Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van
4 maart 2013
We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS) van Drosophila Embryo's die de analyse van neuronale morfologie door een doorvallend licht of confocale microscopie mogelijk.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel van 17-daagse drosophila-embryo's in het vroege stadium te labelen. Dit wordt bereikt door eieren te verzamelen en ze zich te laten ontwikkelen tot de juiste fase. De tweede stap van de procedure is het handmatig chloorineren en uitlijnen van de eieren.
Na deze diva worden de embryo's gekoloniseerd en gefilet om de zenuwsnoer toegankelijk te maken. De laatste stap is het labelen van enkele cellen door middel van ionoretische toepassing van de lipofiele die die oog. Uiteindelijk bieden de resultaten de mogelijkheid om de morfologie van een enkel neuron te visualiseren indien gewenst in de context van bekende GFP-expressiepatronen en/of in een mutante achtergrond.
Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden voor het labelen van enkele cellen, zoals markum, is dat het in het embryo werkt en het mogelijk maakt om geïdentificeerde cellen opzettelijk te visualiseren. Visuele demonstratie van deze methode is uiterst nuttig omdat veel stappen delicaat zijn en daarom moeilijk te leren. Laat gezonde vliegen embryo's op agarplaten leggen.
Vervang de plaat elke anderhalf uur bij 25 graden Celsius en bewaar de embryo's. Incubeer de embryo's op hun platen bij 25 of 18 graden Celsius tot ze de vereiste ontwikkelingsfase bereiken. Wanneer ze klaar zijn, breng je de embryo's over naar een schuifje bedekt met dubbelzijdig plakband.
Vermijd het overbrengen van agar met de embryo's, omdat dit hun hechting aan het plakband zal verstoren. Laat de embryo's vijf tot 10 minuten drogen terwijl u wacht.
Bedek een dekglas van 24 millimeter bij 60 millimeter met heptaanlijm. Plaats een kleine druppel lijm in het midden van de schuif en spreid deze uit tot een zeer dunne film met behulp van een dekglas van 18 millimeter in het vierkant. Zodra de embryo's zijn opgedroogd, raak ze voorzichtig aan met een naald.
Het corion zal opensplitsen en het embryo zal aan de naald blijven plakken. Breng de gechlorineerde embryo's onmiddellijk over naar een agarblok om te voorkomen dat ze uitdrogen. Lijn ze daar 10 op een rij uit, met de ventrale kanten omhoog.
Snijd het overtollige agar van het blok weg met een scalpel. Raak vervolgens de embryo's voorzichtig aan met het met heptaanlijm beklede dekglas. Ze moeten met hun ventrale kanten naar beneden aan het dekglas hechten.
Breng een rand van plakband rond het dekglas aan en bevestig het aan een microscoopplaatje. Houd de embryo's bovenop het dekglas. Bedek de embryo's met royaal bedrag van PBS aan de dorsale zijde van elk embryo in de buurt van het achterste uiteinde.
Doorboor het vitelmembraan met een glazen naald, scheurt het membraan open langs de dorsale middenlijn en trekt het embryo uit het membraan. Orienteer het embryo vervolgens op een andere plaats op het heptaanlijm substraat met de ventrale zijde naar beneden. File het embryo met een glazen naald door de lichaamswand voorzichtig te doorboren en langs de dorsale middenlijn te scheuren.
Gebruik de naald om op de lichaamswand te drukken zodat het aan de schuif blijft plakken. Scheurt door het darmkanaal bij het voorste en achterste uiteinde en tilt het darmkanaal op. Aangezien er meerdere embryo's op dezelfde schuif worden gefilet, is het nuttig om of zeer nauwkeurig te zijn met hun oriëntatie of een tekening van hun oriëntatie te maken.
Vervolgens kunnen de embryo's lichtjes worden gefixeerd gedurende 10 tot 15 minuten in 7,4% formaldehyde in PBS, gevolgd door vier wasbeurten in PBS. Gebruik extreme voorzichtigheid om te voorkomen dat de embryo's raken aan het oppervlak van de oplossing. De oppervlaktespanningskrachten zullen ze onder een 10 x objectief vernietigen. Centreer het veld van zicht op een voorbereid embryo, verhoog de vergroting en lokaliseer de cel van belang onder DIC-optiek of onder fluorescentie.
Als de doelcel GFP tot expressie brengt, zorg er dan voor dat het velddiafragma van de microscoop net tot aan de rand van het veld van zicht wordt geopend, maar niet verder dan een smalle verlichting. Een straal zal helpen bij het positioneren van de micropipet. Ga terug naar het 10 x objectief en plaats de badelektrode voor de DC-versterker in de oplossing ver weg van het embryo en de weg van de micropipet. Monteer de injectiemicropipet gevuld met lithiumchlorideoplossing op de houder en bevestig deze aan de micro manipulator.
Gebruik de grove bediening om de micropipet onder het objectief en ver boven het embryo te positioneren. Als de hoek van de micro pipet te steil is, komt de punt niet scherp. Als het te ondiep is, raakt de schacht tegen de badwand. Centreer de punt in het veld van zicht.
Laat nu de micropipet zakken en focus afwisselend totdat de pipet in de PBS is en niet te ver boven het embryo. Verander nu naar een objectief met hoge vergroting en centreer de pipet binnen het veld van zicht. Wanneer de schacht scherp is, beweeg de micropipet in de X-as tot de punt in het midden van het veld van zicht ligt.
De punt van de micropipet moet ver boven het niveau van het embryo zijn. Schakel over naar fluorescentiebelichting en onderzoek de punt. Controleer op lekkage van kleurstof.
Stel de DC-stroom zo in dat er geen kleurstofkristallen op de punt worden opgebouwd. Laat nu de micro pipet in de Z-as naar het embryo zakken. Pas geleidelijk de focus aan terwijl het embryo scherp komt.
Schakel over naar het gebruik van de fijne regeling. Focus de cel die moet worden geïnjecteerd in het midden van het veld en focus vervolgens opnieuw op de punt van de micropipet. Vanaf dit punt is het misschien handiger om de trap van de microscoop te gebruiken om het embryo ten opzichte van de micropipet te verplaatsen.
Breng de punt van de micropipet in contact met de cel en maak een kuiltje op het oppervlak. Laat enkele nano ampère depolariserende stroom door voor een paar seconden. Er zal een klein kristal van kleurst
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een techniek voor het labelen van individuele neuronen in het centrale zenuwstelsel van Drosophila-embryo's. De methode maakt de analyse van de neuronale morfologie mogelijk met behulp van transmissielicht- of confocale microscopie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de neuronale morfologie is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Drosophila-embryo's dienen als modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel.
- Labelingstechnieken verbeteren de visualisatie van individuele neuronen.
- Confocale microscopie biedt gedetailleerde beeldvormingsmogelijkheden.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het labelen van individuele neuronen.
- Het vergemakkelijken van de analyse van de neuronale morfologie in Drosophila-embryo's.
- Het mogelijk maken van visualisatie in de context van bekende GFP-expressiepatronen.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van Drosophila-eieren en ontwikkeling tot stadium 17.
- Handmatige chlorering en uitlijning van embryo's.
- Kolonisatie en fileren om toegang te krijgen tot het zenuwsnoer.
- Toepassing van lipofiele kleurstof voor neuronale labeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van individuele neuronen in het CZS.
- Visualisatie van de neuronale morfologie gerealiseerd via microscopie.
- Resultaten kunnen worden gecontextualiseerd met GFP-expressiepatronen.
- Methode is toepasbaar in diverse genetische achtergronden.
Conclusies
- De techniek biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van de neuronale structuur.
- Verbetert het begrip van de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel in Drosophila.
- Potentiële toepassingen in genetisch en ontwikkelingsbiologisch neurowetenschappelijk onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Single-cell labeling in het Drosophila-CZK maakt morfologische analyse met een hoge resolutie van individuele neuronen mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en targetvalidatie in neuro-ontwikkelingsonderzoek. Deze capaciteit is cruciaal voor vroege discovery-teams die genetische perturbaties met voorspellende zekerheid willen koppelen aan cellulaire fenotypen. De genotype-agnostische flexibiliteit van de methode verhoogt de waarde voor mutante analyse op portfolio-niveau en cross-functionele R&D-integratie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van neuronale morfologie mogelijk met resolutie op enkelcelniveau voor functionele targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicovermindering door genetische achtergronden te correleren met cellulaire fenotypes.
- Faciliteert hypothesetoetsing in ziekterelevante modelsystemen.
- Maakt onderzoek naar mutante fenotypes mogelijk om de betrokkenheid van signaalpaden te verduidelijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde neuronale systemen voor voor downstream fenotypische screeningsworkflows.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve morfologische resultaten voor assay-standaardisatie.
- Ondersteunt colokalisatie met genetisch gecodeerde reporters voor gemultiplexte read-outs.
- Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen of genetische interventies op enkelcelniveau mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt morfologische data van enkelvoudige cellen uit aan de ontdekking van translationele biomarkers in neurodevelopmentale modellen.
- Biedt continuïteit van genetische manipulatie tot preklinische fenotype-beoordeling.
- Verlaagt het risico bij de verdere ontwikkeling van neuroactieve kandidaten door cellulaire mechanismen te verduidelijken.
- Ondersteunt vergelijkingen tussen verschillende soorten en genotypen voor translationele relevantie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze techniek voor single-cell labeling is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothese-toetsing tot preklinische modelvalidatie, in het bijzonder binnen de neurobiologie en de ontwikkelingsgenetica.
- Discovery Biology: Maakt nauwkeurige hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking mogelijk door de morfologie van individuele neuronen in gedefinieerde genetische contexten te visualiseren.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare single-cell outputs voor downstream fenotypische screens.
- Analytics: Genereert kwantitatieve morfologische gegevens en ondersteunt statistische vergelijkingen tussen genotypen of interventies.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische modellen door biomarker-afstemming op cellulair niveau mogelijk te maken.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor single-cell analyse over diverse genetische achtergronden en experimentele condities.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurodevelopmentele targets.
- Operationele waarde: Standardiseert single-cell labeling en imaging voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen en kapitaalefficiëntie door cellulaire mechanismen vroegtijdig in de pipeline te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van neuroactieve targets en mutante fenotypes voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in embryonale dissectie, micro-injectie en geavanceerde microscopie.
- Vereist precieze instrumentatie voor micromanipulatie en confocale of DIC-beeldvorming.
- Noodzaakt strikte standaardisatie tussen teams om de reproduceerbaarheid van enkelcel-outputs te garanderen.
- Aanpasbaar aan verschillende genotypen, maar kan protocoloptimalisatie vereisen voor verschillende modelsystemen.
- Delicate procedurele stappen en het risico op off-target labeling maken zorgvuldige training van de operator noodzakelijk.
