Name: Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens Drosophila Embryogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer de dynamiek van apoptotische celclearance in Drosophila-embryo's via live imaging met confocale microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van fagocytose mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Marie Curie Reïntegratie Grant (IRG249084). Wij danken alle leden van de Kurant laboratorium.

Fagocyterende cellen en apoptotische cellen: de dynamiek van apoptotische cel klaring in vivo twee populaties van cellen moeten worden geëtiketteerd volgen. Macrofagen, glia en ectoderm 8: naar fagocytaire celpopulaties we gebruik maken van een Drosophila regel met het simuleren cytGFP marker, die uitsluitend fagocytcellen labelt in het embryo te markeren. Men kan gebruik maken van verschillende markers voor fagocytcellen, waaronder regels met een hemocyte-specifieke Gal4 driver (CRQ-Gal4) of glia-specifieke Gal4 driver (repo-Gal4) en een genetisch gecodeerd fluorescerende reporter onder UAS controle (UAS-GFP). Aan apoptotische cellen controleren tijdens de apoptotische cel klaring gebruiken we verschillende apoptose / fagocytose markers. Annexine V (Molecular Probes) dient als een vroege merker voor apoptotische cellen 10, Phiphilux (OncoImmunin) is een fluorogene caspase-3-substraat dat wordt gebruikt als een latere apoptosesis marker, en Lysotracker (Molecular Probes) werkt als een phagosome marker. We injecteren deze reagentia met behulp van de micro-injectie systeem picopump PV 820. 1. Voorbereidingen <ol><li> Heptaan lijm: Rol dubbelzijdig plakband en zet zoveel als je kunt in een scintillatieflesje, vullen met heptaan, sluit de flacon met Parafilm, en rock voor 24 uur. Voeg heptaan als de lijm te dik. </li><li> We laten de vliegen te leggen op een voorverwarmde druivensap agar plaat + gist pasta voor 2 uur, en vervolgens over de plaat tot 25 ° C gedurende 10-12 uur (afhankelijk van de gewenste podium) voorafgaand aan micro-injectie en time lapse opnames geïnjecteerde embryo. Wij verzamelen embryos uit agarplaten gehandhaafd op 25 ° C, waardoor embryo van stap 15 of 16 ontwikkeling. </li><li> Naald het preparaat: Om naalden voor injectie te bereiden, gebruiken we een &#39;Sutter instrument&#39; naald trekker en dunwandige glasfilamenten (FHC capillaire buizen). De tip van de gepoolde capillaire kapotn tot een diameter van 0,5-2 urn. </li><li> Dekglaasje met lijm: Met behulp van een pipet tip verspreiden een daling van de heptaan lijm in een lijn in het midden van het dekglaasje. Laat het drogen voor een paar seconden. Bereid een paar van deze dekglaasjes. </li></ol> 2. Embryo Voorbereiding <ol><li> Verzamel embryo&#39;s uit agar platen en overbrengen naar een cel zeef (SPL Life Sciences) met een schone kwast en stromend water. De zeef wordt gehouden over een beker om afvalwater op te vangen. </li><li> Wassen embryo&#39;s in de cel zeef met water totdat alle gist pasta wordt verwijderd. </li><li> Uitdrogen van de overtollige water schoon door de buitenkant van de zeef met behulp Kimwipes. </li><li> Plaats de cel zeef in een schone petrischaal en voeg genoeg 50% bleekmiddel op embryo&#39;s in de cel zeef dekken. Dechorionate de embryo&#39;s gedurende 2 min. af en toe (2-3 keer) te roeren. </li><li> Spoelen met water uitgebreid tot embryo los het bleekmiddel geur. </li><li> Plaats de cel zeef in een schonePetrischaal en hebben betrekking op de embryo&#39;s met water opdrogen te voorkomen. </li><li> Voordat u begint met embryo instelling, laadt 1 ui van het gewenste reagens in twee naalden (soms een naald kan worden verstopt). Het duurt ongeveer 5 minuten om de vloeistof aan de punt van de naald bereiken. </li><li> Knip een rechthoekig stuk druivensap agar en plaats het op een objectglaasje. Overdragen dechorionated embryo&#39;s uit de petrischaal op de agar stuk met een schone kwast. </li><li> Onder een fluorescentie microscoop dissectie winkelwagentje goed georganiseerd embryo expressie de GFP merker met een natte kwast en plaats elk embryo dichtbij de rand van de agar stuk in een rij achter elkaar (figuur 1A). De embryo&#39;s voor imaging fagocytose worden geplaatst met hun buikzijde door glia in het centrale zenuwstelsel (CNS). </li><li> Opgericht ongeveer 10 embryo&#39;s in een rij. </li><li> Bevestig het embryo een dekglaasje bedekt in het midden met een strip van lijm heptaan (Figuur 1B, C </strong&gt;). </li><li> Plaats het dekglaasje in de dehydratatie kamer gedurende 5 min (afhankelijk van de vochtigheid van de kamer en de te injecteren hoeveelheid). </li><li> Na het opdrogen betrekking op de embryo&#39;s met halogene olie 700 (Sigma) om verdere uitdroging te voorkomen. </li><li> Plaats het dekglaasje op een objectglaasje met het embryo naar boven. U kunt een druppel water op de dia om het verplaatsen van het dekglaasje te voorkomen. Embryo&#39;s zijn nu klaar voor injectie. Injectieplaats is meestal aan de laterale zijde in het midden van het embryo. </li></ol> 3. Embryo Injectie <ol><li> Bevestig de naald op een micromanipulator. </li><li> Het doorbreken van de naald zet de rand van het dekglaasje in het gezichtsveld en de naald aan te passen aan dezelfde focal plane. Heel voorzichtig bewegen het dekglaasje totdat hij raakt de naald en breekt het. </li><li> Focussen op de embryo&#39;s, plaatst u de naald in de olie en zorg ervoor dat je een vloeistof druppel uit de naald. Het betekent dat de naald is geweestgoed gebroken. </li><li> Zonder het aanraken van de naaldhouder verplaatsen het embryo in de naald en injecteer een druppel in het embryo. Beweeg de embryo weg en ga verder naar de volgende totdat alle embryo&#39;s worden geïnjecteerd. </li></ol> 4. Imaging We afbeelding van de embryo&#39;s op een omgekeerde confocale microscoop met een 40X of 100X doelstelling. We zoeken naar een mooi gepositioneerd embryo met de CNS in het midden, die een sterke GFP expressie en een goede etikettering van apoptotische cellen na injectie geeft. Voor time lapse opnames van live embryo we meestal kiezen voor 5 of 6 confocale plakjes (2 micrometer dik elk). Daarna maken we een projectie van 3 sneetjes (6 micrometer dik) met het oog op volledige cellen te observeren. We gebruiken merkers voor apoptotische cellen die stabiel en niet bleken gemakkelijk. Om GFP bleken we te maken opnames in intervallen van 60 sec te voorkomen. In sommige gevallen embryo kan beginnen rollentijde van video-opname. Daarom nemen we een kijkje eens in de zoveel tijd bij de opname om te stoppen en opnieuw te beginnen, indien nodig.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Apoptotische cel klaring is een kritieke laatste fase van apoptose, die zeer dynamisch. Daarom real time studie van het proces van het grootste belang. Hier een protocol dat het toezicht van apoptotische cel klaring maakt in levende ontwikkelen Drosophila embryo&#39;s beschrijven we. In deze procedure moet twee populaties van cellen gekleurd met specifieke merkers: apoptotische cellen en fagocyten. Het simuleren cytGFP reporter is geschikt voor het bewaken fagocytische macrofagen, glia en ectoderm geli...

De goede verwijdering van ongewenste of afwijkende cellen door apoptose en daaropvolgende fagocytose is essentieel voor de embryonale ontwikkeling en voor weefsel homeostase in de volwassene. Fagocytose van apoptotische cellen of apoptotische cel klaring is een zeer dynamisch proces dat verloopt in vier stappen: (1) werving van fagocyten aan de apoptotische cel (&#39;vind-me&#39;), (2) de erkenning van de cel als doelwit voor fagocytose ( &#39;eet-me&#39;) en (3) engulfment, gevolgd door (4) phagosome rijping en afbraak van de apoptotische deeltje 1-5. Er zijn twee soorten fagocyten: &#39;professionele&#39; macrofagen en onvolgroeide dendritische cellen, en de &#39;niet-professionele&#39; tissue-resident naburige cellen, die cruciaal zijn voor apoptotische cel klaring tijdens metazoan ontwikkeling 6,7 zijn. In Drosophila ontwikkeling, de eliminatie van overbodige cellen door apoptose optreedt in drie main fasen, eerst in het midden tot eind embryo, dan in het midden van de pop, en opnieuw in de vroege volwassenheid. Tijdens de embryogenese apoptotische deeltjes worden verwijderd door &#39;professionele&#39; fagocyten, macrofagen, en door de &#39;niet-professionele&#39; ectoderm en glia 8,9. In ons voorgaande werk hebben we een fagocytische receptor, Six-micron-kader (SIMU), die uitsluitend wordt uitgedrukt in fagocytische cellen gedurende embryogenese geïdentificeerd. Met behulp van de simulatie promotor we gegenereerd een specifieke marker voor fagocyterende celpopulaties (simulatie-cytGFP), die ons in staat stelt gelijktijdig te volgen macrofagen, ectoderm en glia in een live ontwikkelende embryo 8. Bovendien, door specifieke merkers voor apoptotische cellen in verschillende stadia van apoptose, kunnen wij de dynamiek van gladde spiercellen in vivo klaring te volgen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>Annexin V </td><td>Molecular Probes</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Molecular Probes</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon olie 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiaal</td></tr><tr><td>Capillair slang</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Celzeef</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Schilderborstel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wonen imaging van apoptotische cel clearance tijdens<em&gt; drosophila</em&gt; embryogenese

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

De correcte verwijdering van ongewenste of afwijkende cellen door apoptose en daaropvolgende fagocytose (apoptotische cel klaring) is cruciaal voor de normale ontwikkeling in alle metazoan organismen. Apoptotische cel klaring is een zeer dynamisch proces nauw verbonden celdood; unengulfed apoptotische cellen worden nauwelijks waargenomen in vivo onder normale omstandigheden. Om de verschillende stappen van apoptotische cellen klaring begrijpen en &#39;professionele&#39; fagocyten vergelijken - macrofagen en dendritische cellen &quot;niet-professionele&quot; - tissue-resident naburige cellen, in vivo beeldvorming van levende het proces is zeer waardevol. Hier een protocol voor het bestuderen van apoptotische cel klaring in levende Drosophila embryo&#39;s beschrijven we. De dynamiek van verschillende stappen in fagocytose we specifieke merkers voor apoptotische cellen en fagocyten volgen. Daarnaast kunnen wij monitoren twee fagocytensysteem systemen parallel: &#39;professionele&#39; macrofagen en &#39;semi-professional &#39;glia in de ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CNS). De hier beschreven methode maakt gebruik van het Drosophila embryo als een uitstekend model voor real time studie van apoptotische cel klaring.

Representatieve beelden van een film waarin apoptotische cellen gelabeld met Annexine V en glia, ectoderm en macrofagen zijn voorzien van simu-cytGFP worden getoond in Figuur 2. Elk frame is een projectie van 3 segmenten 2 pm elk. Het embryo van de etappe 15 is goed gepositioneerd met de embryonale CNS in het midden met goed gelabeld glia (g). Macrofagen (m), die meestal buiten het CNS, vertonen een sterke cytoplasmatische GFP expressie. Ectodermale cellen worden oo...

Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel klaring<em&gt; In vivo</em&gt;. Deze methode maakt gebruik van wonen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo als een krachtig model voor de monitoring fagocytose van apoptotische cellen met behulp van specifieke kenmerken van apoptotische cellen en fagocyten.

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamiek van de klaring van apoptotische cellen in het embryo van de drosophila te volgen. Dit wordt bereikt met transgene vliegen die een cytoplasmatische GFP-marker bevatten, die fagocytische celpopulaties labelt. Embryo's met de Simio GFP-marker worden verzameld, gewassen en gecoat. Vervolgens worden de embryo's gepositioneerd voor injectie, gevolgd door monitoring van het CZS.De derde stap is het labelen van apoptotische cellen door de embryo's te injecteren met specifieke markers voor apoptose-fagocytose, zoals X in vijf; de laatste stap is het maken van time-lapse-opnamen van het embryonale CZS met behulp van confocale microscopie. Uiteindelijk kunnen de resultaten de lokalisatie en het gedrag van apoptotische cellen en fagocyten tijdens verschillende stadia van de klaring van apoptotische cellen aantonen via fluorescentie-confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunohistochemie op gefixeerde embryo's, is dat we de dynamiek van de klaring van apoptotische cellen kunnen volgen.De klaring van apoptotische cellen is een zeer dynamisch proces dat uit diverse stapp

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Drosophila Embryo's

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Leer de dynamiek van apoptotische celclearance in Drosophila-embryo's via live imaging met confocale microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van fagocytose mogelijk.

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens

Meer video's verkennen