Collection, Isolatie en Verrijking van natuurlijk voorkomende Magnetotactic Bacteriën van het milieu

Het algemene doel van deze procedure is om magnetotactische bacteriën te isoleren uit een zoetwateromgeving. Dit wordt bereikt door eerst water-sedimentmonsters te verzamelen vanaf de rand van een rivier of meer. De tweede stap is het isoleren van magnetotactische bacteriën die zich in het milieumonster bevinden met behulp van een staafmagneet.

Vervolgens worden de magnetotactische bacteriën verrijkt met behulp van een glazen capillaire racebaan en een magneet. Ten slotte worden de magnetotactische bacteriën gekarakteriseerd met behulp van optische microscopie. Uiteindelijk wordt transmissie-elektronenmicroscopie gebruikt om de grootte en vorm van de bacteriën en hun magnetietfasen met magnetiet te tonen.

Deze methode helpt ons om belangrijke vragen te begrijpen, zoals milieumicrobiologie, zoals hoe magneto op aarde is geëvolueerd en hoe magnetotactische bacteriën nanometergrote magneten hebben gesynthetiseerd. De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Zachary a Stryker. Zachary is een promovendus in mijn laboratorium.

Hij werkt met mijn broer en mij hier aan de Ohio State University. Bij het kiezen van een zoetwaterlocatie om magnetotactische bacteriën of MTB te verzamelen, is het vaak het beste om te beginnen met een vijver of langzaam stromende beek met een zachte modderige sedimentlaag. In deze demonstratie hebben we een monster verzameld aan de rand van de Oland Tangy River op de campus van de Ohio State University in Columbus, Ohio.

Zoek een locatie waar de waterdiepte tussen de 10 en 100 centimeter is en vul met behulp van een container met schroefdop de bovenste laag sediment en de resterende ruimte met water. Sluit de container onder water af in het laboratorium, maak de dop los en laat deze de container bedekken om verdamping te verminderen en bewaar deze in het donker gedurende enkele uren tot enkele dagen om het sediment en de fijne deeltjes te laten bezinken. Om racebanen te maken voor het verrijken van MTB. Begin met een diamantstift of vijl om de bovenkant van een 5,75 inch glazen pastierpipet af te snijden, waardoor er genoeg ruimte is voor één tot twee milliliter water.

Gebruik vervolgens een brandstof en brander om de punt te verzegelen autoclaveer. Verschillende racebanen samen met katoen en lange metalen naalden. Wanneer u klaar bent om MTB te isoleren, plaats magneten aan de zijden van de plastic container, ongeveer een centimeter boven de sedimentwaterinterface met de zuid- en noordpolen aan tegenoverliggende zijden van de container.

Zorg ervoor dat u het sediment niet verstoort. Wacht 30 minuten tot enkele uren tot de bacteriën naar de magneet zwemmen. Gebruik vervolgens een spuit om vloeistof uit het monstercontainer te verwijderen in de buurt van de sedimentwaterinterface.

Bevestig een filter aan de spuit en een metalen naald aan het filter, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de capillair zijn. Gebruik de naald om het gefilterde monsterwater toe te voegen aan een autoclaveerbaan met steriel katoen en de metalen naald. Sluit de racebaan af door het katoen in de capillair naar 0,5 tot één centimeter van de verzegelde kant te duwen.

Gebruik een steriele pipette om de magnetotactische bacteriën uit de container te verwijderen waar ze geclusterd zijn in de buurt van de zuidpool van de magneet, en voeg het MTB-bevattende water toe aan het open uiteinde van de racebaan. Zodra de racebaan is gevuld met monsterstof, legt u deze op zijn zij op een horizontale oppervlakte en plaatst u de zuidpool van een staafmagneet naast de verzegelingstip van de racebaan. Wacht vijf tot 30 minuten totdat de MTB door het katoen migreert.

Gebruik een diamantmes om voorzichtig een kleine kras te maken in de buurt van het katoenstopje en knip het uiteinde van de racebaan af. Gebruik een een milliliter spuit met een smalle naald om de vloeistof verrijkt met MTB te verwijderen vanaf het uiteinde van de racebaan. Om de MTB door lichtmicroscopie te observeren, plaatst u een druppel van het verrijkte monster op een dekglas.

Plaats het dekglas op een O-ring die op een glasplaatje rust. Dit wordt de hangende druppel genoemd. De O-ring moet een iets kleinere diameter hebben dan het dekglas.

Plaats vervolgens de plaat op een lichtmicroscoopstandaard en focus op een rand van de druppel. Om de MTB naar een kant van de druppel te trekken, plaatst u het zuidelijke uiteinde van een staafmagneet dicht bij die kant binnen enkele minuten, veel MTB zou aan de rand van de druppel moeten zijn. Om de MTB door TEM te observeren, plaatst u een gestabiliseerde en koolstof gecoate 200 mesh koperen rooster van vormvar op de druppel van de verrijkte bacteriën en laat u het monster gedurende 10 minuten bezinken.

Na het wassen van het monster op een druppel water gedurende 30 seconden, plaatst u het op een druppel 2% urinal azijnaat gedurende 30 seconden tot vijf minuten, en gebruikt u vervolgens een stuk filterpapier om volledig te drogen en analyseer de monsters met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie bij 200 kilovolt. Hier is een transmissie-elektronenmicroscoopbeeld van een enkele magnetotactische bacterie verrijkt uit een milieusedimentmonster te zien. De spiraal en morfologie van de cel en magnetozonen zijn duidelijk zichtbaar samen met een enkele vlag.

Zodra de magnetotactische bacteriën uit het milieu zijn verzameld, duurt de magnetische scheidingstechniek ongeveer drie uur als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals 16 s ribosomaal RNA-analyse worden uitgevoerd, wat aanvullende vragen zal beantwoorden, zoals wat is de fylogenetische relatie van de nieuw ontdekte magnetotactische bacteriën tot andere micro-organismen.