Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy
21 februari 2013
De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de mechanische eigenschappen van de endotheliale glycocalyx te meten met behulp van een atoomkrachtmicroscoop of een FM. Dit wordt bereikt door eerst een monolaag van endotheelcellen te kweken onder een fysiologische stroming in een bioreactor om als tweede stap de glycocalyxlaag op te bouwen. Micrometergrote kralen worden aan de FM-cantilevers bevestigd en gebruikt als sonde om de weerstandskracht van het cellichaam en de glycocalyx tijdens indrukking te meten. Vervolgens worden de indrukkingscurves aangepast met een tweedelige model om de glycocalyx modulus en dikte te bepalen. De resultaten tonen aan dat de endotheliale glycocalyx een modulus heeft van 0,7 kilo pascal en een dikte van 380 nanometer op basis van de tweedelige analyse.
Hallo, ik ben Rick Wa. Ik ben voorzitter van biomedische techniek aan de Universiteit van Rochester. Er is de afgelopen jaren veel discussie geweest over de mogelijke rol van de endotheliale glycocalyx bij ontsteking, met name of het zou kunnen fungeren als een beschermende barrière om ongewenste celadhesie tijdens ontsteking te voorkomen. Een van de sleutels tot het oplossen van de vragen die deze kwestie omringen, is de mogelijkheid om de fysische eigenschappen te meten, namelijk de dikte en de stijfheid van deze laag, zowel onder normale omstandigheden als tijdens de ontstekingsreactie.
Ik ben Graham Marsh. Ik ben afgestudeerde student aan de Universiteit van Rochester Department of Biomedical Engineering. Het grote probleem bij het karakteriseren van de endotheliale glycocalyx is dat het ongelooflijk zacht is.
De aanpak die we bedacht hebben, is om een grote kraal aan de punt van een A FM-cantilever te bevestigen, zodat de gemeten krachten op te lossen zijn met de A FM. Om deze procedure te starten, bouwt u een stromingskamer zoals hier getoond, die in staat is om cellen te laten groeien onder een schuifspanning van 1,0 Pascal. Bereid de stromingskamer voor op het experiment door de glasplaten eerst 15 minuten in piranha-oplossing te reinigen. Spoel ze drie keer met gedestilleerd water af en droog ze 30 minuten bij 70 graden Celsius.
Vervolgens coat u de platen met amino propyl trixi, cy lane of apte door middel van dampafzetting. Voeg een milliliter apte toe aan een kolf die is bevestigd aan de vacuümkamer met het monster. Dek de kolf af en trek een vacuüm van 0,7 bar gedurende één uur.
Gedurende deze tijd ververst u het vacuüm drie keer. Snijd vervolgens een nieuwe stromingskamer pakking uit een 0,4 millimeter dikke siliconcsheet met behulp van een silhouet SD-snijgereedschap. De kanaalbreedte meet 6,4 millimeter bij 19 millimeter lengte, en de buitendiameter is gesneden tot 35 millimeter zodat deze in de asielkweekschaal past.
Met behulp van deze afmetingen berekent u de stromingssnelheid die nodig is om een schuifspanning van één pascal te genereren met de vergelijking die hier wordt getoond. Q vertegenwoordigt de stromingssnelheid. Tau is de schuifspanning.
Mu is de viscositeit van het medium. H is de kanaalhoogte en W is de breedte van de stromingskamer. De volgende stap is om het bovenste deel van de stromingskamer uit te lijnen met de pakking in de celkweekschaal en deze te bevestigen met een magnetische ring.
Verbind de stromingspoorten in de celkweekschaal met drie golfkleppen met leidingen naar de 30 milliliter spuiten. Steriliseer vervolgens de hele assemblage door vijf minuten met isopropylalcohol te spoelen. Verwijder vervolgens de alcohol en laat deze aan de lucht drogen in het weefsel.
Kweekkap Voorverwarm 4% foetaal runder serum in McCoy's medium tot 37 graden Celsius. Nadat het vijf tot 10 minuten is gedroogd, spoelt u alle resterende alcohol weg met 30 milliliter van het voorverwarmde foetale runder serum. Vul vervolgens de spuiten met 20 milliliter veek MCDB 1 31 groeimedium.
Bedek vervolgens de spuiten om besmetting te voorkomen. Wanneer u het systeem uit de steriele kap verplaatst, past u de dop voor de opvangreservoir aan met de naald die in het vloeistof bereikt om medium naar het stroomopwaartse reservoir te trekken. Bevestig tenslotte 0,2 micron steriele filters aan de luchtinlaten op de doppen volgende oogst menselijke navelstrengslagader.
Endotheelcellen groeiden tot confluency in een T 25-kolf. Re-suspendeer de pelletvormige cellen bij 100.000 cellen per milliliter in medium en trek de oplossing op in een spuit. Injecteer vervolgens de suspensie in de stromingskamer door de driewegklep.
Laat de cellen twee uur bezinken en hechten aan het glazen substraat. Voordat u met de stroming begint, verplaatst u de bioreactor en cellen naar een incubator waar de cellen twee uur bezinken en hechten. De slang die de reservoirs verbindt met een peristaltische pomp, loopt door de achterkant van de incubator. Zodra de cellen zich hebben gehecht, stelt u de peristaltische pomp in op de gewenste stromingssnelheid.
Media beweegt tussen de reservoirs en creëert een drukhoogte en een stroming door de bioreactor die een wandschuifspanning van één pascal produceert. Laat de cellen incuberen met continue stroming bij 37 graden Celsius gedurende één tot vijf dagen totdat de kamer conflueert. Om met de cantilevervoorbereiding te beginnen, reinigt u een tip plus een FM-cantilever in salpeterzuur gedurende vijf minuten, gevolgd door een spoeling met gedistilleerd water.
Eenmaal droog, functioneert u de cantilever met apdi in een dampafzettingskamer zoals eerder getoond voor de glasplaten. Bereid vervolgens een oplossing van vijf milligram per milliliter per gewicht NHS Sulf O lc, biotin in Hank's gebufferde zout oplossing. Dompel de cantilevers gedurende 15 minuten in de oplossing.
Deze reactie koppelt de CY en eindhydroxyoxide en presenteert biotinemoleculen op het oppervlak van de cantilevers. Op de dag ervoor begint u met het bereiden van een oplossing van biotinevrij medium door 20 milliliter vexcel-kweekmedium met 20% serum te combineren met 200 microliter strept ENC-gecoate kralen en incubeer gedurende 12 uur met draaien. Op de dag van he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de mechanische eigenschappen van de endotheliale glycocalyx met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Endotheelcellen werden gekweekt onder fysiologische stromingsomstandigheden om de glycocalyxvorming te bevorderen, en microngrootte korrels werden gebruikt om de mechanische eigenschappen te meten door middel van indrukking.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biomechaniek
Achtergrond
- De endotheliale glycocalyx is een beschermende laag op endotheelcellen.
- Het speelt een rol bij ontsteking en celadhesie.
- Inzicht in zijn mechanische eigenschappen is cruciaal voor kennis over vasculaire gezondheid.
- Eerdere studies hebben de belangrijkheid ervan in verschillende fysiologische omstandigheden benadrukt.
Doel van het onderzoek
- Om de dikte en stijfheid van de endotheliale glycocalyx te meten.
- Om zijn rol in ontsteking en celadhesie te begrijpen.
- Om gegevens te verstrekken die toekomstig onderzoek naar vasculaire biologie kunnen informeren.
Gebruikte methoden
- Het kweken van endotheelcellen in een bioreactor onder fysiologische stroming.
- Het gebruik van atoomkrachtmicroscopie voor indrukkingsmetingen.
- Het gebruik van microngrootte korrels bevestigd aan AFM cantilevers als sondes.
- Het analyseren van indrukkingscurves met een tweedelig model om mechanische eigenschappen af te leiden.
Belangrijkste resultaten
- De endotheliale glycocalyx werd gevonden met een modulus van 0,7 kilopascals.
- De dikte van de glycocalyx werd gemeten op 380 nanometer.
- Resultaten wijzen op significante mechanische eigenschappen die celgedrag kunnen beïnvloeden.
- Gegevens ondersteunt de hypothese van glycocalyx als een beschermende barrière tijdens ontsteking.
Conclusies
- De studie heeft succesvol de mechanische eigenschappen van de endotheliale glycocalyx gekwantificeerd.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van zijn rol in vasculaire gezondheid en ziekte.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze resultaten om therapeutische implicaties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct quantification of the endothelial glycocalyx’s mechanical properties addresses a critical gap in understanding leukocyte-endothelial interactions relevant to inflammation and vascular biology. This capability enhances predictive confidence in target validation for adhesion-modulating therapeutics and informs risk-adjusted decisions in early discovery and preclinical model development. The method’s quantitative outputs support mechanistic de-risking and translational continuity across vascular and immunological research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of the glycocalyx’s role as a barrier in leukocyte adhesion.
- Provides quantitative mechanical data to clarify adhesion pathway hypotheses.
- Supports functional target validation for anti-inflammatory or vascular-modulating agents.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing cell body and glycocalyx contributions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, physiologically relevant endothelial models for compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative modulus and thickness measurements for assay standardization.
- Enables screening of candidate molecules or coatings for effects on glycocalyx integrity.
- Supports platform reuse for comparative studies across conditions or interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical measurements with in vivo vascular barrier function.
- Enables assessment of disease-relevant changes in glycocalyx properties during inflammation.
- Supports biomarker development for vascular health and immune response modulation.
- Facilitates risk-adjusted advancement of candidates targeting endothelial interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This AFM-based quantification method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development for vascular and immunological programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on glycocalyx-mediated adhesion and barrier function.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for compound or biomaterial evaluation.
- Analytics: Generates force-indentation curves and two-layer model outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo vascular and inflammatory models when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for ongoing mechanistic and screening studies across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in adhesion pathway validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable mechanical measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes candidates with validated mechanistic impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted triage and advancement of vascular and immunological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and biophysical data analysis.
- Demands specialized instrumentation and flow-based endothelial culture systems.
- Necessitates cross-team standardization of cell culture and measurement protocols.
- Adaptation may be needed for different endothelial sources or disease models.
- Practical limitations include sensitivity to culture conditions and technical reproducibility.
