Name: Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer de mechanische eigenschappen van het endotheliale glycocalyx meten met atoomkrachtmicroscopie. Deze methode bepaalt de modulus en dikte van deze zachte laag in levende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, en Eric Lam bedanken voor hun hulp bij dit project. Dit project werd gefinancierd door NIH # PO1 HL 018208.

1. Methoden 1,1 Cell Flow Kamer Een stromingskamer, getoond in figuur 1, is geconstrueerd dat cellen kunnen worden gekweekt onder een afschuifsnelheid van 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) en vervolgens direct overgebracht naar een Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> De stromingskamer werd voorbereid voor de proef door eerst reinigen van de glaasjes in Piranha-oplossing (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) gedurende 15 min en vervolgens wassen met gedestilleerd water. Zij werden vervolgens gebakken tot droog en bedekt met aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in een vacuüm afzettingskamer. </li><li> Een siliconen pakking werd gesneden met behulp van een Silhouette SD snijgereedschap. Dit liet ons toe om de stroom fijn kamerafmetingen voor het regelen van het debiet en shear stress tijdens celgroei. Typisch werd een kanaal uitgesneden 6,4 mm breed en 19 mm lang uit een plaat van 0,4 mm silicone. Het debiet nodig is om generate een afschuifspanning van 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) wordt berekend uitgaande van laminaire stroming in een rechthoekig kanaal met de vergelijking: </li></ol><img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> waarbij Q het debiet τ de schuifspanning μ is de viscositeit van het medium, hier aangenomen om 1,0 mPa (0,01 dyn * sec / cm 2), h de hoogte en de breedte w van de stromingskamer . <ol start="3"><li> Het bovenste deel van de stromingskamer is uitgelijnd met de pakking in de celkweekschaal en met een magnetische ring. De assemblage werd gevuld met isopropyl alcohol (IPA) voor sterilisatie. </li><li> Het volledige-stroomsysteem werd geassembleerd. De stroompoorten in de celkweekschaal aangesloten op driewegkleppen. De kleppen werden verbonden met 30 ml spuit te openens. IPA werd doorgespoeld, dat vervolgens werd met 30 ml medium McCoy&#39;s gewassen met 4% foetaal kalfsserum (FCS). Het systeem werd gevuld met 20 ml van de Vec Technologies celgroei medium. Deksels werden op de toppen van de injectiespuiten. De vangst reservoir spuit dop had een naald op zijn plaats om terug te gaan medium om de feed reservoir. Steriele 0,2 pm filters werden aan de luchtinlaten in de omslagen om verontreiniging van het systeem. De stroom kamer was dan klaar voor cel zaaien. </li></ol> 1,2 Cultuur van de Cel <ol><li> Humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC&#39;s) en groeimedium werden gekocht bij Vec Technologies (Rensselaer, NY) en tot confluentie gekweekt in een T25 fles. </li><li> Het groeimedium werd uit de kolf verwijderd en de monolaag van cellen model met 2 ml van 2,5% trypsine. Zodra de cellen in oplossing werd het trypsinisatie geblust door toevoeging van 10 ml celkweekmedium aan de kolf. </li><li> The celsuspensie werd gedurende 5 min en het supernatant werd verwijderd. De cellen werden geresuspendeerd in 1 ml celkweekmedium (met serum) voor injectie in de stromingskamer. </li><li> De celsuspensie (0,5 ml, ~ 50.000 cellen) werd geladen in een spuit en geïnjecteerd in de stromingskamer via een driewegklep. </li><li> De cellen werden bezinken en het glazen substraat hechten gedurende 2 uur vóór stroming werd gestart. De cellen werden gekweekt onder stroming in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 tot 5 dagen tot confluent. </li></ol> 1,3 Cantilever Voorbereiding en Cell Inspringen <ol><li> Puntloze AFM cantilevers (nanowereld, Zwitserland) werden gereinigd salpeterzuur gedurende 5 min en gefunctionaliseerd met aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in een kamer voor dampafzetting. </li><li> Een oplossing van 5 mg / ml gew NHS-sulfo-LC-biotine in gebufferde zoutoplossing Hank&#39;s (HBSS) bereid. De cantilevers werden ondergedompeld in de oplossing gedurende 15 min te conjugate het silaan met N-hydroxysuccinimide (NHS) chemie. </li><li> Een oplossing van biotine-vrij medium werd door het incuberen van 20 ml Vec Technologies celkweekmedium (waaronder serum) met 200 ul streptavadin kralen gedurende 12 uur. De bolletjes werden uit het medium met een magneet en het medium werd gefiltreerd door een 0,22 urn steriel filter. </li><li> De stromingskamer werd uit de celkweekschaal en de cellen werden gewassen in 37 ° C biotine-vrij medium. </li><li> Een voorraadoplossing van 1 pl van 2,4 urn parels gecoat met streptavidine in 1 ml van biotine vrij medium werd bereid, en 100 pl van de stock toegevoegd aan de celkweekschaal. </li><li> Streptavidine kralen werden opgepikt met de cantilever door de aanvoer van de tip over het glasoppervlak naast een kraal, terugtrekken, het positioneren van de top van de cantilever over de kraal, en vervolgens op de cantilever naar beneden op de kraal en rust gedurende enkele seconden. </li><li> De gevoeligheid van de cantilever was maatregeld door inspringen op een gebied van kale glas en met de helling van de curve de punt afbuiging als functie van spanning ingesteld. </li><li> De veerconstante van de cantilever werd berekend uit een thermische calibratie in de MFP3D software. </li><li> De gekalibreerde cantilever werd vervolgens gebruikt om streepje de monsters, zoals getoond in figuur 2. Deze 2,4 urn korrels hebben een groter contactoppervlak met het celoppervlak zodat de mechanische eigenschappen van de zacht glycocalyx laag kan worden gedetecteerd. De cantilever is geplaatst boven een cel nabij de celkern en zachte aanpak van de punt op de cel werd gebruikt om de cantilever hoogte ongeveer 3 urn boven het celoppervlak vastgesteld. De software werd gedurende 20 herhaalde indrukkingen met een snelheid van 1 um / sec tot maximaal kracht van 7 nN. Ongeveer 6 seconden verstreken tussen opeenvolgende contacten. Het is mogelijk om verschillende percentages van inspringing om te testen voor tijdsafhankelijke eigenschappen van de glycocalyx, hoewel deze eerste<html> experimenten slechts een inkeping percentage (1 um / sec) gebruikt. </li></ol> 2. Inspringen Theorie Inkeping in een elastisch half-ruimte met een bol met straal R kan worden beschreven met Hertz theorie waar de kracht van inspringing, F wordt gegeven door de vergelijking: <img alt="Vergelijking 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> Waarbij δ is de inkeping diepte en E * is de verminderde modulus van het materiaal onder test (figuur 3). Bij een oneindig stijve indenter botst een uniforme elastische halfruimte wordt E * gegeven door de vergelijking: 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; waarbij E de elasticiteitsmodulus en ν de Poisson verhouding van het materiaal. Recent werk met polymeerfilms geïnspireerd de ontwikkeling van een tweelaagse model voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne films 1. Wij passen dit model celbiologie door behandeling van de glycocalyx een uniforme dunne zachte film op het oppervlak van het cellichaam. Met dit model verminderde de modulus van het systeem wordt: <img alt="Vergelijking 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> Wanneer GC E de modulus van de glycocalyx, E cel de modulus van het cellichaam, P, Q en n constanten zijn die empirisch zijn bepaald uit het polymeer past en z wordt gegeven door de vergelijking: <p class="jove_content" fo:keep-Together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Vergelijking 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> Waarbij t de dikte van de glycocalyx laag. Een schema van deze parameters is weergegeven in figuur 3. Het model is aangetoond dat een nauwkeurige manier om de modulus en de dikte van een dunne film op stijver substraat 1 zijn. Deze vergelijking kan worden gebruikt om de curves verkregen indrukking in cellen passen bij de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx bepalen, zoals getoond in figuur 4.

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We gebruikten waarden berekend uit de tweelagige model en Hertz theorie de interactie van leukocyten in het bloed aan de endotheel wand model. We hebben berekend dat een microvillus de leukocyten met een diameter van 50 nm minder dan 10 pN belasting zou ongeveer 150 nm streepje, in de glycocalyx, slechts een fractie van de totale dikte. Dit betekent dat de glycocalyx, met eigenschappen zoals gemeten in dit experiment, is een belangrijke belemmering voor cel-cel interactie en kan een grote sterische hindering die de cell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> McCoy&#39;s Medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalfsserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endotheelcelgroei Medium </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Gepoolde Human Umbilical Vein Endothelial Cells </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Zwavelzuur </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Waterstofperoxide </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triethoxysilaan </td><td> Aldrich </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalcohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Gebufferde zoutoplossing Hank&#39;s oplossing </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin kralen </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asiel Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless uitkragingen </td><td> Nanowereld </td><td> PIJL-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouet-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber </td><td> Stockwell elastomeren </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml spuiten </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge naalden </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Extensiesets </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4-weg kleppen </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Man / Vrouw Port Petten </td><td> Smith&#39;s Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltische Pomp </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltische Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> steriele filters </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de endotheliale kalende haarvaten met atomic force microscopy

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Ons begrip van de interactie van leukocyten en de vaatwand tijdens leukocyt capture wordt beperkt door een onvolledig begrip van de mechanische eigenschappen van het endotheeloppervlak laag. Het is bekend dat adhesiemoleculen op leukocyten zijn niet gelijkmatig ten opzichte oppervlaktopografie 3 verdeeld, dat topografie beperkt lijmverbinding formatie met andere oppervlakken 9, en fysiologische contactkrachten (≈ 5,0 tot 10,0 per microvillus pN) kan de microvilli comprimeren als slechts een derde van hun lengte rusten, de toegankelijkheid van moleculen aan het tegenoverliggende oppervlak 3, 7. We beschouwen het endotheel als een twee-lagen structuur, de betrekkelijk stijve cellichaam, plus de glycocalyx, een zachte beschermende suiker coating op het luminale oppervlak 6. Het is aangetoond dat de glycocalyx kan fungeren als een barrière om de hechting van leukocyten verminderen aan het endotheliale oppervlak 4.In dit rapport hebben we beginnen met de vervormbaarheid van endotheliale oppervlakken aan te pakken om te begrijpen hoe de endotheliale mechanische stijfheid kunnen bindingsvorming beïnvloeden. Endotheliale cellen gekweekt in statische cultuur spreken zich niet uit robuust glycocalyx, maar cellen gekweekt onder fysiologische stromingscondities beginnen een benadering van de glycocalyx waargenomen in vivo 2. De modulus van de endotheelcellen lichaam is gemeten met behulp van atomic force microscopie (AFM) om ongeveer 5 tot 20 kPa 5. De dikte en structuur van de glycocalyx werden bestudeerd met elektronenmicroscopie 8 en de modulus van de glycocalyx is benaderd door indirecte methoden, maar voor zover wij weten, zijn er geen gepubliceerde verslagen van een directe meting van de glycocalyx modulus in levende cellen . In deze studie presenteren we inkeping proeven met een nieuwe AFM probe op cellen die zijn gekweekt in omstandigheden hun glycocalyx expressie maximaliseren make directe metingen van de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx.

In een typisch experiment werden 20 kracht-vs-afstand curves verkregen uit een bepaald gebied van de cel, meestal in de perinucleaire regio dichtbij, maar niet op de kern (binnen ~ 2 pm). De krommen werden aangepast om eventuele drift monster gedurende de duur van de meting en vervolgens gemiddeld om cantilever ruis, zoals getoond in figuur 4. De curven werden geanalyseerd en passen de twee lagen model dat is ontwikkeld voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne polymeerfilms 1. Ui...

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de mechanische eigenschappen van de endotheliale glycocalyx te meten met behulp van een atoomkrachtmicroscoop of een FM. Dit wordt bereikt door eerst een monolaag van endotheelcellen te kweken onder een fysiologische stroming in een bioreactor om als tweede stap de glycocalyxlaag op te bouwen. Micrometergrote kralen worden aan de FM-cantilevers bevestigd en gebruikt als sonde om de weerstandskracht van het cellichaam en de glycocalyx tijdens indrukking te meten. Vervolgens worden de indrukkingscurves aangepast met een tweedelige model om de glycocalyx modulus en dikte te bepalen. De resultaten tonen aan dat de endotheliale glycocalyx een modulus heeft van 0,7 kilo pascal en een dikte van 380 nanometer op basis van de tweedelige analyse.Hallo, ik ben Rick Wa. Ik ben voorzitter van biomedische techniek aan de Universiteit van Rochester. Er is de afgelopen jaren veel discussie geweest over de mogelijke rol van de endotheliale glycocalyx bij ontsteking, met name of het zou kunnen fungeren als een beschermende barrière om ongewenste celadhesie tijdens ontsteking te voorkomen. Een van de sleutels tot het oplossen van de vragen die deze kwestie omringen, is de mogelijkheid om de fysische eigenschappen te meten, namelijk de dikte en de stijfheid van deze laag, zowel onder normale omstandigheden als tijdens de ontstekingsreactie.Ik ben Graham Marsh. Ik ben afgestudeerde student aan de Universiteit van Rochester Department of Biomedical Engineering. Het grote probleem bij het karakteriseren van de endotheliale glycocalyx is dat het ongelooflijk zacht is.De aanpak die we bedacht hebben, is om een grote kraal aan de punt van een A FM-cantilever te bevestigen, zodat de gemeten krachten op te lossen zijn met de A FM. Om deze procedure te starten, bouwt u een stromingskamer zoals hier getoond, die in staat is om cellen te laten groeien onder een schuifspanning van 1,0 Pascal. Bereid de stromingskamer voor op het experiment door de glasplaten eerst 15 minuten in piranha-oplossing te reinigen. Spoel ze drie keer met gedestilleerd water af en droog ze 30 minuten bij 70 graden Celsius.Vervolgens coat u de platen met amino propyl trixi, cy lane of apte door middel van dampafzetting. Voeg een milliliter apte toe aan een kolf die is bevestigd aan de vacuümkamer met het monster. Dek de kolf af en trek een vacuüm van 0,7 bar gedurende één uur.Gedurende deze tijd ververst u het vacuüm drie keer. Snijd vervolgens een nieuwe stromingskamer pakking uit een 0,4 millimeter dikke siliconcsheet met behulp van een silhouet SD-snijgereedschap. De kanaalbreedte meet 6,4 millimeter bij 19 millimeter lengte, en de buitendiameter is gesneden tot 35 millimeter zodat deze in de asielkweekschaal past.Met behulp van deze afmetingen berekent u de stromingssnelheid die nodig is om een schuifspanning van één pascal te genereren met de vergelijking die hier wordt getoond. Q vertegenwoordigt de stromingssnelheid. Tau is de schuifspanning.Mu is de viscositeit van het medium. H is de kanaalhoogte en W is de breedte van de stromingskamer. De volgende stap is om het bovenste deel van de stromingskamer uit te lijnen met de pakking in de celkweekschaal en deze te bevestigen met een magnetische ring.Verbind de stromingspoorten in de celkweekschaal met drie golfkleppen met leidingen naar de 30 milliliter spuiten. Steriliseer vervolgens de hele assemblage door vijf minuten met isopropylalcohol te spoelen. Verwijder vervolgens de alcohol en laat deze aan de lucht drogen in het weefsel.Kweekkap Voorverwarm 4% foetaal runder serum in McCoy's medium tot 37 graden Celsius. Nadat het vijf tot 10 minuten is gedroogd, spoelt u alle resterende alcohol weg met 30 milliliter van het voorverwarmde foetale runder serum. Vul vervolgens de spuiten met 20 milliliter veek MCDB 1 31 groeimedium.Bedek vervolgens de spuiten om besmetting te voorkomen. Wanneer u het systeem uit de steriele kap verplaatst, past u de dop voor de opvangreservoir aan met de naald die in het vloeistof bereikt om medium naar het stroomopwaartse reservoir te trekken. Bevestig tenslotte 0,2 micron steriele filters aan de luchtinlaten op de doppen volgende oogst menselijke navelstrengslagader.Endotheelcellen groeiden tot confluency in een T 25-kolf. Re-suspendeer de pelletvormige cellen bij 100.000 cellen per milliliter in medium en trek de oplossing op in een spuit. Injecteer vervolgens de suspensie in de stromingskamer door de driewegklep.Laat de cellen twee uur bezinken en hechten aan het glazen substraat. Voordat u met de stroming begint, verplaatst u de bioreactor en cellen naar een incubator waar de cellen twee uur bezinken en hechten. De slang die de reservoirs verbindt met een peristaltische pomp, loopt door de achterkant van de incubator. Zodra de cellen zich hebben gehecht, stelt u de peristaltische pomp in op de gewenste stromingssnelheid.Media beweegt tussen de reservoirs en creëert een drukhoogte en een stroming door de bioreactor die een wandschuifspanning van één pascal produceert. Laat de cellen incuberen met continue stroming bij 37 graden Celsius gedurende één tot vijf dagen totdat de kamer conflueert. Om met de cantilevervoorbereiding te beginnen, reinigt u een tip plus een FM-cantilever in salpeterzuur gedurende vijf minuten, gevolgd door een spoeling met gedistilleerd water.Eenmaal droog, functioneert u de cantilever met apdi in een dampafzettingskamer zoals eerder getoond voor de glasplaten. Bereid vervolgens een oplossing van vijf milligram per milliliter per gewicht NHS Sulf O lc, biotin in Hank's gebufferde zout oplossing. Dompel de cantilevers gedurende 15 minuten in de oplossing.Deze reactie koppelt de CY en eindhydroxyoxide en presenteert biotinemoleculen op het oppervlak van de cantilevers. Op de dag ervoor begint u met het bereiden van een oplossing van biotinevrij medium door 20 milliliter vexcel-kweekmedium met 20% serum te combineren met 200 microliter strept ENC-gecoate kralen en incubeer gedurende 12 uur met draaien. Op de dag van he

quantifying-mechanical-properties-endothelial-glycocalyx-with-atomic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De stijfheid van de extracellulaire matrix van grote invloed op meerdere gedragingen van hechtende cellen. Matrix stijfheid varieert ruimtelijk overal een weefsel, en ondergaat wijzigingen in de verschillende aandoeningen. Hier hebben we methoden ontwikkelen om de ruimtelijke variatie in stijfheid in normale en fibrotische muis longweefsel met behulp van atomic force microscopie microindentation karakteriseren.

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

We presenteren gedetailleerde protocollen voor het isoleren van aorta's uit muizen en het meten van hun elastische modulus met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

We presenteren een protocol voor het functionaliseren van atomaire kracht Microscoop (AFM) cantihefbomen met een enkele T-cel en kraal deeltje voor immunologische studies. Procedures voor het sonde-eenpaar T-cel-dendritische celbinding door de AFM en om de real-time cellulaire respons van macrofagen op één vast deeltje door de AFM te monitoren met fluorescentie beeldvorming worden getoond.

Functionalisatie van atomaire kracht Microscoop Cantihefbomen met single-T cellen of één deeltje voor immunologische eencellige kracht spectroscopie

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

Het protocol presenteert een complete workflow voor nano-indentatie-experimenten met zacht materiaal, inclusief hydrogels en cellen. Ten eerste zijn de experimentele stappen om krachtspectroscopiegegevens te verkrijgen gedetailleerd; vervolgens wordt de analyse van dergelijke gegevens gedetailleerd beschreven via een nieuw ontwikkelde open-source Python-software, die gratis te downloaden is van GitHub.

Experimentele en data-analyse workflow voor soft matter nano-indentatie

Het kwantificeren van het contactoppervlak en de kracht die door een atoomkrachtmicroscoop (AFM) sondepunt op een monsteroppervlak wordt uitgeoefend, maakt mechanische eigenschapsbepaling op nanoschaal mogelijk. Best practices voor het implementeren van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie in lucht of vloeistof op zachte en harde monsters om elastische modulus of andere nanomechanische eigenschappen te meten, worden besproken.

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanische eigenschapsmetingen op nanoschaal in lucht en vloeistof

We hebben onlangs retinale capillaire verstijving geïdentificeerd als een nieuw paradigma voor retinale disfunctie geassocieerd met diabetes. Dit protocol werkt de stappen uit voor de isolatie van de retinale capillairen van muizen en de subendotheelmatrix uit retinale endotheelculturen, gevolgd door een beschrijving van de stijfheidsmeettechniek met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Isolatie van de retinale capillairen en subendotheliale matrix van muizen voor stijfheidsmeting met behulp van atoomkrachtmicroscopie

Dit protocol visualiseert hoe cryosecties van muizenlongweefsel moeten worden voorbereid, experimenten met atoomkrachtmicroscopiekaarten kunnen worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geanalyseerd om Young's modulus van het inheemse muizenlongbasaalmembraan te bepalen.

Extractie van de Young's Modulus van inheemse muizen pulmonale basaalmembranen uit door atoomkrachtmicroscopie afgeleide krachtkaarten

Leer de mechanische eigenschappen van het endotheliale glycocalyx meten met atoomkrachtmicroscopie. Deze methode bepaalt de modulus en dikte van deze zachte laag in levende cellen.

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Meer video's verkennen