Name: Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Leer het gebruik van chemostaten voor microbiële systems biology met continue celkweek en wiskundige modellering. Deze methode biedt precieze controle over groeisnelheid en stabiele omstandigheden voor onderzoek naar celbiologie en evolutionaire adaptatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het opstarten van fondsen van de New York University. Wij danken Maitreya Dunham en Matt Brauer, die het gebruik van Sixfors bioreactoren als chemostaten eerste instantie ontwikkeld.

Het principe van continue kweken met een chemostaat kan worden gerealiseerd in verschillende implementaties. In alle chemostaten is het essentieel om 1) werkwijzen voor het handhaven van steriliteit alle onderdelen, 2) een goed gemengde cultuur 3) geschikte beluchting van het kweekvat en 4) een betrouwbare media toevoeging en verwijdering cultuur. Hier beschrijven we het gebruik van een Sixfors bioreactor (Infors Inc) als chemostaat gebruik van werkwijzen die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan alternatieve opstellingen. 1. Montage van de chemostaat Schepen <ol><li> Schakel de Sixfors met de hoofdschakelaar. </li><li> Spoel de chemostaat vaartuig, roerder assemblage, en aan te brengen slangen met gedeïoniseerd (DI) water. Controleer alle slangen en o-ringen en vervang versleten zoek stukken. </li><li> Zorg ervoor dat de aandrijfas draagvlak is naar boven gericht in de glazen vat en dat de bovenkant van de aandrijfas wordt vastgeklikt op zijn plaats op de roerder montage. Stel de stirrer constructie in het glazen vat zodat de onderkant van de aandrijfas is geplaatst in de aandrijfas steun. Gebruik de klem om de roerder is bevestigd aan de glazen vat. </li><li> Vul het vat met ongeveer 300 ml DI water. </li><li> Verwijder de doppen van een opgeloste zuurstof (DO 2) probe en controleer het elektrolyt niveau door het losdraaien van de onderste behuizing en zorg ervoor dat de onderste behuizing is half gevuld met elektrolyt oplossing. Rescrew de onderste behuizing en invoegen in de haven op de chemostaat schip. Schroef tot handvast. </li><li> Neem een ​​pH-sonde en verwijder deze uit de opslag buffer (3 M KCl). Verwijder de pH-sonde dop en hechten aan fermentor 1. Met behulp van de Sixfors controle scherm, navigeer naar de fermentatie-parameter menu en selecteer &quot;kalibreren pH&quot;. Plaats de pH-sonde in een standaard pH 7 buffer en opnemen lezen als High lezen. Herhaal dit met pH 4 buffer en opnemen lezen als Low lezen. Maak de pH-sonde van fermentatie, wassen met DI-water en plaats de sonde into de poort op de chemostaat schip. Schroef tot handvast. </li><li> Plaats de chemostaat vaartuig in het rek. Let op het schip dat fermentor (1-6) de pH probe aangesloten en gekalibreerd. Plaats de pH-probe dop op de pH-probe. Met behulp van folie strak bedek de bovenkant van de Do 2 sonde. </li><li> Vouw folie over de uiteinden van de slang aan de chemostaat vat. </li><li> Herhaal de stappen 1,2-1,8 voor alle vaartuigen. </li><li> De schepen Steriliseren in autoclaaf ze gedurende 15 min op een vloeibaar cyclus. </li></ol> 2. Voorbereiden van de Media <ol><li> Bepaal de beperkende reeks concentraties een voedingsstof door te groeien batch culturen in verschillende concentraties nutriënten. De voedingsstof beperkend het bereik waar de uiteindelijke celdichtheid is een lineaire functie van de aanvankelijke concentratie nutriënt (figuur 4). Selecteer een nutriëntenconcentratie ruim binnen de beperkende bereik. Voorbeelden van standaard media samenstelling voor studies met Saccharomyces cerevisiae zijn in 7-11. </li><li> Autoclaaf lege mandfles, afgesloten met een rubber stop met een luchtinlaat en mediakanaal na eerst te garanderen dat het uiteinde van de media buis is bedekt met folie. </li><li> In een afzonderlijk vat bereiden 10 L media. </li><li> Bevestig een 500 ml filter beker in een 100 ml fles media. Verwijder de katoenen filter met een tang gesteriliseerd in ethanol en direct hechten aan de filtratie poort van de media mandfles. </li><li> Bevestig de media mandfles een vacuüm bron en filter steriliseren media toe te voegen aan het filter beker. </li><li> Wanneer filtratie van media is voltooid, sluit de filtratie-poort met een metalen klem. </li></ol> 3. Kalibreren dO 2 Probes en opzetten chemostaat <ol><li> Na de chemostaat schepen zijn geautoclaveerd en mogen in de bijbehorende warmte jas afkoelen plaats van het schip. Sluit de temperatuursensor, pH-sonde, en doe 2 sonde. Laat devaartuig zitten met de stroom gedurende minstens 6 uur om de dO 2 sondes polariseren. </li><li> Het uiteinde van elk effluent buis in een afzonderlijke verzamel-houderdeel. Sluit de luchttoevoer via een autoclaaf filter en zet luchtstroom. Het water van elk schip moet stromen van het effluent buizen, die aangeeft dat alle afdichtingen correct worden gevormd. </li><li> De hoogte van het effluent buis volgens de gewenste werkvolume (bijv. 300 ml). We maken gebruik van een liniaal die is gemarkeerd met buis plaatsingen gekalibreerd om verschillende werken volumes. </li><li> Sluit de media mandfles om de chemostaat vat. Gebruik ethanol om buis te houden eindigt zo steriel mogelijk. Rijg de pomp slang door de pomp en open klem. Handmatig op de pomp totdat de media begint te stromen in de chemostaat vat. Laat slang van de pomp, dient de pers vrijelijk in chemostaat vat stromen. Als de media het effluent buis bereikt, sluit slang aan de pomp en klem. </li><li> Start running het basisprogramma met waaier ingesteld op 400 rpm en het ingesteld op 30 ° C temperatuur </li><li> Om te kalibreren dO 2 sondes, schakelt luchttoevoer en overschakelen naar stikstofgas. Wacht minstens een uur en opnemen meetwaarde als &quot;laag gelezen&quot;. Ga terug naar de luchttoevoer (dwz met ambient zuurstofconcentratie), wacht minstens een extra uur en opnemen meting als &quot;hoge lees&quot;. </li><li> Initiëren gegevensregistratie met behulp van Iris software. </li></ol> 4. Enting <ol><li> Gebruik 70% ethanol tot de bovenkant van het kweekvat steriliseren. </li><li> Verwijder de schroef op de bovenzijde van het vat en pipet 1 ml van een overnachting cultuur in de chemostaat vat. Draai de schroef weer. </li><li> Geven het moment van inenting in Iris. </li><li> Wacht ongeveer 24 uur voor culturen om vroeg stationaire fase te bereiken. Als de kweek groeit, zal opgeloste zuurstof en pH te verlagen. In het geval van glucose beperkend media, zal opgeloste zuurstof weer ~ 100% stationaire phase. Voor andere beperkingen voedingsstoffen zal opgeloste zuurstof in de stationaire fase blijven &lt;100%. </li></ol> 5. Initiëren Pompen en bereiken van Steady State <ol><li> De verdunning wordt berekend door de stroomsnelheid te delen (hoeveelheid medium stroomt in het vat per uur) door het volume kweek. Bijvoorbeeld, met een volume van 300 ml een verdunning van 0,1 betekent dat 30 ml medium wordt toegevoegd aan de kweek per uur. Omdat het systeem onder positieve druk hetzelfde volume wordt verwijderd uit het vat zodat de cultuur voortdurend verdund. Een reeks verdunning (D) kan worden gebruikt die niet de maximale groeisnelheid (μ max) van de cellen, waarboven cellen uit de chemostaat wordt gewassen. </li><li> Kies pompinstellingen, waarbij het aantal seconden dat de pomp aan en uit te geven, om de gewenste stroomsnelheid te stellen. De pomp levert media met een snelheid van ~ 0,11 ml / sec. </li><li> Definieer een programma met de Sixfors interface dat de pomp timing, temperatuur en impellor snelheid aangeeft. Start het programma. </li><li> Leeg het verzamelen van houders van vloeibare en noteer de tijd. </li><li> Na ten minste twee uur, gebruik dan een cilinder te meten hoeveel media is verwijderd uit het schip. Hierdoor wordt het volume dat is toegevoegd aan de chemostaat vat gelijk. Bereken de verdunning (D = V effluent / V cultuur / tijd). Pas pomp instellingen indien berekend verdunning niet overeenkomt met de gewenste verdunning. </li><li> Bij steady-state, heeft celdichtheid in de chemostaat niet veranderen in de tijd. Dit kan worden gemeten zonder verstoren de cultuur door bemonstering van de uitstroom. We operationeel bereiken van een steady state te definiëren als gelijke maten celdichtheid die worden gescheiden door ten minste een bevolking verdubbeling. Het bereiken van steady-state wordt ongeveer acht cultuur generaties na aanvang van de cultuur verdunning. Bij steady-state, cellen groeien exponentieel (i.e. constante groei in de tijd) in-nutriënten beperkte voorwaarden. De verdubbelingstijd van de bevolking (generatie tijd) is ln (2) / D. </li><li> Blijf periodiek effluent volumes gemeten gedurende de duur van het experiment te verzekeren dat een constante verdunning wordt gehandhaafd. </li></ol> 6. Toepassing 1: Studeren groeiende cellen met verschillende snelheden in steady-state condities <ol><li> Bij steady-state in de chemostaat, de groei van de populatie van cellen is gelijk aan de verdunning. Door systematisch veranderen van de verdunning is het mogelijk om cellen groeien met verschillende snelheden. Dit maakt de systematische studie van fysiologische parameters die variëren met de groei inclusief celvolume, celcyclus podium en stressbestendigheid. Bovendien kan steady-state profielen globale mRNA, eiwit en metabolietniveaus worden getest in cellen die groeien met verschillende snelheden. Er zijn twee manieren om monsters te verwerven: </li><li> Kleine monsters kunnen passief ob zijngehandhaafd door het plaatsen van het uiteinde van het effluent buis in een 1,5 ml of 15 ml buisje. Een monster van 1-5 ml kan worden verkregen in een paar minuten (afhankelijk van de stroomsnelheid). Vele fysiologische parameters worden gemeten uit deze monsters. </li><li> Genexpressie of metaboliet analyses vereisen grotere monsters die zo snel mogelijk moet worden verkregen. Het uiteinde van het effluent buis in een 15 ml conische buis. Maak de schroef van het metalen uiteinde van het effluent buis en duw naar beneden. A ~ 10 ml monster zal snel vul je tube. Houd in gedachten dat het volume in de chemostaat schip is veranderd. Als er veel opeenvolgende monsters genomen kan het nodig zijn om stroming tot een constante verdunning te handhaven. </li></ol> 7. Toepassing 2: Nauwkeurige meting van groeiverschillen tussen genotypen in Controlled Environments Met behulp van flowcytometrie-gebaseerde competitietesten <ol><li> Chemostaten kan worden gebruikt om het effect van nutriëntenconcentratie kwantificerenover de verschillen in groei (dwz fitness) tussen verschillende genetische achtergronden. Door co-kweken van stammen gelabeld met verschillende fluorescente proteïnen de mate van verandering in relatieve abundantie in exponentiële groei wordt bepaald. Het uitvoeren van deze test met verschillende verdunning (D) kan de studie van effecten van nutriënten concentratie (s) op fitness verschillen. </li><li> Vast steady state culturen van de twee stammen in afzonderlijke vaten chemostaat met identieke verdunning en een volume van 300 ml. </li><li> Passief proeven 1 ml van elk vaartuig. Spin down cellen, resuspendeer in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bij 4 ° C. Deze monsters bevatten homogene cel monsters, die controles voor de daaropvolgende flowcytometrie-analyse zijn. </li><li> Plaats het effluent buis van het ene vat in een autoclaaf maatcilinder. Maak de schroef van het metalen uiteinde van het effluent buis en duw omlaag om cellen te verdrijven uit de chemostaat. Wanneerhet volume op 150 ml, terug het metalen uiteinde van het effluent buis naar zijn oorspronkelijke positie (300 ml). Herhaal dit met de tweede schip, met behulp van een andere maatcilinder. </li><li> Gebruik 70% ethanol om de steriliteit te handhaven tijdens het verwijderen schroef bovenop de chemostaat vaartuig. Plaats de trechter in de opening en giet 150 ml van de andere cultuur in de chemostaat vat. Draai de schroef weer. Herhaal dit met de tweede schip, met behulp van de tweede trechter. Elke chemostaat vat bevat nu een mengsel van de twee stammen. </li><li> Het verkrijgen van een 1 ml monster uit elk vat met passieve bemonstering elke 2-6 uur. Spin down cellen, resuspendeer in PBS en bewaar bij 4 ° C. Doorgaan met het nemen van monsters voor 2-3 dagen zorgvuldig opnemen van de tijd elk monster werd genomen. </li><li> Na afloop van het experiment, ultrasone trillingen en verdun monsters ~ 2 x 10 6 cellen / ml. Met flowcytometrie, meet het percentage van de twee stammen in elk monster. Aangezien beide stammen exponentieel groeien, het relatieve groeipercentage verschil isbepaald door lineaire regressie van ln (strain1/strain2) tegen de tijd (gemeten in generaties). De helling van de regressielijn is de proportionele verschil in groeisnelheid (de fitness voordeel) van een stam ten opzichte van de andere. </li><li> Zoals de mengcultuur wat tijd om een ​​nieuwe steady-state bereiken kunnen nemen, kunnen vroege tijdstippen slecht passen bij de regressie. Dit kan het best worden opgelost doordat de 2-3 generaties te verstrijken alvorens met de monsterneming of het verwijderen van vroege punten die duidelijke uitschieters zijn. Omgekeerd, wanneer een stam de andere heeft weggeconcurreerd de gegevens niet langer bruikbaar zijn en deze punten moeten worden uitgesloten. </li></ol> 8. Toepassing 3: Experimentele Evolution <ol><li> Experimentele evolutie uitgevoerd in chemostaten selecteert voor mutanten die zijn toegenomen in fitness in de nutriënt beperkte omgeving. Selectie gebeurt meestal over honderden generaties. </li><li> Opzetten van een steady-state chemostaat cultuur met behulp van een stamvan bekende genotype (en bij voorkeur bekend genoomsequentie) en een bepaald nutriënt-beperking. </li><li> Om een ​​&quot;fossiele vondsten&quot; van de aanpassing bevolking behouden passief bemonsteren chemostaat om de 2-3 dagen en bewaar het monster in 15% glycerol bij -80 ° C. </li><li> Controleer de media reservoir en vullen met vers medium nodig. </li><li> Handhaving van de exponentieel groeiende cultuur voor een paar honderd generaties. </li><li> Na voltooiing van de selectieplaat een monster van cellen op vaste agarplaten. Nadat de cellen zijn gegroeid tot kolonies, kies een zuivere monster van kolonies met tandenstokers en beënt klonen in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat met 100 ul medium. Laat klonale monsters &#39;s nachts groeien, voeg 100 ul van 30% glycerol en bewaar op -80 ° C. </li><li> Karakteriseren klonen van whole genome sequencing en het uitvoeren van fenotypische tests waaronder de beoordeling van geschiktheid, met behulp van een gemeenschappelijke fluorescent gelabelde referentie-stam, zoals beschreven in Application 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

<ol><li>Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cell+Growth%3A+Control+of+Cell+Size%22">Cell Growth: Control of Cell Size</a>. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+technique+de+culture+continue%2C+theorie+et+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Inst.+Pasteur%22%5BJournal%5D)">La technique de culture continue, theorie et applications.</a> Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science. 112, 715-716 (1950).</li>
<li>Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transition+between+different+physiological+states+during+balanced+growth+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium.</a> J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).</li>
<li>Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Homeostasis+in+Batch+and+Steady-State%5BTitle%5D)+AND+%22Culture+of+Yeast.+Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State.</a> Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).</li>
<li>Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon%2C+nitrogen%2C+phosphorus%2C+or+sulfur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li>
<li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+diverse+nitrogen-limited+environments+by+deletion+or+extrachromosomal+element+formation+of+the+GAP1+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).</li>
<li>Regenberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biol. 7, R107(2006).</li>
<li>Castrillo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+the+eukaryote+cell%3A+a+systems+biology+study+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> J. Biol. 6, 4(2007).</li>
<li>Cipollina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+role+of+yeast+Sfp1+in+ribosome+biogenesis+and+cell+size+control%3A+a+chemostat+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study.</a> Microbiology. 154, 337-346 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+analysis+of+genes+and+functions+affecting+survival+during+nutrient+starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10, e1001325(2012).</li>
<li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+and+dynamics+of+evolutionary+adaptations+to+controlled+nutrient-limited+environments+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303(2008).</li>
<li>Wenger, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+Artists%3A+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genet. 7, e1002202(2011).</li>
<li>Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+genome+rearrangements+in+experimental+evolution+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).</li>
<li>Ronen, M., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+steady-state+yeast+cultures+to+transient+perturbations+in+carbon+source%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).</li>
<li>Kresnowati, M. T. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+transcriptome+meets+metabolome%3A+fast+cellular+responses+of+yeast+to+sudden+relief+of+glucose+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Sys.+Biol%22%5BJournal%5D)">When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation.</a> Mol. Sys. Biol. 2, 49(2006).</li>
<li>Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Logic+of+the+yeast+metabolic+cycle%3A+temporal+compartmentalization+of+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes.</a> Science. 310, 1152-1158 (2005).</li>
<li>Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Growth+and+Size+Homeostasis+in+Proliferating+Animal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells.</a> Science. 325, 167-171 (2009).</li>
<li>Conlon, I., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+in+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Size control in animal development.</a> Cell. 96, 235-244 (1999).</li>
<li>Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+cell+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of cell size.</a> Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).</li>
<li>Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+hopf+bifurcation+in+a+live+predator-prey+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system.</a> Science. 290, 1358-1360 (2000).</li>
<li>Cohen, E. P., Eagle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+chemostat+for+the+growth+of+mammalian+cells%3A+characteristics+of+cell+growth+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture.</a> J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Chemostaten staat de teelt van microben in-groei gecontroleerde steady-state condities. De cellen groeien continu met een constante snelheid waardoor een invariant externe omgeving. Dit in tegenstelling tot batch cultuur werkwijzen waarbij de externe omgeving verandert voortdurend en de groei wordt bepaald door een complexe interactie tussen omgeving en genotype. Aldus is een groot voordeel van het kweken van microben in chemostaten via batch cultuur is de mogelijkheid om experimenteel controle van de groei van cellen. ...

De groei van cellen wordt geregeld door complexe netwerken van op elkaar inwerkende genetische en omgevingsfactoren 1,2. De multifactoriële regulatie van celgroei vereist een systeem-level benadering van haar studie. Echter, de strenge studie van gereguleerde celgroei uitgedaagd door de moeilijkheid experimenteel regelen van de snelheid waarmee cellen groeien. Bovendien, zelfs in de meest eenvoudige experimenten extracellulaire voorwaarden zijn vaak dynamisch en complex als de cellen voortdurend veranderen hun omgeving als ze zich kunnen vermenigvuldigen. Een oplossing voor deze problemen is door de chemostaat: een werkwijze voor het kweken van cellen die experimentele controle cel groei kunnen in bepaalde, invariante en gecontroleerde omgevingen. Werkwijze continu kweken met een chemostaat werd onafhankelijk beschreven door Monod 3 en Novick &amp; Szilard 4 in 1950. Zoals oorspronkelijk bedacht worden cellen gekweekt in een vast volume van media die continu verdund door toevoeging van nieuwe media en gelijktijdige verwijdering van oude media en cellen (figuur 1). Gekoppelde gewone differentiaalvergelijkingen (figuur 2) beschrijven de mate van verandering in cel dichtheid (x) en de concentratie van een groei-beperkende nutriënt (en) in de chemostaat vat. Belangrijk is dat deze stelsel van vergelijkingen voorspelt een enkele (nul) stabiele steady-state (figuur 3) met de opmerkelijke implicatie dat bij steady-state, de specifieke groeisnelheid van de cellen (dwz de exponentiële groei constant) is gelijk aan het tarief waarbij de kweek wordt verdund (D). Door het variëren van de verdunning is het mogelijk om steady-state populaties van cellen vast te stellen op verschillende groeipercentages en onder verschillende omstandigheden van nutriënten limitatie. De experimentele controle groei middels chemostaten was cruciaal voor de ontwikkeling van een begrip van hoe celfysiologie veranderingenmet groeipercentages 5,6. Echter, deze voormalige steunpilaar van microbiologische methoden werd steeds obscure tijdens de explosie in het moleculair biologisch onderzoek in de late twintigste eeuw. Vandaag, hernieuwde belangstelling voor de groei controle in zowel microben en meercellige organismen en de komst van genoom-schaal voor systemen-niveau analyse is de motivatie voor het gebruik van chemostaten vernieuwd. We beschrijven hier drie toepassingen die inspelen op de precieze controle van de cel groeicijfers en de externe omgeving die uniek zijn mogelijk met behulp van chemostaten. Eerst beschrijven we het gebruik van chemostaten om te onderzoeken hoe de overvloed van duizenden biomoleculen - zoals transcripten en metabolieten - gecoördineerd worden gereguleerd met de groeisnelheid. Ten tweede, beschrijven we hoe chemostaten kan worden gebruikt om nauwkeurige ramingen van de groei-rate verschillen tussen verschillende genotypen in-nutriënten beperkt omgevingen met behulp van competitie-experimenten verkrijgen. Ten derde, we beschrijven hoe chemostaten kanworden gebruikt om adaptieve evolutie van cellen groeien in constante voedselarme omgevingen te bestuderen. Deze voorbeelden illustreren de manier waarop chemostaten worden waardoor systemen-niveau onderzoeken van de celgroei regelgeving, gen door milieu interacties en adaptieve evolutie.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Bottle 9.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-867</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Stopper, Size 12, Green Neoprene</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Straight Connector</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>General purpose ties 4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9557052</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Tubing, Silicone Rubber</td><td>Small Parts</td><td>B000FMWTDE</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Tubing, Silicone, 3/8 in OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Tubing, Silicone, 7/32 in OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Hook Connectors</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-66-18Q</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Ratchet Clamp</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Luer, Female</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45512-34</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Luer, Male</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45513-04</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9131037</td><td>Voor mediavat en beslag</td></tr><tr><td>Direct-Reading Flowtube for Air</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Direct-Reading Flowtube for Nitrogen</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32048-63</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Gas Proportioner Multitube Frames</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-50</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Regulator, Two-Stage Analytical</td><td>Airgas</td><td>Y12-N145D580</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Hose Adaptor, Stainless Steel</td><td>Airgas</td><td>Y99-26450</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Hose Male Adaptor</td><td>Airgas</td><td>WES544</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Norprene Tubing</td><td>US Plastics</td><td>57280</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Tripod Base</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Valve Cartridges</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>Voor stikstofgas setup</td></tr><tr><td>Carboy 10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>Voor media bereiding</td></tr><tr><td>Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; voor 45 mm halsmaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>Voor media bereiding</td></tr><tr><td>Media Bottle 100 ml, 45 mm halsmaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>Voor media bereiding</td></tr><tr><td>calcium chloride&middot;2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>magnesium sulfate&middot;7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>potassium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>ammonium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423400010</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>boric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>copper sulfate&middot;5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>potassium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>ferric chloride&middot;6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>manganese sulfate&middot;H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>sodium molybdate&middot;2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>zinc sulfate&middot;7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>calcium pantothenate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>folic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>inositol (aka myo-inositol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>niacin (aka nicotinic acid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>p-aminobenzoic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14621-2500</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>pyridoxine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9755</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>riboflavin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>thiamine HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP892-100</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0750</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td><td>Media Reagents</td></tr></tbody></table>

het gebruik van chemostaten in microbiële systems biology

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cellen reguleren hun groeitempo in reactie op signalen van de buitenwereld. Als de cel groeit, moeten diverse cellulaire processen worden gecoördineerd waaronder macromoleculaire synthese, metabolisme en uiteindelijk, betrokkenheid bij de celdeling cyclus. De chemostaat, een methode voor het regelen van experimenteel cel groei, biedt een krachtig middel systematisch bestuderen hoe groeipercentage gevolgen cellulaire processen - met inbegrip van genexpressie en stofwisseling - en de regulerende netwerken die het tempo van de celgroei. Wanneer gedurende honderden generaties chemostaten kan worden gebruikt om adaptieve evolutie van microben in milieuomstandigheden die de celgroei beperkt bestuderen. We beschrijven het principe van chemostaat culturen, tonen hun werking en geeft voorbeelden van de verschillende toepassingen. Na een periode van onbruik na hun introductie in het midden van de twintigste eeuw, de convergentie van genoom-schaal methodologieën met een vernieuwd inlangstelling in de regulatie van de celgroei en de moleculaire basis van adaptieve evolutie is het stimuleren van een renaissance in het gebruik van chemostaten in biologisch onderzoek.

Een groot voordeel van chemostaten is het vermogen om de groei van cellen experimenteel regelen door het variëren van de verdunning. In de gist Saccharomyces cerevisiae, de morfologie van de cel is informatief van de fase in de celdelingscyclus. Populaties met hogere groei bevatten een hoger percentage actief delende cellen zoals bepaald door de fractie unbudded cellen (figuur 5A). Analyses van globale mRNA expressie in chemostaat culturen is gebleken dat de expressie van vele genen differentieel tot ex...

Celgroei tarief is een gereguleerd proces en een primaire determinant van cel fysiologie. Continue kweken met chemostaten maakt extrinsieke controle cellen groei met nutriënten limitatie de studie van moleculaire netwerken die celgroei en hoe deze netwerken ontwikkelen om optimale celgroei regelen vergemakkelijken.

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

De algemene doelstellingen van de volgende presentatie zijn het beschrijven van het principe van de chemostaat, het demonstreren van de werking ervan en het geven van voorbeelden van toepassingen waarin chemostaten worden gebruikt. Dit wordt bereikt door eerst het chemostaatvat te assembleren en te inoculeren, om vervolgens continu nieuw medium toe te voegen terwijl oud medium en cellen tegen een constante snelheid worden verwijderd. Mathematische modellering beschrijft de verandering in celdichtheid en de verandering in concentratie van een groeibeperkende voedingsstof binnen elke chemostaat.Het gebruik van deze vergelijkingen maakt het mogelijk om een enkele, stabiele, niet-nul stationaire toestand te voorspellen waarin de cel- en nutriëntenconcentraties constant zijn en de specifieke groeisnelheid van de cellen gelijk is aan de snelheid waarmee de cellen worden verwijderd. Door de nauwkeurige controle van de celgroei en de omgeving binnen de chemostaten te combineren met andere technologieën, kunnen resultaten worden verkregen die systeembiologische onderzoeken naar celgroeiregulatie, genetische veranderingen en adaptieve evolutie mogelijk maken. Het belangrijkste voordeel van deze methode van celkweek ten opzichte van andere technieken is dat de groeisnelheid wordt gecontroleerd en de externe omgeving van de cel constant blijft.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de celbiologie en evolutie, zoals wat de moleculaire basis is van de regulatie van celgroei en adaptieve evolutie in gedefinieerde omgevingen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het opzetten en onderhouden van hemostaatculturen moeilijk is vanwege het grote aantal betrokken stappen en componenten. Begin deze procedure door eerst het six four systeem in te schakelen met de hoofdschakelaar.Spoel vervolgens het hemostatvat, de roerunit en de aangesloten slangen grondig na met gedeïoniseerd water. Controleer alle slangen en O-ringen en vervang alle onderdelen die versleten lijken. Zodra de roerunit en de aandrijfas zijn gemonteerd, vult u het vat met 300 milliliters DI water.Controleer het elektrolytniveau van de opgeloste zuurstofsonde en zorg ervoor dat de onderste behuizing voor de helft is gevuld met elektrolytoplossing. Kalibreer vervolgens de pH-sonde. Koppel de sonde na kalibratie los van de fermentor.Spoel af met DI-water en plaats deze in de poort van het hemostat-vat. Draai aan tot deze handvast zit. Plaats het hemostat-vat, met de aangesloten probes, in het rek en noteer op het vat met welke fermentor de pH-probe is gekalibreerd. Bereid ten slotte de probes en slangetjes voor op autoclaveren door de dop op de pH-probe te plaatsen en de opgeloste zuurstofprobe en alle vrije uiteinden van de slangetjes te bedekken met autoclavefolie.Een lege car die is afgesloten met een rubberen plug met een luchtinlaat en een mediumuitlaat. Zorg ervoor dat het uiteinde van de mediumslang met folie is bedekt. Bevestig een filterbeker van 500 milliliter aan een mediumfles van 100 milliliter.Verwijder het katoenfilter met een pincet, gesteriliseerd met ethanol, uit het filter en bevestig dit onmiddellijk aan de filtratiepoort van de mediacar. Sluit de mediacar aan op een vacuümbron en filter. Steriliseer 10 liters vers bereid medium door dit aan de filterbeker toe te voegen.Wanneer de filtratie van het medium is voltooid, sluit de filtratiepoort af met een metalen klem. Nadat de hemostat-vaten zijn geautoclaveerd en hebben kunnen afkoelen, plaatst u het vat in de bijbehorende warmtemantel. Sluit de temperatuursensor, de pH-elektrode en de opgeloste zuurstofsensor aan.Laat het vat minstens zes uur staan met de stroom ingeschakeld, zodat de probes voor opgeloste zuurstof kunnen polariseren. Verbind vervolgens de media-carboy met het hemostat-vat. Gebruik ethanol om de uiteinden van de buisjes zo steriel mogelijk te houden.Rijg vervolgens de pompslang door de pomp en open de klem. Plaats daarna het uiteinde van elke effluentslang in een apart opvangreservoir. Sluit de luchttoevoer aan via een autoclaaffilter en schakel de luchtstroom in.Het water in elke spier moet uit de effluentbuizen stromen, wat aangeeft dat alle afsluitingen correct zijn gevormd. Pas de hoogte van de effluentbuis aan tot het gewenste werkvolume van 300 milliliters. Druk handmatig op de pomp totdat het medium in het hemostaatvat begint te stromen.Koppel vervolgens de slang los van de pomp. Zodra het medium de effluentbuis bereikt, sluit u de slang opnieuw aan op de pomp en sluit u deze af terwijl het medium is voorbereid. Start het basisprogramma met de impeller ingesteld op 400 RPM en de temperatuur ingesteld op 30 graden Celsius.Kalibreer vervolgens de probes voor opgeloste zuurstof door de luchtoevoer uit te schakelen en over te schakelen op stikstofgas. Wacht ten minste één uur en noteer de gemeten waarde als de lage meting. Schakel terug naar een luchtoevoer met een omgevingsconcentratie aan zuurstof en wacht nog ten minste één uur.Noteer deze meting als de hoge leeswaarde. Start op dit punt de gegevensregistratie met de iris-software vóór de inoculatie. Steriliseer de bovenkant van het kweekvat met 70% ethanol.Open vervolgens de poort van het vat met een schroevendraaier en pipetteer één milliliter van een overnight-cultuur in het vat, en plaats de schroef daarna terug. Zodra de culturen hun vroege stationaire fase bereiken, start u de pompen en stelt u de gewenste stroomsnelheid in. Door het aantal seconden dat de pomp aan en uit staat te specificeren, worden de stroomsnelheid en het cultuurvolume bepaald.Bepaal de verdunningssnelheid. Definieer met de six fours-interface een programma waarin de pomptiming, temperatuur en impellersnelheid worden gespecificeerd. Start het programma vervolgens na ten minste twee uur.Noteer de tijd en gebruik een maatcilinder om te meten hoeveel medium uit het vat is verwijderd. De verwijderde hoeveelheid is gelijk aan het volume dat aan het hemostaatvat is toegevoegd en kan worden gebruikt om de verdunningssnelheid te berekenen, de uitstroom af te tappen en deze te gebruiken om de celdichtheid te meten. Een steady-state groei is bereikt wanneer de celdichtheid in de loop van de tijd niet meer verandert.Zodra een gestage toestand is bereikt, worden kleine monsters verzameld door deze gedurende enkele minuten uit de effluentbuis in een opvangbuis te laten stromen. Voor genexpressie- en metabolietanalyses zijn grotere monsters nodig. Deze kunnen snel worden verkregen door de schroef los te draaien, het metalen uiteinde van de effluentbuis vast te houden en de buis langzaam te laten zakken.Wanneer een groot volume wordt verwijderd, moet de stroomsnelheid worden verlaagd om dezelfde verdunningssnelheid te behouden. Stel eerst steady-state culturen op van twee giststammen met identieke verdunningssnelheden en volumes. Neem passief één milliliter uit elk vat om als controles te gebruiken voor de daaropvolgende flowcytometrie-analyse. Centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij 6.000 RPM, resuspendeer ze in één milliliter PBS en bewaar de buis bij vier graden Celsius.Plaats vervolgens de effluentbuis van één vat tegelijk in een autoclave-maatkolf. Draai de schroef die de effluentbuis vasthoudt los en druk voorzichtig naar beneden om 150 milliliters cellen uit de chemostaat te verdrijven, waarna het metalen uiteinde van de effluentbuis terug wordt gebracht naar de oorspronkelijke positie. Wanneer u klaar bent, opent u, na sterilisatie van het gebied, de vatpoort aan de bovenkant van het chemostaatvat.Plaats een steriele trechter in de opening en voeg 150 milliliters van de andere cultuur toe. Sluit vervolgens de poort en herhaal dit met het tweede vat. Elk vat bevat nu een 50 50 mengsel van de twee stammen; neem eventueel elke twee tot zes uur monsters gedurende twee tot drie dagen.Bewaar de monsters in PBS en analyseer de stamverhoudingen in elk monster met behulp van flowcytometrie. Nadat een steady-state chemostaatcultuur is opgezet met een stam van een bekend genotype onder een gedefinieerde nutriëntenbeperking, wordt de ongestoorde cultuur gedurende enkele honderden generaties in stand gehouden, waarbij het mediumreservoir naar behoefte wordt aangevuld met vers medium. Houd een fossiel archief bij van de adapterende populatie door elke twee tot drie dagen passief monsters van de uitstroom te nemen.Bewaar het monster in 15% Glycerol bij -80 °C. Na voltooiing van de selectie wordt een monster van de cellen geplaatst op vaste agarplaten. Zodra de cellen tot kolonies zijn uitgegroeid, wordt een onbevooroordeelde steekproef van kolonies geselecteerd met tandenstokers en worden de klonen geïnoculeerd in individuele wells van een 96-well plaat met 100 µL medium. Laat de clonale monsters gedurende de nacht groeien.Voeg vervolgens 100 µL 30% glycerol toe aan elke put en bewaar deze bij -80 °C tot gebruik voor genomische analyse. Een groot voordeel van chemostaten is de mogelijkheid om de groeisnelheid van cellen te beheersen. Het percentage gistcellen, waarvan de delende cellen hier op de Y-as worden weergegeven, is een goede weergave van hun groeisnelheid.Zoals hier te zien is. Dit percentage stijgt op een nagenoeg lineaire wijze bij een toenemende verdunningssnelheid. Hogere verdunningssnelheden resulteren in snellere groeisnelheden, wat kan leiden tot systematische stijgingen in genexpressie, hier weergegeven door een toename van de abundantie van UTR twee mRNA.Er kunnen echter ook systematische afnames in genexpressie optreden bij een verhoogde groeisnelheid, zoals in het geval van ASM one. De relatieve fitness van verschillende genotypen kan worden bepaald door competitie-assays uit te voeren in hemostaten met behulp van fluorescentiegelabelde cellen en flowcytometrie-analyse; hier wordt een representatief resultaat getoond waarin een mutant concurreerde met een fluorescentiegelabelde wild-type stam. In dit voorbeeld heeft de mutantstam een groeivoordeel van 40% per generatie.Analyse van de volledige genoomsequentie kan worden gebruikt om verworven mutaties te identificeren in cellen met een verhoogde fitness, na langdurige selectie in chemostaten. Zo identificeerde analyse van onafhankelijke adaptieve evolutie-experimenten onder stikstofbeperkende omstandigheden verschillende allelen met variaties in het kopie-aantal op de gap1-locus, die codeert voor de algemene aminozuurpermease. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals massaspectrometrie, flowcytometrie en next-generation sequencing, worden ingezet om soortgelijke vragen te beantwoorden over de regulatie van celgroei en adaptieve evolutie op systeemniveau.De ontwikkeling van deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in vakgebieden variërend van microbiologie tot celbiologie om te bestuderen hoe de celphysiologie en moleculaire processen worden beïnvloed door variaties in de celgroeisnelheid. Na het bekijken van deze video heeft u een goed beeld van hoe u chemostaatculturen opzet en onderhoudt, evenals de verschillende manieren waarop monsters worden verzameld voor diverse toepassingen.

the-use-of-chemostats-in-microbial-systems-biology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We ontwikkeld en gevalideerd een kleine voetafdruk array van miniatuur chemostaten opgebouwd uit gemakkelijk beschikbare onderdelen voor lage kosten. Fysiologische en experimentele evolutie resultaten waren vergelijkbaar met groter volume chemostaten. De Ministat reeks biedt een compacte, goedkope, en toegankelijk platform voor traditionele chemostaat experimenten, functionele genomica, en chemische screening toepassingen.

Ontwerp en gebruik van multiplexverzending chemostaat Arrays

We beschrijven een goedkope, configureerbare morbidostat die de karakterisering van antibioticaresistentie mogelijk maakt door de medicijnconcentratie dynamisch aan te passen. Het apparaat kan worden geïntegreerd met een multiplex microfluïdisch platform. De benadering kan worden opgeschaald voor laboratoriumstudies naar antibioticaresistentie.

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

We ontwierpen een continu kweken inrichting voor gebruik met systemen optogenetic aan kweken van microben en regelmatig afbeeldingscellen branden in het effluent met een omgekeerde microscoop. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties op de verlichting kan worden gemeten over meerdere dagen.

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige werking van 48 parallelle celculturen onder uiteenlopende omstandigheden in een systeem van microbioreactor wordt gepresenteerd. Proces van de cultuur van de cel, oogst en latere antilichaam titer analyse worden beschreven.

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Het evolver Framework maakt een continue microbiële cultuur met hoge resolutie en dynamische controle over experimentele parameters mogelijk. Dit protocol laat zien hoe het systeem toe te passen om een complex fitness-experiment, begeleiden gebruikers op de programmering geautomatiseerde controle over vele individuele culturen, meten, verzamelen en interactie met experimentele gegevens in real-time.

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.

Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

Hier gepresenteerd is het protocol voor een in situ chemotaxis test, een recent ontwikkeld microfluïdisch apparaat dat studies van microbiële gedrag direct in de omgeving mogelijk maakt.

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

We presenteren een protocol voor het millifluidische continue kweekapparaat (MCCD), waarmee bacteriële populaties onder constante omstandigheden met weinig nutriënten (tot honderden nanomolaire concentraties) of temporele nutriëntenfluctuaties op een minimale tijdschaal kunnen worden gekweekt.

Een continu kweek millifluidisch apparaat voor de studie van Escherichia coli onder lage en fluctuerende voedingsomstandigheden

Leer het gebruik van chemostaten voor microbiële systems biology met continue celkweek en wiskundige modellering. Deze methode biedt precieze controle over groeisnelheid en stabiele omstandigheden voor onderzoek naar celbiologie en evolutionaire adaptatie.

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

Meer video's verkennen