Name: Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Leer een protocol voor de isolatie van atriale en ventriculaire cardiomyocyten uit genetisch gemanipuleerde muizen voor elektrofysiologische studies. Deze methode maakt patch clamp-opnamen van Kv-kanalen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung en Charite / MDC.

1. Animal Anesthesie en het oogsten van organen <ol><li> Verdoven de muis door intraperitoneale (ip) injectie van Ketamine (200 mg / kg BW) en xylazine (20 mg / kg BW). </li><li> Om anticoagulate injecteren 250 IE Heparine ip om de bloedstolling en trombose te voorkomen. </li><li> Wacht tot diepe narcose bereikt, die wordt gekenmerkt door areflexie. Om te controleren of areflexie, test cornea reflex door voorzichtig aan te raken het hoornvlies of de testvlucht reflex door staart knijpen. </li><li> Breng de muis op operatietafel en zet deze vast in rugligging. </li><li> Incise de huid en de buikwand onder de zwaardvormig en voer clamshell thoracotomie: de snede aan beide zijden strekken zich uit langs de ribbenboog en vervolgens delen van ribben in de mediale axillaire lijn, af te buigen de ribbenkast naar boven. </li><li> Open pericardium, zoek grote vaten. Druk zachtjes op het hart caudaal van beter weer te geven van de aorta. Klem de aorta behulp van een tang. </li><li> Plaats het hart holte van een paar s<html> cissors en ontleden alle verbindingskabels schepen met een enkele snit. Zorg ervoor dat u een groot genoeg deel van de aorta ascendens voor Langendorff canulatie behouden. </li><li> Onmiddellijk over uitgesneden hart een Petri schaal gevuld met ijskoud en pre-oxygenized oplossing 1 (oplossingen, zie tabel 1). </li></ol> 2. Voorbereiding van Hart en Langendorff perfusie <ol><li> Canule de aorta met een 1.8F stalen canule. Zorg ervoor dat u luchtembolie te voorkomen. </li><li> Fixeren aorta op de canule met een chirurgische hechtdraad en gelijk kransslagaders met 1 ml van oplossing 1. </li><li> Verbinding canule met een Langendorff-apparaat. </li><li> Zorg ervoor dat de tijd van thoracotomie tot Langendorff cannulatie niet meer dan 120 sec tot uitgebreide ischemie / reperfusie schade te voorkomen aan de hartspier. </li><li> Perfuseren hart met 10 ml van Ca2 + vrije oplossing 2 (4 ml / min). </li><li> Perfuseren hart met collagenase oplossing 3 8 min. (4 ml / min). </li></ol>le &quot;&gt; 3. Microchirurgische Dissociatie van hartkamers <ol><li> Transfer hart in een voorverwarmde 100 mm petrischaal met laag Ca2 + oplossing 4. </li><li> Verwijder voorzichtig de aorta en andere niet-cardiale weefsel met een schaar en gooi deze weg. </li><li> Aparte atria en de ventrikels en afzonderlijk verder te gaan met elke kamer. Houden cellen ondergedompeld in oplossing 4. Gebruik kleine hoeveelheden (minder dan 5 ml). </li></ol> 4. Verdere Dissociatie van cardiomyocyten <ol><li> Atriale cardiomyocyten: <ol><li> Te individualiseren atriale cardiomyocyten de atria over in een aparte voorverwarmde 100-mm cultuur schotel en dissociëren van het weefsel door middel van het voorzichtig uit elkaar met fijne pincet. Zorgen voor een nagenoeg volledige dissociatie van het weefsel. </li><li> Gebruik een pipet 1 ml met een vergrote vuurgepolijst plastic pipet om de cellen te schorten in 1 ml van oplossing 5 gedurende 5 minuten. </li><li> Scheid de cellen van afval door gebruik van een mobiele filter (200 pm maaswijdte). </li> &lt;li&gt; Voeg 5 ml oplossing 5 aan de celsuspensie en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16 xg bij kamertemperatuur. </li><li> De volgende stappen worden uitgevoerd onder een celkweek kap. Verwijder het supernatant en geresuspendeerd de pellet in 5 ml oplossing 6. </li><li> Na bezinking door zwaartekracht gedurende 10 min in een 15 ml buisje gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 16 xg bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen, afhankelijk van de hoeveelheid daarvan in 1-5 ml van de oplossing 6. </li></ol></li><li> Ventriculaire cardiomyocyten: <ol><li> Ontleden de linkerventrikel gebied van belang met fijne forceps in 5 ml oplossing 4. </li><li> Schorsen cellen voorzichtig pipetteren totdat het meeste cellen worden gescheiden. Breng de celoplossing na filtering (200 um maaswijdte) in een 50 ml buis, voeg een volume van 25 ml. </li><li> Centrifugeer gedurende 2 min. bij 16 xg bij kamertemperatuur. </li><li> De volgende stappen worden uitgevoerd onder een celkweek kap. Supernatant te verwijderen, resuspendeer de pellet in 25 mlOplossing 6 en laat sedimentatie van de cellen gedurende 10 minuten. </li><li> Tel de cellen en verwijder het supernatant, voeg 25 - 50 ml oplossing 6 op de cellen. </li></ol></li></ol> 5. Voorbereiding van cardiomyocyten voor Cellulaire elektrofysiologie, Biochemische of IF Studies <ol><li> Voor elektrofysiologie studies Houd de myocyten in oplossing 6 in een 50 ml buis en remmen sedimentatie. </li><li> Voor biochemische studies, bijv. calcium beeldvorming plaat myocyten op laminine beklede celkweekschaal (eindconcentratie 20 ug / ml laminine in PBS). </li><li> Voor immunofluorescentiekleuring stelt een celkweekschaal plaat met glazen dekglaasjes en gecoat met laminine oplossing (eindconcentratie 50 ug / ml laminine in PBS). <ol><li> Verwijder de oplossing voor het uitplaten myocyten. Plaat de cellen en controle van de celdichtheid met behulp van een microscoop. </li><li> Laat de myocyten zich aan slip gedurende 1 uur bij 37 ° C zijn in 2% CO 2, verwijdert de oplossingen onmiddellijk beginnen met een standaard kleuringsprocedure protocol. </li><li> Incuberen met fixatief, bijvoorbeeld 4% PFA in PBS (pH 7,5) gedurende 10 min bij kamertemperatuur en volgen drie wasstappen PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> De cellen permeabiliseren en remmen onspecifieke antilichaambinding de myocyten incuberen met 10% serum, 0,3% Triton, 0,2% BSA in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Incuberen met het primaire antilichaam gedurende 1 uur bij 37 ° C en was zoals eerder beschreven. </li><li> Incuberen met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De kernen tegenkleuring en α-actinine gebruik DAPI en fluorochroom geconjugeerd phalloidin (Alexa Fluor 488, Invitrogen). </li><li> Na het wassen de overdracht van de glazen dekglaasjes voorzichtig van silaan behandeld microscoopglaasjes en embed cellen in fluorescentie fixeermiddel. </li></ol></li></ol> 6. Cellular Elektrofysiologie <ol><li> Voer Whole-cell patch-clamp opnamen op frequentieshly geïsoleerde atriale en ventriculaire hartspiercellen bij kamertemperatuur. </li><li> Overdracht gezonde verschijnen cardiomyocyten in perfusie kamer gevuld met een bepaald volume van de extracellulaire bad oplossing. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH 2PO 4, 4 mM NaHCO3, 1,7 mM MgCl2, 3 mM CoCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose en 0,02 mM tetrodotoxine (TTX) (pH 7,4) . Gebruik NaOH voor pH-waarde-aanpassing. </li><li> Gebruik de juiste patch-clamp-apparatuur (dat wil zeggen IX71 omgekeerde microscoop, een Multiclamp 700B versterker, een Digidata 1440A acquisitie systeem en PC met pClamp10.3 software (Molecular Devices)). </li><li> Gebruik patch pipetten met weerstanden van 3-5 MQ gevuld met intracellulaire oplossing die 130 mM KCl, 2 mM MgCl2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0,4 mM GTP Na 2, 5 mM Na 2 CP en 4,9 mM CaCl2 (pH 7,2). Gebruik KOH voor pH-waarde-aanpassing. </li><li> Evoke uiterlijke K + stromen during 4,5 sec voltage stappen potentialen tussen -60 en +50 mV in stappen van 10 mV van een bedrijf potentiaal van -70 mV na een 20 msec tot -40 mV prepulse testen. </li><li> Zorg ervoor dat lekstromen zijn altijd &lt;100 pA. </li><li> Voor dissectie van verschillende K + stromen met specifieke remmers zoals 4-aminopyridine (4-AP, ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2, Alomone) of tetraethylammonium (TEA, Sigma). Stock oplossingen moeten worden bereid in de extracellulaire bad-oplossing, en rechtstreeks op de dichtst mogelijke nabijheid van de cel via een microtip na &quot;baseline&quot;-opnames. Equilibratie moeten worden toegestaan ​​voor 2-3 min. voor &quot;drug&quot;-opnames. </li><li> Voor de analyse normaliseren huidige amplitudes in individuele cellen om de celgrootte (whole-celmembraan capaciteit). Gegevens analyseren offline met behulp van pClamp10.3 software (Molecular Devices) of vergelijkbare software. </li></ol>

<ol><li>Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+all+voltage-gated+potassium+channels+use+MiRPs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?</a> Circ. Res. 88, 981-983 (2001).</li>
<li>Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRP1+forms+IKr+potassium+channels+with+HERG+and+is+associated+with+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia.</a> Cell. 97, 175-187 (1999).</li>
<li>Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+voltage-gated+K%2B+channel+subunits+in+adult+rat+heart.+Relation+to+functional+K%2B+channels%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?</a> Circ. Res. 77, 361-369 (1995).</li>
<li>Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+atrial+fibrillation+on+the+risk+of+death%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 98, 946-952 (1998).</li>
<li>Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+the+calcium-independent%2C+depolarization-activated+K%2B+currents+in+rat+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).</li>
<li>Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atrial+ion+channel+and+transporter+subunit+gene-expression+remodeling+associated+with+valvular+heart+disease+and+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 471-481 (2005).</li>
<li>Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+transient+outward+K%2B+current+diversity+in+mouse+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).</li>
<li>Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNE3+mutation+V17M+identified+in+a+patient+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation.</a> Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).</li>
<li>Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+KCNQ1+current+by+atrial+fibrillation-associated+KCNE4+%28145E%2FD%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med.+J.+%28Engl.%29%22%5BJournal%5D)">Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism.</a> Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).</li>
<li>McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MinK-related+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The MinK-related peptides.</a> Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).</li>
<li>Pongs, O., Schwarz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancillary+subunits+associated+with+voltage-dependent+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels.</a> Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).</li>
<li>Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+function+in+IKs+secondary+to+a+mutation+in+KCNE5+associated+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).</li>
<li>Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+97T+polymorphism+in+KCNE5+to+risk+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation.</a> Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).</li>
<li>Roepke, T. K., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+and+cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics and cardiac ion channels.</a> Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).</li>
<li>Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+kcne2+impairs+ventricular+repolarization+via+disruption+of+I%28K%2Cslow1%29+and+I%28to%2Cf%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f).</a> FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).</li>
<li>Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+polymorphism+associated+with+antibiotic-induced+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).</li>
<li>Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+in+KCNE1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation in KCNE1-null mice.</a> Circ. Res. 97, 62-69 (2005).</li>
<li>Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+KCNE2+gain-of-function+mutation+in+patients+with+familial+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation.</a> Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).</li>
<li>Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+association+of+single+nucleotide+polymorphism+of+slow+delayed+rectifier+K%2B+channel+genes+with+atrial+fibrillation+in+Han+nationality+Chinese%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Xin.+Xue.+Guan.+Bing.+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">[The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese].</a> Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((minK-related+peptide+1+associates+with+Kv4.2+and+modulates+its+gating+function%3A+potential+role+as+beta+subunit+of+cardiac+transient+outward+channel%3F+Circ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ.</a> Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Met de groeiende ontwikkeling van genetisch gemanipuleerde muizenstammen de hartfunctie en cardiale pathologie over gendeletie bestuderen er ook een toenemende belangstelling voor gespecialiseerde methoden om de effecten van het specifieke gen deletie in vitro bestuderen. In ons laboratorium bestuderen we de rol van een familie van Kv kanalen bijkomende subeenheden op de cardiale repolarisatie. De KCNE genen bestaan ​​uit een gezin van 5 genen (KCNE1-5) die een belangrijke rol in de menselijke...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> Tetrodotoxine </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> 4-aminopyridine </td><td> ICN Biomedicals </td></tr><tr><td> Heteropodatoxin 2 </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> Tetraethylammo </td><td> Sigma Chemicals </td></tr><tr><td> Collagenase Type 2 </td><td> Worthington </td></tr></tbody></table>

isolatie en kv channel opnamen in murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genen coderen voor een kleine familie van Kv kanalen bijkomende subeenheden die heteromere complexen met Kv kanalen alfa subeenheden vormen om hun functionele eigenschappen te wijzigen. Mutaties in KCNE genen zijn gevonden in patiënten met hartritmestoornissen zoals lange QT syndroom en / of atriale fibrillatie. De precieze moleculaire pathofysiologie die leidt tot die ziekten nog onduidelijk. In eerdere studies de elektrofysiologische eigenschappen van de ziekte veroorzakende mutaties in deze genen zijn meestal onderzocht in heterologe expressie systemen en we kunnen niet zeker of de gerapporteerde effecten kunnen direct worden vertaald in de moedertaal van hartspiercellen. In ons laboratorium hebben we daarom gebruik maken van een andere aanpak. Wij direct de effecten van KCNE gendeletie in geïsoleerde cardiomyocyten van knockout muizen door cellulaire elektrofysiologie - een unieke techniek die we beschrijven in dit nummer van het Journal of Gevisualiseerd Experimenten. De harten van genetically ontworpen KCNE muizen snel uitgesneden en gemonteerd op een Langendorff-apparaat door aorta canule. Vrije Ca2 + in het myocardium is gebonden EGTA en dissociatie van cardiomyocyten wordt dan bereikt door retrograde perfusie van de kransslagaders met een speciale laag Ca 2 + buffer met collagenase. Atria, vrije rechter ventrikel wand en het linker ventrikel kan dan worden gescheiden door microchirurgische technieken. Calcium wordt vervolgens langzaam toegevoegd naar geïsoleerde cardiomyocyten in meerdere stappen omvattende wassen. Atriale en ventriculaire hartspiercellen gezonde uiterlijk zonder spontane contracties worden dan onmiddellijk onderworpen aan analyses door elektrofysiologische patch clamp techniek of andere biochemische analyses binnen de eerste 6 uur na isolatie.

Isolatie van volwassen muizen cardiomyocyten van genetisch gemanipuleerde muizen om de functie van bepaalde genen van belang in vitro studie is een krachtig instrument om inzicht cardiale pathofysiologie. Deze methode wordt momenteel gebruikt door slechts een klein, maar groeiend aantal fundamentele wetenschap laboratoria over de hele wereld. Echter, isolatie van volwassen ventriculaire hartspiercellen murine lastig en moet grondig en herhaaldelijk worden uitgevoerd door ervaren handen. Figuur 1</strong...

Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van levende atriale en ventriculaire cardiomyocyten uit genetisch gemodificeerde muizen voor gebruik bij whole-cell patch-clamp registraties en andere experimenten. Dit wordt bereikt door eerst het hart van een geanestheseerd dier voorzichtig, maar snel, uit te snijden. De tweede stap is om het uitgesneden en gecannuleerde hart aan te sluiten op het LOR-apparaat.Vervolgens wordt het hart uitgebreid retrograden geperfuseerd met collagenase-oplossing. Om het bindweefsel los te maken, is de laatste stap het dissociëren van het weefsel door het voorzichtig met fijne pincetten uit elkaar te trekken en de cellen te suspenderen met een vergrote, vuurgepolijste plastic pipetpunt. Daarna worden de cellen stapsgewijs geresuspendeerd in een calciumrijke oplossing. Tot slot wordt de whole-cell patch-clamptechniek gebruikt om verschillen in spanningsgestuurde kaliumkanaalstromen aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat u een aanzienlijke hoeveelheid HL- en ventriculaire cardiomyocyten verkrijgt met goede kenmerken voor verdere experimenten. Over het algemeen zullen wetenschappers die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er veel oefening nodig is om deze procedure nauwkeurig uit te voeren en echt goede resultaten te behalen. Ik controleer, na het injecteren van de anesthetica en 250 IU heparine, of de muis diep onder narcose is door in de staart te knijpen om de vluchtreflex te testen.Plaats de muis vervolgens in rugligging op de operatietafel. Maak daarna een incisie in de huid en de buikwand onder het xiphoid om een clamshell-thoracotomie uit te voeren.Verbreed de incisie aan beide zijden langs de costaboog. Snijd vervolgens de ribben door in de mediale axillaire lijn en klap de borstkas omhoog. Open daarna het pericardium en lokaliseer de grote vaten.Druk het hart van de kabeljauw voorzichtig aan om de aorta beter zichtbaar te maken. Klem vervolgens de aorta af met een pincet. Til het hart voorzichtig op, plaats daarna een schaar onder het hart en dissecteer alle verbindende vaten met één enkele knip.Zorg ervoor dat een groot genoeg deel van de aorta ascendens behouden blijft voor canulatie. Verplaats het uitgesneden hart vervolgens onmiddellijk naar een petrischaal gevuld met ijskoude pre-solution. Canuleer in deze procedure de aorta met een 1,8 French stalen canule en zorg ervoor dat luchtembolieën worden voorkomen.Fixeer vervolgens de aorta aan de canule met een chirurgische hechting. Spoel daarna de kransslagaders door met 1 mL van oplossing één. Verbind de canule met een Langendorff-apparaat om uitgebreide ischemie-reperfusieschade aan het myocard te voorkomen.Zorg ervoor dat de procedures vanaf de thoracotomie tot de canulatie van het linker atrium binnen 120 seconden worden uitgevoerd. Vul vervolgens de verwarmingsspiraal van het L-endorf-systeem vooraf met calciumvrije oplossing twee. Perfuseer het hart met 10 milliliters van deze oplossing met een snelheid van vier milliliters per minuut.Perfuse het hart vervolgens met de collagenase-oplossing. Drie gedurende acht minuten bij vier milliliter per minuut. Breng het hart nu over naar een voorverwarmde Petri-schaal van 100 millimeter die een calciumarme oplossing bevat. Vier.Verwijder voorzichtig de aorta en ander niet-cardiaal weefsel met een schaar. Scheid vervolgens de atria van de ventrikels en houd het atriale en ventriculaire weefsel ondergedompeld in een kleine hoeveelheid oplossing. Vier. Om de atriale cardiomyocyten te isoleren, worden de atria overgebracht naar een aparte, voorverwarmde kweekschaal van 100 millimeter.Dissocieer het weefsel door het voorzichtig met fijne pincetten uit elkaar te trekken en zorg ervoor dat het weefsel bijna volledig is gedissocieerd. Gebruik vervolgens een pipette van één milliliter met een vergrote, vuurgepolijste plastic pipetpunt om de cellen te suspenderen in één milliliter oplossing. Vier voor atriumcellen en vijf milliliter oplossing.Vier voor ventriculaire cellen gedurende vijf minuten. Scheid daarna de cellen van het debris met behulp van een cellfilter met een maaswijdte van 200 micron. Centrifugeer de cellen in oplossing vier gedurende één minuut voor atriale cellen en gedurende twee minuten voor ventriculaire cellen bij kamertemperatuur bij 16 ×g in een cellcultuurkap, verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in vijf milliliter oplossing.Vijf voor de atriale cellen en ongeveer 20 tot 25 milliliter. Voor de ventriculaire cellen schudt u de buis voorzichtig om het celpellet op te lossen en centrifugeert u opnieuw gedurende één minuut bij kamertemperatuur op 16 ×g. Gooi na de tweede centrifugatie het supernatant opnieuw weg en resuspendeer het pellet in vijf milliliter oplossing. Zes voor de atriale cellen en ongeveer 20 tot 25 milliliter voor de ventriculaire cellen.Laat de cellen vervolgens 10 minuten sedimenteren. Verwijder in een celkweekkast het supernatant en tel daarna de cellen. Voeg voor elektrofysiologische studies 25 tot 50 milliliters van oplossing zes toe aan de cellen voor elektrofysiologische studies.Houd de myocyten in oplossing zes in een buis van 50 milliliter en voorkom sedimentatie. Voor immunofluorescentiekleuring: bereid een kweekschaal voor met glazen dekglasplaatjes die zijn gecoat met laminaatoplossing in een eindconcentratie van 50 µg/mL.Incubeer de kweekschaal met laminine in PBS gedurende twee uur bij 37 °C. Verwijder vervolgens de laminine-oplossing. Plaats de myocyten onder een microscoop en controleer de celdichtheid tijdens het uitplaten van de cellen.Laat de myocyten gedurende één uur hechten aan het dekglas bij 37 °C in 2% CO2. Verwijder na een uur de oplossing en start onmiddellijk met het standaardprotocol voor de kleuringsprocedure. Incubeer vervolgens de myocyten met fixatiemiddel.Bijvoorbeeld 4% PFA in PBS bij pH 7,5 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Volg dit vervolgens met drie wasstappen met PBS van elk vijf minuten om de cellen te permeabiliseren en aspecifieke antilichaambinding te remmen. Incubeer de myocyten met 10% serum, 0,3% Triton en 0,2% BSA in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Incubeer ze daarna gedurende één uur bij 37 °C met het primaire antilichaam en was ze zoals eerder beschreven. Incubeer vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur met het secundaire antilichaam om de kernen en alpha actinin tegen te kleuren. Incubeer het secundaire antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur met DPI en fluorochroom-geconjugeerde phin.Na de wasstap worden de glasdekglasjes voorzichtig overgebracht naar de met zoutoplossing behandelde microscoopglaasjes. Bed de cellen vervolgens in het fluorescentiemontagemedium voor whole-cell patchclamp-metingen. Breng de gezond ogende cardiomyocyten over naar de perfusiekamer die is gevuld met een gedefinieerd volume extracellulaire badoplossing.Gebruik de juiste patchclamp-apparatuur en patchpipetten met een weerstand van drie tot vijf megaohm wanneer deze zijn gevuld met intracellulaire oplossing. Voor standaard patchclamp-metingen, nadat een cel is gepatched en een giga-seal is gevormd, wordt een standaardprotocol gebruikt om de kaliumstromen te meten door de uitwaartse kaliumstromen op te wekken met spanningsstappen van 4,5 seconden van -60 millivolt naar 50 millivolt in stappen van 10 millivolt. Zorg ervoor dat lekstromen altijd kleiner zijn dan 100 picoampère.Om verschillende kaliumstromen te differentiëren, kunnen specifieke inhibitoren worden gebruikt, zoals four-aminopyridine, heteropotassium-channel blocker, tetramine of tetraethylammonium. Stamoplossingen dienen te worden bereid in extracellulaire badoplossing en via een microtip direct in de directe nabijheid van de cel te worden aangebracht. Na de baseline-metingen.Er moet een equilibratieperiode van twee tot drie minuten worden gehanteerd voordat de registraties na toediening van het geneesmiddel worden gestart. Analyseer aan het einde de gegevens offline met P clamp 10.3-software of vergelijkbare software. Deze figuur toont een voorbeeld van een ventriculaire cardiomyocyt gekleurd met DPI en LOR 4 88 Phin. En hier zijn de voorbeeldsporen van de whole-cell patch-clamp-registratie.Deze figuur toont een voorbeeld van een atriumcardiomyocyt gekleurd met DPI en fluorochroom-geconjugeerd phin. En hier zijn de voorbeeldsporen van de whole-cell patchclamp-meting. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer anderhalf uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe atrium- en ventriculaire cardiomyocyten van genetisch gemodificeerde muizen worden geïsoleerd.

isolation-kv-channel-recordings-murine-atrial-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire...

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Dit protocol beschrijft modificaties van de Langendorff-methode, waaronder de diepte van aorta-cannulatie voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen.

Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen

Leer een protocol voor de isolatie van atriale en ventriculaire cardiomyocyten uit genetisch gemanipuleerde muizen voor elektrofysiologische studies. Deze methode maakt patch clamp-opnamen van Kv-kanalen mogelijk.

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Meer video's verkennen