentie antiblekenbuffer voor door 95 microliter alfa KCM-buffer, 2,5 microliter glucose stock, één microliter 100 x zuurstofopruiming te mengen.Meng één microliter Paclitaxel en DMSO bij vier millimolair. En tenslotte één microliter beta me capto ethanol. Na incubatie spoelt u eventueel vrij biotin kinesin weg door elke baan te wassen met 15 microliter op kamertemperatuur.Paclitaxel in alfa Kia oplossing met behulp van koude buffer kan microtubuli depolymeriseren. Pipette tenslotte de fluorescentie antiblekenbuffer in een nieuwe buis en voeg de fluorescent gelabelde microtubuli toe tot een verdunning van een op honderd tot een op duizend. Voeg vervolgens een millimolair a TP toe en meng.Injecteer 15 microliter van de microtubusoplossing in één baan en observeer met behulp van fluorescentiemicroscopie binnen 30 minuten. De meest kritische aspecten van deze procedure zijn om een optimale concentratie van microtubuli te hebben om ervoor te zorgen dat ze elkaar niet overlappen en om een lage achtergrond te hebben. De resterende banen worden gebruikt om de microtubusconcentratie te optimaliseren en we gebruiken de microscoop zelf om ze uit te lijnen en te focussen.Het beeldvormen van glijdende microtubuli wordt gedaan met behulp van een zelfgemaakte totaal interne reflectiefluorescentiemicroscoop. Een 100 x objectief met hoge numerieke opening toont een veld van ongeveer 50 micron bij 50 micron, wat voldoende ruimte is om beweging gedurende ongeveer 100 seconden te bekijken met een snelheid van 0,5 micron per seconde ingesteld. De laser die wordt gebruikt voor excitatie tot een vermogensinstelling van drie tot vijf milliwatt.Dit vermogen is laag genoeg om fotobleken van de vloer van vieren sneller te voorkomen dan 100 seconden om voldoende beeldvormingstijd mogelijk te maken. Gebruik beeldopnamesoftware om sequenties van afbeeldingen te verzamelen met vijf frames

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

De duurzaamheid van polymeren en vezelversterkte polymeercomposietmaterialen in gebruik is een cruciaal aspect voor hun ontwerp en onderhoud op basis van de toestand. We presenteren een nieuwe, goedkope laboratoriumtestplatform voor het onderzoek naar de invloed van gelijktijdige mechanische en omgevingsbelastingen, en kunnen helpen bij het ontwerpen van efficiëntere en toch veiligere composietstructuren.

Een Testen Platform Duurzaamheid Studies van Polymeren en vezelversterkte Polymer Composites onder Concurrent Hygrothermo-mechanische stimuli

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Een nieuwe methodologie wordt aan synthetiseren en programma hoofdketen vloeibaar-kristallijne elastomeren met in de handel verkrijgbaar uitgangsmonomeren. Een uitgebreide lijst van thermomechanische eigenschappen werd aangepast door de hoeveelheid van crosslinker, terwijl de bediening prestatie was afhankelijk van de hoeveelheid aangebrachte spanning tijdens het programmeren.

Synthese programmeerbare hoofdketen Vloeibaar-kristallijne Elastomers Met een tweetraps thiol-acrylaat Reaction

Semiflexible polymeren weer unieke mechanische eigenschappen die uitgebreid door levende systemen worden toegepast. Systematische studies over biopolymeren zijn echter beperkt omdat eigenschappen zoals polymeer rigiditeit niet toegankelijk zijn. Dit manuscript wordt beschreven hoe is deze beperking omzeild door programmeerbare DNA nanobuisjes, waardoor experimentele studies over de gevolgen van de stijfheid van de gloeidraad.

DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren

Presenteren we een protocol voor het verrichten van drie-punt buigende proeven op sub millimeter schaal vezels met behulp van een custom-built mechanische beproevingstoestel. Het apparaat kan meten krachten variërend van 20 µN tot 10 N en is daarom geschikt voor een verscheidenheid van grootte van de vezels.

Een Millimeter schaal buigsterkte testsysteem voor het meten van de mechanische eigenschappen van mariene spons botsplinters

Ondergronden met stijfheid in het kilopascal-bereik zijn nuttig zijn te onderzoeken van de reactie van cellen op fysiologisch relevante stijfheid van de micro-omgeving. Met behulp van slechts een widefield fluorescentie Microscoop, kan de Youngs modulus van zachte siliconen gel worden bepaald met behulp van een inkeping met een geschikt gebied.

Meting van de stijfheid van zachte siliconen substraten voor Mechanobiology Studies met een Widefield fluorescentie Microscoop

Een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek wordt gebruikt voor het onderzoeken van de mechanische eigenschappen van laag-volume op basis van eiwitten hydrogel monsters aangebonden tussen een spreekspoel motor en een kracht sensor. Een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem zorgt voor het 'klemmen' van de kracht ervaren om het gewenste protocol.

Kracht-Clamp reometrie voor het karakteriseren van de Hydrogels op basis van eiwitten

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Ontwikkeling van op maat assays op de ViBE platform voor meer gevoelige, reproduceerbare, geautomatiseerd resulteert in complexe matrices beschreven. De universele patroon laat testen eenvoudig worden aangepast voor gebruik met aangepaste assays. Deze veelzijdigheid maakt snelle ontwikkeling en validatie van nieuwe testen of geautomatiseerde versies van bestaande manuele testen, geïllustreerd in deze video.

Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

Leer buigstijfheid meten van microtubuli met een kinesine-gedreven zweefvliegenassay. Deze methode bepaalt de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar voor actine-onderzoek.

Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

Meer video's verkennen