De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitcomplexen te produceren door gebruik te maken van het multi back baula virus insectencelcellen systeem. Dit wordt bereikt door eerst het multi-gen construct te genereren, dat codeert voor het eiwitcomplex naar keuze. De tweede stap is om een samengesteld baula virus te maken dat het multi-gen construct bevat door bacteriecellen te transformeren en te screenen op de juiste back mids.

Vervolgens isoleren we het baula virale genoom en gebruiken dit om insectencellen op kleine schaal te infecteren in een zes-welplaat na testen op eiwitproductie. Het eiwitcomplex naar keuze wordt op grotere schaal geëxprimeerd en gezuiverd. Uiteindelijk wordt het gezuiverde eiwitcomplex gebruikt om zijn structuur en functie te ontdekken en mogelijk voor medicijnontdekking.

De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande echovirussystemen zijn tweeledig. De MultiPro complexen kunnen worden geproduceerd met ongekende. Ook is het geproduceerde materiaal van veel hogere kwaliteit omdat we het echovirus engineeren voor optimale eiwitproductie.

De implicaties van deze techniek gaan veel verder dan basisbiologische vragen. Ons multi bag platform is met succes gebruikt om eiwitten te produceren die veelbelovende nieuwe vaccinkandidaten zijn voor verschillende ziekten en om kankeronderzoek te katalyseren door het produceren van belangrijke eiwitassemblages die tumorgroei veroorzaken. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode een beetje worstelen met de processen en de behoefte aan steriliteit.

Daarom hebben we hard gewerkt om standaard werkprocedures vast te stellen om de toepassing van multi-bank zo eenvoudig mogelijk te maken voor niet-specialistische gebruikers. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de robotische stappen veel gemakkelijker te begrijpen zijn wanneer het proces in beweging wordt getoond. Dit kun je niet alleen extraheren door naar protocollen te kijken die zijn opgeschreven, hoe gedetailleerd ook.

Voordat je aan deze procedure begint, is het belangrijk om de co-expressiestrategie zorgvuldig te plannen. Het wordt aanbevolen om het experiment eerst te simuleren. In silico.

Genen moeten worden verdeeld over de acceptor- en donorplasmiden. Wat het beste werkt is om subeenheden samen te groeperen die fysiologische submodules kunnen vormen. Omdat grote complexen veel eiwitsubeenheden hebben, moeten veel genen gelijktijdig worden geëxprimeerd.

Het multi back systeem vereenvoudigt het klonen van genen aanzienlijk door geautomatiseerde routines te gebruiken om genen in kleine DNA-progenitors te plaatsen die een korte DNA-sequentie bevatten, genaamd locks P, die wordt herkend door het Cree recombinase-enzym. Deze progenitors worden vervolgens gecombineerd in een stapreactie door pre-recombinase toe te voegen, die alles wat een lox P-site heeft, concateneert tot één groot DNA-plasmide. Dit multi-gen construct wordt vervolgens in het multi back bula virusgenoom geïnsert.

Als er een groot aantal constructen moet worden gegenereerd, wordt het gebruik van robotscripts en een vloeistofmanipulatiewerkstation aanbevolen. Het werkstation is uitgerust met een vacuüm voor mini-preps en PCR-opruiming, een EEL voor automatisch laden van PCR-monsters. Een thermocycler voor PCR en incubatiestappen, een shaker voor het opnieuw suspenderen van cellen en koude blokken.

Voor enzymen worden genen van belang in geselecteerde donoren en acceptoren ingebracht met behulp van restrictie-enzymen en ligase of alternatief, door gebruik te maken van ligatie-onafhankelijke methoden. Valideer alle donor- en acceptorconstructen, gekloond door restrictiemapping en sequencing. Ga door met diffuse donor-acceptorcombinaties door CRE LAX P-recombinatie om de multi-gen expressieconstructen naar keuze te genereren. De samengestelde multi-genconstructen worden gevalideerd door analytische PCR-reacties met specifiek ontworpen sets primers.

Snapshots van het robotgestuurde TR-proces worden hier getoond. Ze omvatten de voorbereiding van PCR-reacties in multi-well platen, de beschikbaarstelling van template DNA en primers, PCR-amplificatie van DNA's en voorbereiding van multi-genconstructen die in bacteriecultuur zijn gekweekt door alkalische lysis in multi-well platen. Om deze procedure te beginnen, integreer multi-gen transfervectoren in het multi bula virale genoom door transformatie in DH 10-cellen, die het virale genoom en de functionaliteiten bevatten die nodig zijn voor TN zeven transpositie.

Na TN zeven transpositie worden cellen met samengesteld baula virus dat de genen van belang bevat geselecteerd door middel van blue white screening. Succesvolle TN zeven transpositie resulteert in een verlies van alfa-complementatie van de beta-galacto. Daarom blijven kolonies met correcte TN zeven transpositie wit op selectieve APL's die xal bevatten. Bereid bacterieculturen van de witte kolonies en isoleer de backin door alkalische lysis en ethanol isopropanol precipitatie.

Transfect vervolgens insectencellen met het gezuiverde bao virale genoom dat werkt in een steriele kap. Zaai aliquots van log fase SF 21 insectencellen in een zes-wel weefselcultuurplaat. Voeg aan elke put het gezuiverde bao virale genoom en een transfectiereagens toe dat is gemengd in kweekmedia. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 48 tot 60 uur bij 27 graden Celsius zonder beweging.

Na 48 tot 60 uur, oogst het initiële virus of V nul door het media te verwijderen, aan te vullen met vers media en de plaat twee tot drie dagen later terug te brengen in de incubator. Test vervolgens op eiwitproductie. En als er een YFP-markering aanwezig is, test op fluorescentie voor virusamplificatie. Gebruik V nul, het initiële virus, om 25 tot 50 milliliter cellen in log fase te infecteren in kleine erlenmeyer shaker kolven die worden geschud op een orbitaal platform.

Schud de cellen en verdeel de cellen elke 24 uur totdat ze stoppen met verdubbelen. Volg een lage multipliciteit van infectie of MOI-regime, cellen moeten ten minste een keer verdubbelen, anders herhaal het experiment met een kleiner volume van V nul dat is toegevoegd. De afbeelding aan de linkerkant toont niet-geïnfecteerde insectencellen na infectie met het multi back baula virus.

Geïnfecteerde insectencellen zijn gestopt met prolifereren en zijn in grootte toegenomen zoals geïllustreerd door de afbeelding aan de rechterkant. Na 48 tot 60 uur, oog