Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens Drosophila Embryogenese
August 18th, 2013
Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel klaring In vivo. Deze methode maakt gebruik van wonen Drosophila Embryo als een krachtig model voor de monitoring fagocytose van apoptotische cellen met behulp van specifieke kenmerken van apoptotische cellen en fagocyten.
Het algemene doel van deze procedure is om de dynamica van apoptotische celclearance in het drosophila-embryo te volgen. Dit wordt bereikt met transgene vliegen die een cytoplasmatische GFP-marker bevatten, die fagocytische celpopulaties markeren. Embryo's met de Simio GFP-marker worden verzameld, gewassen en gecoat. Vervolgens worden de embryo's gepositioneerd voor injectie, gevolgd door monitoring van het CZS.
De derde stap is het labelen van apoptotische cellen door de embryo's te injecteren met specifieke apoptose-fagocytosemarkers, zoals een X in vijf. De laatste stap is het maken van time-lapse opnamen van het embryonale CZS met behulp van confocale microscopie. Uiteindelijk kunnen de resultaten de lokalisatie en het gedrag van apoptotische cellen en fagocyten tijdens verschillende stadia van apoptotische celclearance laten zien door middel van fluorescentie confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals immunohistochemie op gefixeerde embryo's is dat we de dynamica van apoptotische celclearance kunnen volgen.
Apoptotische celclearance is een zeer dynamisch proces dat diverse stappen bevat. Deze techniek stelt ons in staat om de verschillende stappen te volgen met behulp van specifieke markers voor apoptotische cellen en fagocyten. Het protocol begint met het maken van een lijm van conventionele reagentia, vervolgens wordt het dubbelzijdige plakband uitgerold en weer opgerold om in een scintillatieglas te passen.
Vul het glas met heptaan en sluit het af met param. Bevestig vervolgens het glas aan een notenstamper en wieg het voorzichtig 24 uur lang heen en weer. Bij kamertemperatuur wordt de volgende dag de bereide lijm overgebracht naar een nieuw glas.
Gebruik een glazen PEs-pipet om de bereide lijm over te brengen naar een nieuw bestand. Eenmaal bereid, gebruikt u een pipettip om de lijm aan te brengen om coverslips te bedekken. Verspreid een druppel heptaanlijm in een lijn midden op de coverslip.
Laat de lijm een paar seconden intrekken. De coverslips kunnen vervolgens bij kamertemperatuur in een gesloten doos worden bewaard gedurende maximaal een maand na het verdoven van de vliegen met koolstofdioxide. Plaats ongeveer 400 vliegen in een verzamelcontainer met een verwarmde druivensapleggerplaat vervangen in 25 graden Celsius gedurende twee uur. Verzamel de druivensapleggerplaat en bedek de container met een nieuwe plaat om de vliegen gelukkig te houden.
De verzamelde plaat bevat embryo's van nul tot twee uur oud. Breng de verzamelde druivensapleggerplaat met de embryo's terug naar een incubator van 25 graden Celsius totdat ze het gewenste ontwikkelingstijdstip bereiken. In dit voorbeeld worden embryo's tussen 10 en 12 uur geïncubeerd, zodat ze zich tot stadium 15 of 16 ontwikkelen nadat ze zijn ontwikkeld.
Gebruik kraanwater en een schone verfkwast om de embryo's van de plaat over te brengen naar een cel.Zevener. Houd de zeef boven een container zodat eventuele embryo's die morsen, kunnen worden teruggewonnen. Spoel de verzamelde embryo's totdat alle gistpasta is verwijderd.
Droog vervolgens het overtollige water af door de buitenkant van de zeef af te vegen. Plaats de zeef in een schone petrischaal om het corion genoeg te verwijderen. 50%bleach om de embryo's in de zeef te bedekken en wacht twee minuten, terwijl je ze twee tot drie keer roert.
Spoel vervolgens de embryo's schoon totdat ze niet meer naar bleekmiddel ruiken. Plaats de embryo's in de celcontainer in een schone petrischaal en bedek ze met water om te voorkomen dat ze uitdrogen. Voor het injecteren van de embryo's.
Bereid injectienaalden van tevoren met behulp van een naaldtrekker en dunne glasfilamenten. Laad één microliter van het gewenste reagens in twee naalden, waarbij één naald als back-up dient. Een stabiele marker die niet gemakkelijk verbleken is, zoals een X in vijf, is een goed reagens.
Plaats nu een rechthoekig stuk druivensapagar op een microscoop. Schuif en breng de embryo's van de zeef over naar de agar. Gebruik een schone verfkwast onder een fluorescente dissectiemicroscoop om goed gestageerde embryo's voor injectie te selecteren met behulp van de GFP-marker.
Gebruik een natte verfkwast om de geselecteerde embryo's in een rij van 10 te plaatsen met hun ventrale kanten naar boven. Plaats de rij aan de rand van het agroblok. GFP kan worden gezien in het centrale zenuwstelsel van het embryo.
Bevestig nu de embryo's aan een coverslip met een strookje van de heptaanlijm. De juiste positie van de embryo's is erg belangrijk voor het succes van de injectie. Neem de tijd en zorg ervoor dat de embryo's precies in de juiste oriëntatie staan opgesteld.
Plaats vervolgens de coverslip in de dehydratatiekamer gedurende ongeveer vijf minuten. Bedek de embryo's na het drogen met Hello carbon olie 700 om verdere dehydratatie te voorkomen. Plaats tenslotte een druppel water op een microscoopglas.
Leg vervolgens de coverlip met de embryo's omhoog op de natte microscoopglas. De embryo's zijn nu klaar voor injectie. Begin met het bevestigen van een naald aan een microm manipulator en de picopomp.
De pomp regelt de hoeveelheid geïnjecteerde vloeistof door stikstof in de naald te duwen. Een voetpedaal regelt de gated uitwerping van de stikstof onder de microscoop. Focus op de naaldtip en positioneer deze zorgvuldig in de buurt van de rand van de coverslip met de naaldtip en de coverslip in focus.
Verplaats de coverslip totdat deze de naaldtip raakt en breekt. De openingdiameter moet een halve tot twee micrometer zijn. Focus nu op de embryo's.
Breng de naald in het olie. Als de naaldtip correct is gebroken, zou er een druppel vloeistof in het olie moeten lekken. Wanneer u het pedaal indrukt zonder de naaldhouder aan te raken, verplaatst u het podium zodat de laterale rand van het embryo wordt doorboord door de naald.
Injecteer snel een druppel oplossing in het embryo. Beweeg het embryo weg en ga verder met de volgende totdat alle 10 embryo's zijn geïnjecteerd. Beeld de embryo'
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van de dynamica van apoptotische celclearance in vivo met behulp van Drosophila-embryo's. De techniek maakt real-time monitoring mogelijk van fagocytose van apoptotische cellen door middel van specifieke labelering.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Apoptotische celclearance is cruciaal voor weefselhomeostase.
- Drosophila-embryo's dienen als een effectief model voor het bestuderen van dit proces.
- Traditionele methoden zoals immunohistochemie staan dynamische observatie niet toe.
- Live imaging-technieken kunnen inzicht geven in cellulaire interacties tijdens clearantie.
Doel van het onderzoek
- Om de dynamica van apoptotische celclearance in Drosophila-embryo's te volgen.
- Om het gedrag van fagocyten en apoptotische cellen te visualiseren.
- Om de begrip van de mechanismen die bij fagocytose betrokken zijn, te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Transgene Drosophila met cytoplasmatische GFP-markers worden gebruikt.
- Embryo's worden verzameld, gewassen en voorbereid voor injectie.
- Specifieke markers voor apoptotische cellen worden in de embryo's geïnjecteerd.
- Tijd-lapse opnamen van het embryonale CZS worden gemaakt met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Real-time beeldvorming toont de lokalisatie van apoptotische cellen.
- Het gedrag van fagocyten kan tijdens verschillende stadia van clearantie worden gemonitord.
- De methode vertoont voordelen boven vast weefselanalyse.
- Resultaten dragen bij aan een beter begrip van apoptotische processen.
Conclusies
- De beschreven methode maakt dynamische observatie van apoptotische celclearance mogelijk.
- Live imaging biedt inzichten die vaste methoden niet kunnen bieden.
- Deze aanpak kan onderzoek in celbiologie en ontwikkelingsprocessen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Live imaging of apoptotic cell clearance in Drosophila embryos provides a dynamic model for studying phagocytosis mechanisms relevant to target validation in immunology and oncology. The method enables mechanistic de-risking by visualizing real-time interactions between apoptotic cells and phagocytes, supporting predictive confidence in early discovery. This approach aids in identifying and prioritizing targets involved in cell death and clearance pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to phagocytic signaling and cell death pathways.
- Operational Value: Supports functional target validation by visualizing phagocyte engagement with apoptotic cells in a living system.
- Predictive Value: Enhances mechanistic de-risking through direct observation of clearance dynamics, informing target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative, imaging-based readout for apoptotic particle engulfment, enabling assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated biological systems (Drosophila embryos) for reproducible compound screening.
- Scalability: Supports platform reuse through time-lapse confocal imaging of phagocytic activity in CNS and peripheral tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical models of inflammation and neurodegeneration.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of phagocytic activity with potential translational biomarkers of clearance efficiency.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing defects in apoptotic cell clearance that may predict pathological outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for modulating phagocytic pathways in disease contexts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing glial and macrophage-mediated phagocytosis of apoptotic cells in real time.
- Screening: Enables assay readiness through standardized embryo preparation and injection protocols for compound exposure.
- Analytics: Generates quantitative confocal imaging data on apoptotic particle localization and phagocyte behavior over time.
- Translational Research: Links live imaging observations to preclinical continuity in models where clearance defects contribute to disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying conserved cell death and clearance mechanisms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in phagocytic mechanism interpretation.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through defined embryo staging, injection, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of ineffective modulators of cell clearance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation of phagocytic activity in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, embryo injection, and confocal microscopy.
- Dependent on transgenic fly lines expressing GFP in phagocytes and access to apoptotic cell labeling reagents.
- Necessitates standardization across teams for embryo staging, injection consistency, and image acquisition settings.
- Adaptation considerations include model-specific markers for phagocytes and apoptotic cells in other systems.
- Practical limitations include embryo viability post-injection and photobleaching during long-term time-lapse imaging.
