Name: Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Leer een protocol voor de productie van disulfide-gestabiliseerde transmembraanpeptidecomplexen voor structurele studies met behulp van NMR-analyse. Deze methode ondersteunt onderzoek naar membraaneiwitinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering voor dit werk wordt geleverd door de National Health en Medical Research Council van Australië (NHMRC projectsubsidie ​​1011352 naar MEC en MJC; onafhankelijke onderzoeksinstituten Infrastructure Support Scheme [IRIISS] subsidie ​​aan WEHI) en de Victoriaanse regering (Veski Innovation Fellowship aan MEC; Victoriaanse Deelstaatoverheid operationele infrastructuur te ondersteunen om WEHI). MEC is een Koningin Elizabeth II Fellow van de Australian Research Council. EFXB erkent steun van de Norma Hilda Schuster Scholarship Program aan de Universiteit van Melbourne.

1. Klonen en Construct Ontwerp Kloon de sequenties van interesse in de vector pMM-peptide (die kan zijn voorzien op aanvraag) met HindIII en BamHI restrictieplaatsen (zie figuur 1). Het dubbelstrengs DNA insert, opgenomen in de volgende volgorde: een HindIII-plaats, een methionine codon voor CNBr splitsing, de E. coli codon-geoptimaliseerde coderende sequentie, een stopcodon, een BamHI site. Alle andere methionines in het peptide worden geëlimineerd en de sequentie dipeptide Asp-Pro moet worden vermeden, deze zal worden gesplitst onder zure omstandigheden. Een unieke cysteïnerest worden ingebracht in elk peptide sequentie volgens de gewenste positionering van de disulfide verknoping in het uiteindelijke complex en alle andere cysteines worden gemuteerd tot serine. Het plasmide draagt ​​een kanamycine resistentie cassette voor selectie. 2. Expressie van trpLE-peptide Fusion <ol><li> Maken en steriele filter M9/Kan minimale groei medium (0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 3 g / L KH 2PO 4, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L NaCl, 1 g / L NH4Cl, 4 g / L glucose, 50 mg / L kanamycine sulfaat). Supplement bij het ​​Centrum Compleet van A tot Zink om B-vitamines en sporenelementen zorgen voor: los 1 tablet in 40 ml H 2 O met het mengen gedurende 30 minuten, centrifuge om onoplosbaar materiaal en steriele filter de oranje supernatant te verwijderen. Store stock oplossing bij 4 ° C in het donker tot 2 weken en met 4 ml / L in M9. OPMERKING: 15 N-verrijkte NH4Cl, 13C-verrijkte glucose of andere stabiele-isotoop-gemerkte precursors worden in M9 medium op dit moment indien gewenst. </li><li> Inoculeren van 100 ml startercultuur van vers getransformeerde BL21 (DE3) E. stam coli in M9/Kan medium. Groeien bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm. </li><li> De volgende ochtend controleren OD 600 van de starterkweek - dit moet in het traject van 2 of hoger. Verdun de 100 ml zuursel in 1 L totaal volume van Centrum-aangevuld M9 medium. Opgesplitst in twee kolven 2 L war (500 ml kweek in elke kolf) en groeien bij 37 ° C onder schudden bij 140 rpm tot de OD600 0,6 bereikt. </li><li> Stel de shaker temperatuur tot 18 ° C en verder gedurende 1 uur geschud, waardoor culturen volledig afkoelen alvorens inductie. </li><li> Neem een pre-inductie monster SDS-PAGE analyse (equivalent van 50 pi van een cultuur van OD600 = 1), voeg IPTG tot 0,1 mM eindconcentratie om expressie van het fusie-peptide trpLE induceren. Blijven groeien bij 18 ° C/140 rpm &#39;s nachts (16-20 uur) onder IPTG-inductie. </li></ol> 3. Insluitingslichaam Voorbereiding en Nikkel Matrix Binding <ol><li> De uiteindelijke OD 600 van &#39;s nachts expressie culturen in minimaal medium is variabel en should tussen 2,5 en 5,0. Neem een monster voor SDS-PAGE-analyse (equivalent van 50 pi van een cultuur van OD600 = 1) en verzamelen cellen door centrifugatie gedurende 20 min bij 5.000 x g. </li><li> Hersuspendeer celpellet van 1 L cultuur in 50 ml lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Celsuspensies worden bevroren opgeslagen voor latere verwerking. </li><li> Lyse cellen door sonicatie op ijs in de hoogste stand gedurende 1 minuut en rust op ijs gedurende 5 minuten. We gebruiken een Misonix sonicator 3000 (max. vermogen 600 watt) met een ½-inch high-intensity vervangbare tip. Herhaal sonicatie / koeling voor drie cycli. </li><li> Verzamel onoplosbare inclusielichamen (IB) materiaal door centrifugatie gedurende 15 min bij 20.000 xg en verwijder het supernatant. Een losse, dunne laag lichter gekleurde celresten kunnen zichtbaar bovenop de dichte IB pellet, dit kan worden weggespoeld met water of buffer onder zacht schudden. Stappen 3.3 en 3.4 kan worden herhaald om de zuiverheid van de fractie IB verbeteren als desirood. Monsters van pellet en supernatant materiaal moet worden genomen voor SDS-PAGE analyse trpLE-fusie TM lokalisatie bevestigen insluitingslichamen. </li><li> Los IB pellets in guanidine oplossing (6 M guanidine HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), met 25-50 ml per liter kweek verwerkt. Deze stap vereist verscheidene uren onder roeren en af ​​en toe lichte sonicatie. </li><li> Verwijder de IB lysaat door centrifugatie gedurende 1 uur bij 75,000-100,000 xg en 20 ° C. Giet het supernatant en filtreer door een 0,2 urn membraan. </li><li> Combineer het gezuiverde lysaat IB, in een 50 ml conische buis of een groter vat die veilig kan worden, afgesloten met nikkel affiniteitshars dat gewassen met water en geëquilibreerd met guanidine oplossing. Gebruik 3-4 ml vaste hars per liter kweek verwerkt fusies die uitdrukken in dezelfde mate als trpLE-DAP12TM here (Figuur 3, kolom 2). Batch binden door incubatie overnacht bij kamertemperatuur t<html> emperatuur met voorzichtig mengen. </li></ol> 4. Op de kolom oxidatieve verknoping <ol><li> Laad het IB lysaat / nikkel hars ophanging in een lege zwaartekracht kolom met poreuze bed steun, toe te voegen continu totdat het volledige volume stroomt door. Verzamel en opzij zetten de doorstroomsysteem, die nog kunnen bevatten ongebonden fusie-eiwit. </li><li> Was de nikkel hars door zwaartekracht met 5 bed volumes ureumoplossing (8 M ureum, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) met 5 mM β-ME. </li><li> Nogmaals Was de nikkel hars met 5 bedvolumes ureumoplossing zonder β-ME. </li><li> Was de nikkel hars een derde keer met 5 bed volumes ureumoplossing die is aangevuld met 20 pM CuSO 4 en 2 mM geoxideerd glutathion. Hierna was, sluit de kolomuitlaat en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur maximale disulfide bindingen mogelijk te maken. </li></ol> 5. Elutie TFA en kwantificering content &quot;&gt; LET OP: Trifluorazijnzuur (TFA) veroorzaakt ernstige brandwonden bij contact met de huid en dampen zijn zeer irriterend Geconcentreerde TFA mag alleen worden gebruikt in een goedgekeurde zuurkast met oogbescherming en non-latex handschoenen Controleer de chemische compatibiliteit van alle.. gebruikte materialen; polypropyleen is compatibel met alle stappen van dit protocol. <ol><li> Spoel de oxiderende ureumoplossing met 10 bedvolumes water en droog de kolom bed door het toepassen van een vacuüm lijn naar de kolom stopcontact. </li><li> Sluit de kolomuitlaat en voeg 1,5 bedvolumes nette (99-100%) TFA. Roer het nikkel hars met een kleine spatel een gelijkmatige blootstelling aan zuur zorgen en incubeer gedurende 5 minuten. Open de kolomuitlaat en verzamel de zure eluaat druk voorzichtig met een injectiespuit of persleiding zonodig te duwen alle vloeistof. </li><li> Herhaal de zure elutie stap met nog eens 1,5 bedvolumes nette TFA. Werken snel in deze fase om de volledige oplossing van het voorkomen Beaded agarose matrix. Eiwitrendement worden bepaald op dit punt volgens de Beer-Lambert vergelijking en de theoretische molaire extinctiecoëfficiënt van de trpLE-peptidesequentie. Verdun een monster van het eluaat TFA (1:20-1:50) in trifluorethanol (TFE) en meet de absorptie bij 280 nm, met TFA / TFE bij dezelfde verdunning als blanco. </li></ol> 6. CNBr Spijsvertering LET OP: cyanogeenbromide (CNBr) is uiterst giftig en mag uitsluitend behandeld in een goedgekeurde chemische dampkap worden. Persoonlijke beschermingsmiddelen inclusief veiligheidsbril, laboratoriumjas en niet-latex handschoenen zijn absoluut noodzakelijk. CNBr is voor vocht en reactieve worden gebracht kamertemperatuur opening. Neem contact op met de institutionele veiligheid kantoor voor meer informatie over neutralisatie / verkoop van CNBr-verontreinigde oplossingen en materialen. <ol><li> Verdun het zuur eluaat tot 80% uiteindelijke TFA concentratie door druppelsgewijze toevoeging van water onder mengen langzaam. Indien een neerslag wordt gevormd, eendd terug een klein volume (0,5 tot 1 ml) van nette TFA tot de oplossing helder, dan weer juist tot 80% met water. Ongeveer 5 pi pre-digest monster SDS-PAGE analyse bevriezen in vloeibare stikstof en vriesdrogen van het monster onmiddellijk. </li><li> Voeg CNBr kristallen tot ongeveer 0,2 g / ml, zorg ervoor dat de giftige chemische veilig wegen in gesloten, pre-gewogen buizen of met behulp van een evenwicht in de chemische dampkap. Meng voorzichtig tot het volledig opgelost. Spoel en verzegelen reactievat onder inert gas (stikstof of argon stroom) en 3-4 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. </li><li> Neem een ​​5 ul post-digest monster voor SDS-PAGE-analyse en bevriezen en lyofiliseren onmiddellijk. Breng het digest reactie op een geregenereerde cellulose dialyse cassette of buis (celluloseacetaat oplost in geconcentreerd zoutzuur) met een molecuulgewicht van 3,5 kDa cutoff of minder, afhankelijk van de grootte van het verwachte peptide complex. Dialyseer overnacht op 4 liter water in dezuurkast aan de TFA concentratie te verminderen en ontleden elke gereageerd CNBr. Laat ruimte in de cassette dialyse of slang een aanzienlijke toename in volume (wel twee tot drie maal) gedurende een nacht dialyse. </li><li> Verwijder de gedialyseerde reactieoplossing met gesuspendeerde precipitaat uit de cassette dialyse of buis (meestal eiwit precipiteren wanneer de TFA concentratie wordt verminderd) en breng de 50 ml conische buizen. Bevriezen en lyofiliseren om water en sporen van CNBr / TFA te verwijderen. Deze stap vereist wellicht enkele dagen. LET OP: Zowel de gedialyseerde digest reactie en de dialyse water verder moet worden behandeld als giftig en behandeld / afgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen. </li><li> Monsters van culturen van pre-inductie en oogst fasen insluitingslichaam supernatant en pellet, TFA eluaat en CNBr-verteerd materiaal kunnen worden geanalyseerd door SDS-PAGE. Bereid monsters door verhitting tot 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample-buffer. TFA eluaat en verteren monsters dienen te worden opgesteld in zowel reducerende en niet-reducerende omstandigheden naar het product identificatie en evaluatie van oxidatieve verknoping vergemakkelijken. </li><li> Scheid de monsters op een 12% NuPAGE bis-tris prefab acrylamide gel met MES SDS-loopbuffer voor optimale resolutie van de kleinste digest producten. </li></ol> 7. Omgekeerde-fase HPLC Zuivering van Disulfide-verknoopte peptide complexen <ol><li> Los tot 100 mg gelyofiliseerd digest producten in 2-3 ml mierenzuur en netjes laden op een preparatieve schaal (21,2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 kolom C3 PrepHT in oplosmiddel A (typisch 10-20% acetonitril of 5 -10% isopropanol in water met 0,1% TFA). </li><li> Elueer het digest producten in een gradiënt van oplosmiddel B (acetonitril of isopropanol met 0,1% TFA) over tenminste 5 kolomvolumes. Zie discussie suggesties over de selectie van optimale gradiëntomstandigheden voor verschillende peptidesequenties. </li><li> Nemen50-100 pi monsters van elke fractie HPLC voor SDS-PAGE analyse en bevriezen en lyofiliseren onmiddellijk. Verwijdering van HPLC oplosmiddelen snel en moet volledig in 1-2 uur. </li><li> Bereid gevriesdroogd HPLC monsters voor SDS-PAGE door verwarmen tot 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS-monsterbuffer zonder reducerend middel. Koel af en split elk monster gelijkmatig in 2 microcentrifugebuisjes, het toevoegen van 100 mM DTT aan een van hen en re-verwarming kort. </li><li> Scheid de gereduceerde en niet-gereduceerde monsters op een HPLC 12% NuPAGE bis-tris prefab acrylamide gel met MES-SDS lopende buffer zoals hierboven. Kleine, hydrofobe peptiden vaak niet nemen Coomassie goed vlekken en kan niet draaien op hun verwachte molecuulgewichten. Moet echter vergelijking van gereduceerde en niet-gereduceerde monsters eerder herkennen van de verknoopte peptide producten en beoordeling van zuiverheid. </li><li> Analyseer de kandidaat-peptide fracties by matrix-assisted laser desorptie ionisatie time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie (zie bespreking) om de soorten van belang vast te stellen en te bevestigen de verwachte massa. </li><li> Combineer, invriezen en lyofiliseren HPLC fracties met het zuivere, verknoopte TM peptide complex en neemt een drooggewicht van het eindproduct te bepalen opbrengst. Fracties met een hoog isopropanol inhoud kan niet blijven bevroren. Als peptidefracties beneden drogen tot een film dan een pluizig gevriesdroogd product, volledig opnieuw oplossen van de film in een klein volume zuiver hexafluorisopropanol (HFIP), invriezen en lyofiliseren weer. De HFIP behandelde product moet een kleine, witte kegel die gemakkelijk wordt getipt uit en gewogen worden. </li></ol>

<ol><li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+into+the+blind+spot%3A+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li>
<li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li>
<li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface%3A+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li>
<li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li>
<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li>
<li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li>
<li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li>
<li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment%2C+CB2%28180-233%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li>
<li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li>
<li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li>
<li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li>
<li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li>
<li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer%27s+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li>
<li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li>
<li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Expressie van TM trpLE-fusies. Onze ervaring is trpLE-TM fusies slecht uitgedrukt in rijke kweekmedium bij 37 ° C en de kweekomstandigheden hier beschreven zijn effectief gebleken voor verschillende sequenties die een tot vier domeinen met TM opbrengsten variërend 50 tot 150 mg / L zuiver, intact fusie. Fusies coderen drie of vier TM GPCR fragmenten (humane CCR5-TM1 TM3 en TM4-TM7 respectievelijk) of een kern katalytisch fragment van humaan signaalpeptide peptidase (vier domeinen TM, zie ref 15) het ...

Dit protocol gegevens een procedure we hebben ontwikkeld om disulfide-gestabiliseerde complexen van transmembraan (TM) peptiden voor structurele studies met oplossing NMR produceren. De procedure maakt gebruik van de robuuste expressie geboden door de ΔtrpLE1413 fusiesysteem (zie hieronder) en kunnen TM peptide complexen gedefinieerde samenstelling worden gegenereerd met behulp van geavanceerde stabiele isotopen labeltechnieken voor moderne multi-dimensionale NMR experimenten. Wij hebben gebruik gemaakt van deze technieken naar verschillende NMR structuren die belangrijke nieuwe informatie over hoe lymfocyt-activerende immunoreceptors zijn opgebouwd uit meerdere membraan eiwitsubeenheden door interacties tussen de TM-domeinen (recent beoordeeld in 1) geopenbaard te bepalen. Deze technieken zijn van toepassing op vele andere membraaneiwit systemen alsmede diverse downstream analysemethoden naast oplossing NMR. Terwijl de hier gegeven voorbeeld maakt gebruik van inheemse cysteïnerestenom een ​​complex dat de natuurlijk disulfide-gebonden eiwit nabootst, het ontwerp is ook geschikt voor het maken van kunstmatige disulfide bindingen met complexen die normaal worden bijeengehouden door zwakkere niet-covalente interacties, zoals homo-en hetero-dimere TM complexen stabiliseren epidermale groeifactor receptor (EGFR)-familie eiwitten 2-4 of heterodimere αβ integrine complexen 5,6. Zeer hydrofoob peptide sequenties zoals die afgeleid van de lipide dubbellaag omspannende delen van TM eiwitten zijn bijzonder moeilijk onderwerpen voor biochemische en biofysische studies. Behalve zeer moeilijk te manipuleren met behulp van standaard eiwitten en peptiden chemische technieken, ze zijn vaak toxisch voor cellen en zijn daarom moeilijk recombinant produceren. We 7,8 en anderen negen-elf hebben gehad groot succes uitdrukken zulke moeilijke peptidesequenties in bacteriën als in-frame carboxyterminalefusies met een aangepaste versie van de ΔtrpLE1413 sequentie afgeleid uit de E. coli trp operon 12. De ~ 13 kDa trpLE polypeptide gecodeerd door deze sequentie worden geproduceerd met hoge niveaus onder een T7 promoter en geheel gelokaliseerd insluitingslichamen waar problemen inzake toxiciteit en / of instabiliteit worden omzeild. Wijziging van de sequentie door toevoeging van een amino-terminale histidine tag 9-13 en eliminatie van interne methionine en cysteine ​​residuen van de sequentie 14 trpLE toegestaan ​​trpLE-peptide fusies gezuiverd worden door metaal-ion affiniteitschromatografie en geknipt met cyanogeenbromide (CNBr ) om de gewenste peptidesequentie vrij. We hebben met succes gebruikt dit systeem om de meer dan een dozijn verschillende sequenties als trpLE fusies die membraaneiwit fragmenten die maar liefst vier TM-domeinen bevatten uiten (7,8 en niet gepubliceerde resultaten, zie ook DISCUSSIE sectie). Debelangrijke innovatie in dit protocol is de identificatie van de voorwaarden waaronder de ongestructureerde en zeer slecht oplosbaar trpLE-TM fusies kan efficiënt disulfide-verknoopt in het kader van een gestroomlijnde workflow. Verschillende aspecten van high-yield expressie, behandeling en zuivering van peptide producten zijn ook goed geoptimaliseerd en de aanbevelingen hier gepresenteerde even relevant voor de productie van niet-disulfide-verknoopte (monomeer) TM peptide producten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cyanogeenbromide </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> GEVAARLIJKE STOF. GEVAARLIJKE GOEDEREN. Zeer vergiftig bij inademing, aanraking met de huid en bij opname door de mond. In contact met zuren Vormt zeer giftig gas. Zeer vergiftig voor in het water levende organismen, kan op lange termijn schadelijke effecten veroorzaken in het aquatisch milieu. </td></tr><tr><td> Trifluorazijnzuur </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, CAS-nummer 76-05-1 </td><td> GEVAARLIJKE STOF. GEVAARLIJKE GOEDEREN., Veroorzaakt ernstige brandwonden. Schadelijk bij inademing. Schadelijk voor in het water levende organismen, kan op lange termijn schadelijke effecten veroorzaken in het aquatisch milieu. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, CAS-nummer 60-24-2 </td><td> GEVAARLIJKE STOF. GEVAARLIJKE GOEDEREN. Vergiftig bij inademing, aanraking met de huid en bij opname door de mond. Irriterend voor de huid. Gevaar voor ernstig oogletsel. Kan overgevoeligheid veroorzaken bij contact met de huid. Zeer vergiftig voor in het water levende organismen, kan op lange termijn schadelijke effecten veroorzaken in het aquatisch milieu. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Productnummer 52512, CAS-nr. 920-66-1 </td><td> GEVAARLIJKE STOF. GEVAARLIJKE GOEDEREN. Schadelijk bij inademing en opname door de mond. Veroorzaakt brandwonden. </td></tr><tr><td> Mierenzuur </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Ontvlambare vloeistof en damp. Veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel. </td></tr><tr><td> Ureum </td><td> UNIVAR, AJAX FINECHEM </td><td> Productnummer, 817, CAS-No 57-13-6 </td><td> Bij verhitting, decomposes tot koolstofdioxide en ammoniak bij verbranding, stoot kleine hoeveelheden stikstofoxiden. Kan leiden tot roodheid en irritatie aan huid en ogen. </td></tr><tr><td> Guanidinehydrochloride </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS-nummer: 50-01-1 </td><td> Schadelijk bij opname door de mond, Veroorzaakt ernstige oogirritatie, Veroorzaakt huidirritatie, acute toxiciteit Oraal, irriterend voor de huid, irriterend voor de ogen. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Productnummer-T8532 CAS-nr: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 is een niet-ionische detergent, 100% actief bestanddeel, die vaak wordt gebruikt in biochemische toepassingen eiwitten oplosbaar. Triton X-100 heeft geen antibacteriële eigenschappen en als een relatief milde niet-denaturerend detergens </td></tr><tr><td> Zijn-Select Nikkel-Affiniteit gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Winkel Num-P6611 </td><td> IS-Select Nikkel Affiniteit Gel is een geïmmobiliseerd metaal-ion affiniteitschromatografie (IMAC) product. De HIS-Select Nickel Affinity gel is een eigen viertandige chelaat op agarose kralen geladen met nikkel die ontworpen is om specifiek te binden histidine bevattende eiwitten. </td></tr><tr><td> (-)-Glutathion, geoxideerd </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Winkel num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (uit productie) </td><td> Max vermogen 600 Watt. 1/2-inch vervangbare-tip sonde neemt 1/2-inch hoge intensiteit, high-volume tips en een reeks van hoge intensiteit, laag-volume tips. Dichtstbijzijnde modellen die nu verkrijgbaar bij dit bedrijf zijn Q500 en Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatografie systeem, Software Versie 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Winkel Num 760-0047, Config No: AU500571, Serienummer: 484BR3705 </td><td> Peptiden bindt aan fase HPLC kolommen te keren in hoge aqueous mobiele fase en worden geëlueerd van RP HPLC-kolommen met een hoog organische mobiele fase. In RP HPLC peptiden worden gescheiden op basis van hun hydrofobe karakter. Peptiden kunnen worden gescheiden door het uitvoeren van een lineaire gradiënt van het organische oplosmiddel. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytische HPLC kolom, 21,2 x 150 mm, 5 urn deeltjesgrootte </td><td> Agilent </td><td> Product No: 895150-909 </td><td> Omgekeerde fase HPLC colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gels </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Pre cast gels voor eiwitelektroforese </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Dialyse Cassettes, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Product No: 87724 </td><td> Voorbeeld dialyse </td></tr></tbody></table>

productie van disulfide gestabiliseerde transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Fysieke interactie tussen het lipide-ingebedde alpha-helix domeinen van membraaneiwitten spelen een cruciale rol in vouwing en assemblage van membraaneiwit complexen en dynamische processen zoals transmembraan (TM) signalisatie en regulatie van celoppervlak eiwitniveaus. Begrijpen van de structurele kenmerken de associatie van een bepaalde sequenties vereist geavanceerde biofysische en biochemische analyses van TM peptide complexen. De extreme hydrofobiciteit van TM domeinen maakt ze zeer moeilijk te manipuleren met behulp van standaard peptide chemische technieken en productie van geschikte studiemateriaal blijkt vaak onbetaalbaar uitdaging. Het identificeren van de voorwaarden waaronder peptiden kan aannemen stabiele spiraalvormige conformaties en vorm complexen spontaan voegt een extra moeilijkheidsgraad. Hier wordt een procedure voor de productie van homo-of hetero-dimere TM peptide complexen uit materialen die worden uitgedrukt in E. coli, zodat opname van stabiele isotooplabels voor nucleaire magnetische resonantie (NMR) of niet-natuurlijke aminozuren voor andere toepassingen relatief goedkoop. De belangrijkste innovatie in deze methode is dat TM complexen worden geproduceerd en gezuiverd zoals covalent verbonden (disulfide-verknoopte) samenstellingen die vormen stabiele, homogene en stoichiometrische structuren na reconstitutie in detergent, lipide of andere membraan-mimetische materiaal. We presenteren ook zorgvuldig geoptimaliseerde procedures voor expressie en zuivering die evenzeer van toepassing of het produceren van een TM-domeinen of verknoopt complexen en geven advies voor de aanpassing van deze methoden om nieuwe TM sequenties.

Het expressieniveau bereikt trpLE fusies is variabel en sterk afhankelijk van de aminozuursequentie van de bijgevoegde peptide. Figuur 3 toont de SDS-PAGE analyse van pre-inductie (laan 1) en time-of-oogst (laan 2) monsters uit een cultuur die ongeveer 120 mg zuivere, intacte trpLE-DAP12TM fusie van 1 liter cultuur en 4 ml nikkel matrix opgeleverd. Alle trpLE-fusie DAP12TM was gelokaliseerd in het insluitingslichaam pellet (baan 4) tegenover supernatant (laan 3). Ongeveer 70...

Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Dit protocol produceert covalent gestabiliseerde complexen van transmembraanpeptiden voor structurele studies gericht op het begrijpen hoe membraaneiwitten met elkaar interageren via hun in lipiden ingebedde domeinen. Ten eerste, druk een hist-getagde fusie-eiwit aan dat de transmembraansequentie van belang bevat in e coli. Vervolgens, extraheer het eiwit uit de inclusielichaamfractie met behulp van guine en detergent met behulp van een nikkelaffiniteitsmatrix.Concentreer het hist-getagde fusie-eiwit en kruislink het met disulfide naar de diametrische vorm door de kolom te wassen in een oplossing die oxiderende middelen bevat. Vervolgens, elueer het gekruisverbonden fusie-eiwit in Tri Fluor azijnzuur en behandel met cyanogen bromide om de fusiepartner vrij te maken en ga door met het isoleren van het gekruisverbonden peptideproduct uit de verteringsmix door omgekeerde fase HPLC. Uiteindelijk worden de identiteit en zuiverheid van de producten geverifieerd door SDS-pagina en massaspectrometrie analyses.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat pure sociometrische complexen worden geproduceerd voor structurele studies met behulp van technieken zoals oplossing of vaste stof

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een protocol voor de kwantitatieve, high throughput screening expressie en analytische zuivering van fusie-eiwitten uit kleinschalige Escherichia coli culturen wordt beschreven en toegepast om de expressie van disulfide-rijke dierlijke gif eiwit targets.

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em&gt; E. coli</em

Een werkwijze wordt beschreven voor een efficiënte zuivering van twin-Strep-gemerkte fusie-eiwitten en hun specifieke complexen van gemodificeerde streptavidine (Strep-Tactin) hars covalent verknoopt met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3). De methode heeft de voordelen van hoge snelheid, goede doeleiwit terugwinning en hoge zuiverheid, en is compatibel met daaropvolgende analyse door massaspectrometrie.

Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)

Om kankermedicijnen met hoge specificiteit en verminderde bijwerkingen naar tumorlocaties te brengen, zijn nieuwe methoden op basis van nanodeeltjes vereist. Hier beschrijven we disulfide-gekruiste micellen die gemakkelijk kunnen worden bereid door waterstofperoxide-gemedieerde oxidatie en die zich efficiënt kunnen dissociëren in een reducerende tumoromgeving om ladingen vrij te geven.

Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

We presenteren een protocol voor de bouw van thioether/vinyl sulfide-aangebonden spiraalvormige peptiden met behulp van foto-geïnduceerde thiol-Ono/thiol-yne hydrothiolation.

Bouw van de Thioether/Vinyl Sulfide-aangebonden Helical peptiden Via foto-geïnduceerde Thiol-Ono/yne Hydrothiolation

Hier presenteren we een procedure fluorescently functionalize de disulfides op Qβ VLP met dibromomaleimide. We beschrijven Qβ meningsuiting en zuivering, de synthese van dibromomaleimide-matiemaatschappij moleculen en de vervoeging reactie tussen dibromomaleimide en Qβ. Het resulterende gele fluorescerende geconjugeerd deeltje kan worden gebruikt als een fluorescentie sonde binnen cellen.

Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken

Een protocol voor de synthese van een 1,2-dithiolane gemodificeerde peptide en de karakterisatie van de supramoleculaire structuren die voortvloeien uit de peptide zelf-assemblage.

Synthese en karakterisering van 1,2-Dithiolane gemodificeerde zelfassemblerende Peptides

Cysteïne-rijke peptides vouwen in verschillende driedimensionale structuren afhankelijk van hun verbindingen bisulfide. Gerichte synthese van individuele bisulfide isomeren is vereist wanneer de buffer oxidatie leidt niet tot de gewenste bisulfide-connectiviteit. Het protocol behandelt de selectieve synthese van peptiden 3-bisulfide-gebonden en hun structurele analyse met behulp van NMR- en MS/MS studies.

Synthese en structuurbepaling van µ-Conotoxin PIIIA-isomeren met verschillende Disulfide Connectivities

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. Een eenvoudige methode om multimeric complexen te analyseren die door deze aaneenschakelingen worden gestabiliseerd is door niet-vermindert SDS-pagina analyse. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS.

Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd

Leer een protocol voor de productie van disulfide-gestabiliseerde transmembraanpeptidecomplexen voor structurele studies met behulp van NMR-analyse. Deze methode ondersteunt onderzoek naar membraaneiwitinteracties.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Meer video's verkennen