Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Dit protocol produceert covalent gestabiliseerde complexen van transmembraanpeptiden voor structurele studies gericht op het begrijpen hoe membraaneiwitten met elkaar interageren via hun in lipiden ingebedde domeinen. Ten eerste, druk een hist-getagde fusie-eiwit aan dat de transmembraansequentie van belang bevat in e coli. Vervolgens, extraheer het eiwit uit de inclusielichaamfractie met behulp van guine en detergent met behulp van een nikkelaffiniteitsmatrix.

Concentreer het hist-getagde fusie-eiwit en kruislink het met disulfide naar de diametrische vorm door de kolom te wassen in een oplossing die oxiderende middelen bevat. Vervolgens, elueer het gekruisverbonden fusie-eiwit in Tri Fluor azijnzuur en behandel met cyanogen bromide om de fusiepartner vrij te maken en ga door met het isoleren van het gekruisverbonden peptideproduct uit de verteringsmix door omgekeerde fase HPLC. Uiteindelijk worden de identiteit en zuiverheid van de producten geverifieerd door SDS-pagina en massaspectrometrie analyses.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat pure sociometrische complexen worden geproduceerd voor structurele studies met behulp van technieken zoals oplossing of vaste stof NMR. Zelfs wanneer twee transmembraandomeinen bekend zijn om met elkaar te interageren, zijn peptideoplosbaarheid en complexvorming vaak in tegenspraak onder experimentele omstandigheden. Beginnen met een goed gedefinieerd covalent gestabiliseerd complex kan het bereik van experimentele omstandigheden dat kan worden getest voor hoge kwaliteit gegevensverzameling aanzienlijk verbreden.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen met de moeilijkheid van het omgaan met deze extreem hydrofobe eiwitfragmenten. Dit protocol en de adviezen die in het bijbehorende manuscript worden gegeven, zijn ontworpen om eenvoudige oplossingen te bieden voor enkele van de meest voorkomende uitdagingen in het voorspellings- en zuiveringproces. Palate, een liter bacteriecultuur die het tripe-peptidefusie-eiwit tot expressie brengt en resuspendeert in 50 milliliter lysisbuffer.

Voer vervolgens drie cycli van sonicatie uit met maximale output gedurende één minuut en koel gedurende vijf minuten op ijs. Oogst het onoplosbare inclusielichaammateriaal door centrifugatie bij 20.000 G gedurende 15 minuten, decant en zet het supernatant opzij. De sonicatie- en centrifugatiestap kan worden herhaald als een verbeterde zuiverheid van de IB-fractie vereist is.

Reserveer monsters van de pellet en het supernatantmateriaal voor SDS-pagina-analyse om de trip te bevestigen. TM-fusie lokalisatie naar inclusielichamen, los nu de inclusielichaamspellets op in guine-oplossing met tussen 25 en 50 milliliter per liter cultuur. Verwerk de mix voorzichtig op kamertemperatuur gedurende enkele uren met af en toe sunatie.

Verduidelijk vervolgens het inclusielichaamlysaat door centrifugatie bij 75.000 tot 100.000 keer G gedurende één uur. Filter het supernat op kamertemperatuur door een 0,2 micron membraan in een 50 milliliter conische buis. Combineer het verduidelijkte inclusielichaamlysaat met nikkelaffiniteitshars dat is geëquilibreerd naar guine-oplossing om batchbindend te zijn.

Meng de suspensie voorzichtig een nacht bij kamertemperatuur. Laad de inclusielichaamlysaat nikkelhars suspensie in een lege zwaartekrachtstroomkolom met poreus beddenondersteuning totdat het volledige volume erdoorheen stroomt. Verzamel en zet de flow-through opzij die mogelijk nog niet-gebonden fusie-eiwit bevat.

Was vervolgens het nikkelhars door zwaartekracht. Stroom met vijf beddenvolumen ureumoplossing die vijf millimolar beam mercaptoethanol bevat. Voer een tweede wassing uit zonder beam mercaptoethanol voor de derde wassing.

Gebruik ureumoplossing aangevuld met kopersulfaat en geoxideerde glutathion. Sluit vervolgens de kolomuitlaat en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om maximale disulfidebindingsvorming mogelijk te maken. Was de oxiderende ureumoplossing weg met 10 beddenvolumen water.

Breng vervolgens een vacuümlijn aan om de kolombed te drogen en sluit de kolomuitlaat. Voeg nu in een chemische veiligheidskap 1,5 beddenvolumen pure TFA toe, roer het nikkelhars met een kleine spatel om een gelijkmatige blootstelling aan zuur te garanderen en incubeer gedurende vijf minuten. Verzamel de zuureluaat door voorzichtig te drukken met een gecomprimeerde luchtleiding, indien nodig, om alle vloeistof eruit te duwen.

Herhaal de zuurverdunningsstap met nog eens 1,5 beddenvolumen pure TFA. Om de eiwitopbrengst te meten, maak verdunning van de TFA EIT in trifluorethanol en meet de absorptie bij 280 nanometer tegen A-T-F-A-T-E. Verdun de zuureluaat tot 80%eind-TFA-concentratie door druppelsgewijs toe te voegen. Toevoeging van water tijdens voorzichtig mengen.

Als er precipitaat vormt, voeg dan een kleine hoeveelheid TFA toe totdat de oplossing helder wordt. Corrigeer vervolgens naar 80%met water. Reserveer een vijf microliter predigests monster voor SDS-pagina-analyse en bevries het onmiddellijk in vloeibare stikstof.

Weeg vervolgens cyanogenbromidekristallen voor ongeveer 0,2 gram per milliliter monster. Zorg ervoor dat u de giftige chemische stof veilig weegt. Voeg het cyanogenbromide toe aan het monster in een veiligheidskaps en meng voorzichtig tot het volledig is opgelost.

Spoel nu het reactievat met inert gas af en incubeer gedurende drie tot vier uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Reserveer een vijf microliter postdigests monster voor SDS-pagina-analyse, bevries het onmiddellijk in vloeibare stikstof en lyofiliseer het samen met het predigests monster. Breng vervolgens de verteringsreactie over naar een geregenereerde cellulose dialysecassette, waardoor een aanzienlijke toename van het volume mogelijk is.

Dialyseer het monster gedurende een nacht tegen vier liter water in de chemische vrouwkap. Verwijder de volgende ochtend de gedialyseerde reactieoplossing met gesuspendeerd eiwitprecipitaat uit de dialysecassette en breng de suspensie over in een 50 milliliter conische buis. Vries en lyofiliseer vervolgens het monster gedurende enkele dagen om het water en