Intact Histologische Karakterisering van Brain-geïmplanteerde Microdevices en het omringende weefsel

Het doel van deze procedure is om de intacte hersenweefselinterface rond chronisch geïmplanteerde micro-apparaten in knaagdierhersenweefsel te beeldvormen. Dit wordt bereikt door eerst snel cell siliconen elastomeer en een twee-delig tandheelkundig acryl te gebruiken om de craniotomie te bedekken en een schedelkap rond het in de hersenen geïmplanteerde apparaat te vormen. Na het perfunderen van het dier met fixeermiddel en post-mortem weefselverwerking, wordt het in de hersenen geïmplanteerde deel van het apparaat gescheiden van de hoofdkap door het tandheelkundig acryl weg te branden en door het snelcel te snijden.

Vervolgens wordt de hersenen verwijderd en gesneden met een viome om het implantaat in een weefselsectie vast te leggen. De laatste stap is om het weefsel voor fluorescente beeldvorming voor te bereiden door het te wassen, te labelen en vervolgens de weefselsectie in optische verhelderende oplossing te verhelderen. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om de intacte biologische respons te tonen die het penetrerende hersenimplantaat produceert in het omringende weefsel op subcellulair niveau.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het uitleggen van het apparaat, is dat de techniek voorkomt dat het weefsel rond en aan het geïmplanteerde apparaat wordt verstoord, zodat het interfaceweefsel intact kan worden onderzocht. Deze methode is gebaseerd op geavanceerde immunohistologische en microscopietechnieken en resulteert in confocale microscopiegegevens die in detail de regio rond een in de hersenen geïmplanteerde apparaat beschrijven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuroprothetiek, zoals de mate waarin lokale celdood, gliascicatricivorming en herordening van bloedvaten echt van invloed zijn op de levensduur van in de hersenen geïmplanteerde micro-elektrode-apparaten.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de chronische neurale interface van in de hersenen geïmplanteerde micro-elektrode-arrays, kunnen de technieken die in deze methode worden gebruikt, ook worden toegepast op andere gebieden van neurowetenschappelijk onderzoek, inclusief geïmplanteerde canules of glasvezels. Begin de procedure in een afzuigkap door voorzichtig de huid en andere weefsels rond de acryl schedelkap te verwijderen, met behulp van pincetten en kleine schaar terwijl hitte-insensitive handschoenen worden gedragen. Gebruik een soldeerbout om een venster in het dentacryl te maken en een gebied van onderliggend snelzegel bloot te leggen.

Het apparaat zou zichtbaar moeten zijn ingebed in de heldere snelzegel. Vervolgens snijdt u onder een chirurgische microscoop met een paar gebogen microscharen in het siliconenelastomeer. Vervolgens verwijdert u kleine stukjes snelzegel met pincetten en microscharen tot de positie waar het apparaat de hersenen binnengaat.

Ga door met snijden langs het oppervlak van de craniotomie om de apparaatcomponenten die aan polysilicium en de schedel zijn bevestigd, te scheiden van de componenten die in de hersenen zijn geïmplanteerd. Wees voorzichtig bij het snijden door de blootgestelde apparaatcomponenten. Vermijd het duwen of slepen van de implantaten in het vaste weefsel.

Vervolgens verwijdert u voorzichtig het bot rond de kopkap met behulp van de rauw shes. Gebruik een spatel om de hersenen met het geïmplanteerde apparaat te scheiden van de schedel. Plaats nu de hersenen in een glazen petrischaal gevuld met HBHS.

Gebruik de hersenblok en scheermessen om de hersenen te sectioneren en een vlakke vlak te creëren die nauw overeenkomt met de hoek van de geïmplanteerde apparaten. Druk daarna twee scheermessen door het hersenweefsel en leg de platte oppervlakte bloot die op de Vibram zal worden gemonteerd. Plaats vervolgens wat ijs onder de Vibram-platform.

Droog vervolgens het weefseloppervlak kort op een papieren handdoek. Orienteer vervolgens het monster zodat de breedste dimensie parallel is aan de bewegingsrichting van de vibraat-toonmes om te voorkomen dat het mes het weefsel onmiddellijk omver kan stoten, lijm het vlakke vlak onmiddellijk vast aan het stadium met superlijm. Nadat de lijm is uitgehard, brengt u een gekoelde PBS aan naar de vibrato-schaal rond het weefsel.

Snijd nu de weefselsneden tussen 250 tot 500 micron met behulp van de maximale vibratiesnelheid en een langzame bladvoortgangssnelheid met een bladhoek van 10 graden van horizontaal. Verzamel vervolgens de sneden voorzichtig met een borstel en lepelspatel en bewaar een HBHS in een 24-wellplaat bij vier graden Celsius tijdens het verzamelen van sneden, houd een register bij van de dikte en locatie van elke snede terwijl ze worden verwijderd naar de 24-wellplaat. Zodra het Insitu-apparaat zichtbaar is, verzamel een weefselsnede van ongeveer 500 micron dik.

Om het apparaat in een enkele weefselsnede vast te leggen om een dunnere weefselsectie te verzamelen, kunnen 100 micron sneden zorgvuldig worden verzameld om het apparaat naderbij te komen. Op dat punt kan een snede van minder dan 500 micron dik worden verzameld met het apparaat erin. Begin met weefselverwerking door de sneden drie keer te wassen met vijf minuten per wasbeurt in HBHS.

Bekijk ze vervolgens gedurende 15 minuten in natriumboraathydride. Draai elke kant van de snede langzaam om met behulp van een kleine verfkwast en vermijd contact met gebieden rond het geïmplanteerde apparaat. Een roestvrijstalen of met Teflon beklede microlepel kan ook worden gebruikt samen met de kleine verfkwast.

Was de sneden nu drie keer met vijf minuten per wasbeurt in wasoplossing bij kamertemperatuur. Blok ze in wasoplossing gedurende twee uur bij kamertemperatuur terwijl je de sneden omdraait. Na één uur na twee uur, bewaar de sneden in primaire antilichaam gedurende ongeveer 48 uur bij vier graden Celsius.

Voer vervolgens zes snelle wasbeurten van drie minuten uit met wasoplossing. Voer ver