Identificatie van Sleeping Beauty Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR
1 februari 2013
Werkwijze voor het identificeren van onbekende oorzaken van kanker met een objectieve benadering beschreven. De methode maakt gebruik van de Sleeping Beauty Transposon een willekeurige mutageen gericht op specifieke weefsels. Genomic in kaart brengen van transposon inserties die tumorvorming rijden identificeert nieuwe oncogenen en tumor suppressor genen
Deze procedure laat zien hoe nieuwe oncogenen en tumorsuppressorgenen kunnen worden geïdentificeerd door middel van het in kaart brengen van transpose op inserties in de muis die tumorvorming veroorzaken. Dit wordt bereikt door eerst tumoren te genereren en te verzamelen uit het transgene muismodel. De volgende stappen van de procedure zijn het isoleren van het tumor-DNA, het uitvoeren van linker-gemedieerde PCR, het sequencen van de versterkte DNA-monsters en het analyseren van de transpose op inserties.
Uiteindelijk identificeert de procedure kandidaat-tumordrivergenen. Het grote voordeel van het gebruik van linker-gemedieerde PCR in combinatie met een onbevooroordeelde genetische screening met behulp van slaapschoonheid transposons, is dat we gemakkelijk nieuwe genetische drivers van kanker kunnen identificeren. Begin altijd de dissectie door het uiterlijk van de geofferde muis te besproeien met 70% ethanol.
De verzamelde weefsels en tumoren moeten in vier secties worden verdeeld, met een grootte van 50 tot 100 milligram. Fixeer een sectie in 10% gebufferde formin gedurende 18 uur, gevolgd door 70% ethanol. Deze sectie kan worden gebruikt voor h en e kleuring en/of immunohistochemie.
Vries de resterende secties snel in in vloeibare stikstof. Deze kunnen in een vriezer worden bewaard en gebruikt voor DNA en eiwitisolatie om DNA te verzamelen uit een bevroren tumormonster. Hak eerst het weefsel fijn met een scheermes.
Verteer vervolgens het weefsel in een 1,5 milliliter buis met één milliliter cellysebuffer en vijf microliter van 20 milligram per milliliter. Protease K-oplossing. Vorm het mengsel goed door elkaar en ga verder met een standaard isopropanol-gebaseerde DNA-extractie. Begin dit protocol door de linkers te annelen in een 1,5 milliliter buis.
Meng 50 microliter van elke linkeroplossing met twee microliter geconcentreerd natriumchloride. Plaats vervolgens de buis in een 95 graden Celsius warmteblok. Na vijf minuten zet de verwarming uit en laat het langzaam afkoelen tot kamertemperatuur, wat een uur of langer kan duren na afkoeling.
De anale linkers kunnen in de vriezer worden bewaard totdat ze nodig zijn. Bereid 2 96-well platen voor door elk een microgram DNA van elk monster in de overeenkomstige putjes van beide 96-well platen te plaatsen. Plaats bijvoorbeeld een microgram DNA van monster een in put A één van beide 96-well platen.
Het DNA in een van de 96-well platen zal worden verteerd met behulp van het rechterbovenzijde-enzym NLA drie en het DNA in de andere 96-well plaat zal worden verteerd met behulp van het linkerbovenzijde-enzym BFA één. Laat het DNA een nacht lang bij 37 graden Celsius verteren. De volgende dag wordt de vertering afgerond door de enzymen gedurende 20 minuten bij warmte te inactiveren.
Reinig nu de verteringsreacties met behulp van een mini loot 96-well plaat. Gebruik de multi-kanaals pipet om elk monster over te brengen naar de mini loot. 96-well plaat.
Plaats de mini loot 96-well plaat in een vacuüm manifold. Breng een vacuüm aan op de plaat totdat de putjes er droog uitzien. Gewoonlijk 15 minuten gedurende dit protocol.
Er moet veel zorg worden besteed aan het niet verontreinigen van uw monsters. Wanneer u met 96-well platen werkt, houd de putjes zo veel mogelijk bedekt met doppen en vermijd het oversteken van uw pipet over open putjes, omdat elke druppel ongewenste vloeistof het monster kan bederven. Verwijder de mini loot plaat uit de vacuüm manifold en blokkeer de bodem van de plaat met keukenpapier totdat deze volledig droog is.
Resuspendeer het DNA in de mini loot. 96-well plaat door 30 microliter dubbel gedestilleerd water aan elk toe te voegen. Plaats de mini loot plaat op een orbitale shaker ingesteld op hoog gedurende twee minuten.
Breng vervolgens de inhoud van de mini loot plaat over naar een schone 96-well plaat. Om de linkerligatiereacties uit te voeren. Bereid de ligatiereactie voor door een voldoende hoeveelheid ligatiebuffer, een gekniede linkers uit stap 3.2 T vier DNA ligase en water in een reagent reservoir te mengen.
Gebruik een multi-kanaals pipet om 10 microliter van het verteerde DNA uit de vorige stap over te brengen naar een nieuwe 96-well plaat. Gebruik vervolgens een multi-kanaals pipet om 10 microliter van de ligatiereactie naar alle putjes van de 96-well plaat over te brengen. Nadat alle putjes zijn geladen met DNA en ligatiereagentia.
Incubeer de plaat gedurende vier uur tot een nacht bij 16 graden Celsius. De volgende ochtend. Beëindig de ligatie door de T vier Ligase gedurende 10 minuten bij 65 graden Celsius te inactiveren.
Zoals eerder, reinig de ligatiereactie met behulp van mini loot platen en een vacuüm manifold om de plaat te drogen en de bodem van de plaat te blotten totdat deze volledig droog is. Resuspendeer het DNA in 30 microliter dubbel gedestilleerd water. Plaats op een orbitale shaker gedurende twee minuten en breng vervolgens de inhoud van de mini loot plaat over naar een schone plaat.
Voer vervolgens een tweede DNA-vertering uit met bam H één om de resterende concat transposons te vernietigen. Verteer het DNA gedurende drie tot zes uur of een nacht bij 37 graden Celsius en reinig vervolgens de vertering met behulp van mini loot platen volgens dezelfde procedure als eerder. Voer een 30-cyclus PCR uit met behulp van een primer specifiek voor de transpose op en een primer specifiek voor de linker.
De reactie moet drie microliter van het verteerde DNA met linkers bevatten. Reinig vervolgens de PCR-reactie met behulp van mini loot. 96-well platen en een vacuüm manifold zoals eerder uitgevoerd.
Resuspendeer het DNA in 30 microliter water en breng de suspensies over naar een schone 96. Well plaat. Ga verder door twee microliter van de PCR-reactieproducten te verdunnen in 148 microliter dubbel gedestilleerd water met behulp van slechts twee microliter van de verdunde producten. Voer 30 cyclus PCR's uit met behulp van geneste versies van de primers in 100 microliter volumes.
Deze primers zijn voor de Illumina GA twee X machine. Elk monster zal een uniek 12 basen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van nieuwe oncogenen en tumorsuppressorgenen door middel van het in kaart brengen van transposon-inserties in een muismodel. De aanpak maakt gebruik van het Sleeping Beauty-transposon als willekeurige mutageen, waardoor de genetische drijvers van kanker kunnen worden ontdekt.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Carcinogenese
- Genomische mapping
- Transposonbiologie
Achtergrond
- Carcinogenese omvat complexe genetische veranderingen.
- Transposonen kunnen dienen als instrumenten voor mutagenese.
- Het identificeren van driver-genen is cruciaal voor het begrijpen van kanker.
- Linker-gemedieerde PCR verbetert de detectie van transposon-inserties.
Doel van de studie
- Om onbekende drijvers van tumorvorming te identificeren.
- Om een onbevooroordeelde genetische screeningsaanpak te gebruiken.
- Om transposon-inserties in tumor-DNA in kaart te brengen.
Gebruikte methoden
- Genereren van tumoren in een transgeen muismodell.
- Isolatie van tumor-DNA uit geoogste tumoren.
- Linker-gemedieerde PCR om DNA-monsters te amplificeren.
- Sequencing en analyse van transposon-inserties.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van kandidaat-drivergenen voor tumoren.
- Nieuwe oncogenen en tumorsuppressorgenen werden ontdekt.
- De methode bleek effectief bij het in kaart brengen van genetische alteraties.
Conclusies
- Het Sleeping Beauty-transposon is een waardevol instrument voor kankeronderzoek.
- Deze methode maakt een onbevooroordeelde identificatie van genetische drivers mogelijk.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om kankermechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het identificeren van genetische drijvers van kanker blijft een kritieke uitdaging in de vroege ontdekkingsfase vanwege de hoge achtergrondruis door passagiersmutaties. Het Sleeping Beauty-transposonsysteem in combinatie met linker-gemedieerde PCR maakt onbevooroordeelde forward genetische screens in muizen mogelijk om kandidaat-oncogenen en tumorsuppressorgenen nauwkeurig te bepalen. Deze aanpak ondersteunt doelwitvalidatie door mechanische ambiguïteit te verminderen en het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen te verbeteren.
Strategische Toepassingen in Biofarma R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via functionele mutagenese in vivo.
- Operationele waarde: Stuurt transpositie naar specifieke celtypen via Cre-lox-systemen voor weefselspecifieke targetvalidatie.
- Voorspellende waarde: Identificeert genen binnen veelvoorkomende insertieplaatsen als betrouwbare cancer drivers voor portfoliotriage.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert honderden verschillende amplicons per tumor die transposon-insertieplaatsen vertegenwoordigen voor downstream-analyse.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van gestandaardiseerde linker-gemedieerde PCR en nested PCR-stappen om consistente detectie over verschillende monsters te garanderen.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt gemultiplexte sequencing van honderden tumorcelmonsters in één enkele Illumina-lane via gebarcodeerde primers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Modelleert de genetische heterogeniteit die wordt waargenomen in menselijke tumoren door diverse insertieprofielen over meerdere tumoren vast te leggen.
- Translationele continuïteit: Verbindt mutagenese in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door genen te identificeren die vatbaar zijn voor therapeutische targeting.
- Mechanische risicoreductie: Onderscheidt driver-mutaties van passagiersmutaties via statistische analyse van gemeenschappelijke insertieplaatsen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van het genereren van hypothesen over targets tot de identificatie van lead-verbindingen, door genetisch gevalideerde targets te leveren uit in vivo screens.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen via onbevooroordeelde forward genetische screens die achtergrondruis door passagiersmutaties verminderen.
- Screening: Levert assay-klare DNA-monsters met kwantitatieve outputs die geschikt zijn voor insertieplaatsmapping en sequencing.
- Analytics: Maakt statistische identificatie van gemeenschappelijke insertieplaatsen mogelijk om kandidaat-kankergeneen prioriteit te geven.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vivo mutagenese met targetvalidatie door genen met een potentiële therapeutische relevantie te onthullen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor genetische screening over meerdere kankermodellen en weefseltypen.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targetvalidatie door transposon-inserties te koppelen aan tumorigenisch potentieel.
- Operationele waarde: Standaardiseert de detectie van transposon-inserties via geoptimaliseerde linker-gemedieerde PCR-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door in vivo functioneel bewijs te leveren voor de prioritering van targets.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door driver-genen te onderscheiden van de genomische achtergrond.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muisgenetica, transposonbiologie en moleculairbiologische technieken.
- Afhankelijk van toegang tot PCR-instrumentatie, gelelektroforese en sequeneringsplatformen.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor DNA-isolatie, linker-annealing en enzymatische digestie over de verschillende monstersets.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het toepassen van het systeem op verschillende Cre-driverlijnen of tumormodellen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van een voldoende tumortopbrengst en het zorgvuldig vermijden van kruiscontaminatie tijdens de meerstapsverwerking.
