Name: Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Leer de productie van hoogwaardig plasma retinol bindend eiwit voor real-time analyse van STRA6-receptoractiviteit. Dit protocol optimaliseert expressie, refolding en HPLC-zuivering voor functionele assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door National Institutes of Health subsidie ​​R01EY018144.

1. Productie, hervouwing, en HPLC zuivering van Holo-RBP <ol><li> Transformeren BL-21cells de pET3a vector die het cDNA voor menselijke RBP met 6x His tag aan de N-terminus. Groeien de getransformeerde BL-21 cellen in een shaker bij 37 ° C in 40 ml LB medium met carbenicilline tot OD bij 600 nm bereikt 0.5. RBP eiwitexpressie induceren door toevoeging IPTG tot 1 mM. De bacteriën groeien bij 37 ° C nog eens 5 uur. </li><li> RBP geproduceerd in E.coli is vooral aanwezig in onoplosbare inclusielichamen. Om insluitingslichamen, pellet cellen verrijken op 10.000 xg gedurende 20 minuten. Vervolgens ultrasone trillingen de cellen op ijs in 5 ml PBS met proteaseremmers, gevolgd door 2 cycli van invriezen en ontdooien. Pellet beneden de insluitingslichamen bij 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en bewaar de pellet op ijs. </li><li> Oplossen van het insluitingslichaam pellet door sonicatie in 10 ml 7,5 M guanidine hydrochloride. Voeg een half volume (5 ml) van 25 mM Tris buffer, pH 9,0 en DTT tot een uiteindelijke concentration van 10 mM. Krachtig mengen oplossing op een vortex mixer nacht bij kamertemperatuur volledig verminderen en eiwitten denatureren. </li><li> Centrifugeer de eiwitoplossing om onoplosbaar materiaal te verwijderen bij 18.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Na de spin, breng het supernatant naar een nieuwe buis en plaats de buis op ijs. </li><li> Bereid vier volumes (60 ml) van hervouwingsbuffer (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystine, 3,0 mM cysteine, 1 mM EDTA). Ontgas de hervouwingsbuffer. Bereid ook 600 ul 10 mM retinol in ethanol bij weinig rood licht. Hou het in het donker op het ijs. Zowel de hervouwingsbuffer en retinol oplossing moet vers worden bereid. </li><li> Koel zowel de eiwitoplossing en het hervouwingsbuffer op ijs gedurende ten minste 30 minuten. Hogere temperaturen vermindert waarschijnlijk de kwaliteit van de opnieuw gevouwen RBP. Voeg 1 ml hervouwingsbuffer druppelsgewijs en 10 pi oplossing retinol beurt terwijl eiwitoplossing wordt krachtig gemengd in een bekerglas op ijs. Herhaal deze stap totdat alle hervouwingsbuffer en retinoltoegevoegd. Blijf roeren de reactie op ijs in het donker gedurende 5 uur. </li><li> Spin down de hervouwingsreactie bij 24.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Het is essentieel om de aggregaten te verwijderen direct na de hervouwingsreactie. </li><li> Concentreer de bovenstaande vloeistof met Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) tot ongeveer 10 ml. Laat me niet concentreren de gevouwen oplossing meer dan dit niveau. Concentratie teveel leidt tot eiwitaggregatie en verlaagt de uiteindelijke opbrengst en kwaliteit van correct gevouwen RBP. Verdun het geconcentreerde monster met koude PBS tot 100 ml. Het doel van deze stap is om de componenten te verwijderen in het hervouwingsreactie die interfereren met nikkel zuivering. </li><li> Draai de oplossing een keer bij 24.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Het is belangrijk verwijderen neerslag. Breng de bovenstaande twee buizen van 50 ml, die elk 1 ml Ni-NTA slurry die is gewassen met PBS. Draai de buizen bij 4 ° C gedurende een uur. Incuberen verdunde oplossing fof 1 uur kunnen de precipitatie van verkeerd gevouwen eiwitten die moeten worden verwijderd. </li><li> Spin down de buizen bij 500 xg gedurende 3 minuten. Verwijder voorzichtig supernatant. Alles wat drijvende moeten worden verwijderd. Voeg koud PBS tot 30 ml per buis. Spin opnieuw en verwijder het supernatant. Herhaal dit proces totdat u niets anders dan kralen in de buis. </li><li> Breng de Ni-NTA hars naar een lege kolom. Wassen hars met 20 kolomvolumes van 10 mM imidazool, 500 mM NaCl in PBS. Elueren His-RBP in 5 kolomvolumes van 100 mM imidazool in PBS. Kan deze oplossing niet voor langere tijd, en bevriezing vermindert de uiteindelijke opbrengst en kwaliteit. Voor het beste resultaat, RBP onmiddellijk te zuiveren met behulp van HPLC. </li><li> Dialyseer His-RBP gezuiverd uit de Ni-NTA hars tegen 25 mM Tris, pH 8,4, en 120 mM NaCl. Een concentrator kan ook worden gebruikt voor bufferuitwisseling. Clear monsters voor HPLC door centrifugeren bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C vlak voor elke run. </li><li> Zuiveren holo-RBP op HPLC met een ionuitwisselende kolom AX-300 door een NaCl stapgradiënt (220 mM 12 min, 360 mM 15 min en 1000 mM 15 min) met 25 mM Tris, pH 8,4 als mobiele fase bij 1 ml / min. Zoals NaCl concentratie stijgt, wordt holo-His-RBP losgelaten en apo-RBP en verkeerd gevouwen RBP blijven gebonden aan de kolom (Figuur 1). Als RBP hervouwing niet optimaal gebeurt, verkeerd gevouwen RBP (bijv. verkeerd gevouwen RBP-I in figuur 1) kan het gehele preparaat overheersen. </li><li> Herstel de correct gevouwen holo-RBP van de piekfracties bij 360 mM NaCl. Nauwgezet toezien op de elutieprofiel van correct gevouwen en verkeerd gevouwen His-RBP. Bij 1.000 mM NaCl, het grootste deel van verkeerd gevouwen His-RBP moeten worden vrijgegeven. </li><li> Fracties die holo-RBP worden samengevoegd, geconcentreerd en gedialyseerd tegen PBS gedurende de nacht bij 4 ° C. Controleer de uiteindelijke opbrengst en kwaliteit (330 nm/280 nm) door spectrofotometer. Correct gevouwen product moet een 330 nm/280 nm-verhouding van iets meer dan 1 (figuur 1). </li><li> Om de productiviteit tee apo-RBP, een gelijk volume van het gezuiverde heptaan holo-RBP en meng door het roteren overnacht bij 4 ° C. Centrifugeer bij 16.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C voorzichtig onder waterfase naar een nieuwe buis (vermijden van het neerslag bij de interface). Herhaal dit proces driemaal met een 3 uur incubatie voor elke. Controleer absorptie op een NanoDrop spectrofotometer te zorgen dat de 330 nm piek is gedaald tot het achtergrondniveau. </li></ol> 2. Real-time monitoring van STRA6-gekatalyseerde Retinol Release and Retinol Laden <ol><li> Blokkeren zwarte 96-well plaat Microfluor-2 (Thermo Scientific) met 200 ul van Blocker Caseïne (Pierce) gedurende de nacht bij 4 ° C om niet-specifieke aanhechting van holo-RBP de plastic voorkomen. Blocker Caseïne geeft de beste blokkerend effect van alle blokkerende oplossingen we getest. </li><li> Membranen vers bereid uit cellen die STRA6 of controle cellen gewassen met PBS en geleid door een Hamilton spuit (GastiGHT # 1710) 6 keer om een ​​uniforme suspensie in PBS produceren. We gebruiken meestal membranen afkomstig van 1/100 tot 1/20 van cellen gekweekt op een 100 mm schaal per reactie. </li><li> Ze wast de beklede putjes van Microfluor-2 plaat met 200 ul PBS. Koel de plaat op ijs voor toevoeging van membraansuspensie (50 ul per putje). </li><li> Real-time monitoring van retinol fluorescentie wordt gemeten met behulp van fluorescentie optiek van de Polarstar Omega (BMG Labtech) met de excitatiefilter 320ex en de emissie filter 460-10. Het programma is ingesteld op de Endpoint leesmodus. De plaat kan ook worden gebruikt om een ​​tijdverloop te meten als de tijdsintervallen niet veranderd. Het signaal van elk tijdstip is het gemiddelde van 10 metingen (orbitaal middeling met een diameter van 2 mm) en de versterking is ingesteld op 1.800. De plaat wordt geschud gedurende 10 sec bij 500 rpm met behulp van dubbele-orbitale schudden vóór elke meting. </li><li> Om de retinol afgifte test start, worden de putten te lezen een keer met de Endpoint lezen mode vóór holo-RBP (typisch 1 uM uiteindelijke concentratie) toegevoegd bij 0 minuten. Zodra holo-RBP wordt toegevoegd, wordt de reactie gevolgd continu om 5-10 min gedurende 1-3 uur. De retinol loading assay, all-trans retinol (typisch 1 uM eindconcentratie) beginnen wordt toegevoegd aan de wells bij weinig rood licht. De plaat wordt een keer lezen voordat apo-RBP wordt toegevoegd bij 0 minuten. Zodra apo-RBP wordt toegevoegd, wordt de reactie gevolgd continu om 5-10 min gedurende 1-3 uur. </li><li> Nadat alle metingen worden uitgevoerd, download de ruwe data (voorbeeld in Figuur 2) uit de Omega Data-analyse software (BMG Labtech) naar Microsoft Excel voor data-analyse. Elk tijdstip genereert een bestand dat de lezingen van alle experimentele omstandigheden bevat. Bijvoorbeeld, als er 20 tijdstippen consolideren 20 bestanden in een Excel bestand voor gegevensanalyse. </li><li> Voor gegevensanalyse worden de fluorescentiesignalen vóór de toevoeging van retinol of holo-RBP min bij 0 beschouwd achtergrondsignalen eend afgetrokken van de uiteindelijke fluorescentiesignalen op alle tijdstippen. Hoewel de achtergrond signalen laag vergeleken met retinol fluorescentie in holo-RBP, aftrekken van de achtergrond elimineert de niet-specifieke invloed van lichtverstrooiing door de membranen en maakt het mogelijk te concentreren op de retinol fluorescentie van holo-RBP of retinol bij 0 min. </li></ol> 3. Real-time monitoring van STRA6-gekatalyseerde Transport van Retinol Van Holo-RBP om CRBP-I <ol><li> Retinol-EGFP een nieuwe fluorescentieresonantie (FRET) paar dat onlangs is aangetoond 41. STRA6-gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om EGFP-CRBP-I wordt in real-time door het meten van retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I fusieproteïne met 6xHis tag (EGFP-CRBP-I) wordt geproduceerd in zoogdiercellen en gezuiverd op Ni-NTA hars voor het experiment. EGFP-CRBP-I kan worden opgeslagen in PBS met proteaseremmers voor een korte tijd bij 4 ° C. Ook de fusie-eiwit is bevroren -80 ° C in kleine porties. </li><li> Voor de reacties Bereid een geblokkeerde Microfluor-2 plaat en membranen zoals hierboven beschreven. Ze wast de beklede putjes van Microfluor-2 plaat met 200 ul PBS vóór de toevoeging van membraansuspensie (50 ul per putje). </li><li> Real-time retinol-EGFP FRET wordt gemeten met behulp van Polarstar Omega met de excitatiefilter 320ex en de emissie filters 460-10-en 510-10 met behulp van gelijktijdige duel emissie fluorescentie optiek. Het programma is ingesteld op de Endpoint leesmodus. De plaat kan ook worden gebruikt om een ​​tijdverloop te meten als de tijdsintervallen niet veranderd. Het signaal van elk tijdstip is het gemiddelde van 10 metingen (orbitaal middeling met een diameter van 2 mm) en de versterking is ingesteld op 1.800 per kanaal. De plaat wordt geschud gedurende 10 sec bij 500 rpm met behulp van dubbele-orbitale schudden vóór elke meting. </li><li> De reacties, EGFP-CRBP-I (typisch 1 uM eindconcentratie) beginnen wordt toegevoegd aan de wells. De plaat wordt afgelezen opce met behulp van de Endpoint leesmodus voor holo-RBP wordt toegevoegd bij 0 minuten. Zodra holo-RBP is toegevoegd, wordt de reactie continu gecontroleerd door meting elke 5-10 min voor 1-2 uur. </li><li> Nadat alle metingen worden uitgevoerd, download de onbewerkte data (voorbeeld in figuur 3) van de Omega Data Analysis software Microsoft Excel voor gegevensanalyse zoals hierboven beschreven. </li><li> Retinol-EGFP FRET wordt berekend door de dynamische verandering in de verhouding van de acceptor / donor emissiepieken 47. De vergelijking 41 deze verhouding te berekenen is [(510 -510 t b) / (460 t -460 b)], waarbij 510 t, 510 b, 460 t en 460 vertegenwoordigen b emissie bij 510 nm na initiatie van de reactie ( t = tijdstip) wordt bij 510 nm voor retinol of holo-RBP toegevoegd (b = achtergrond) bij 460 nm na initiatie van de reactie (t = tijdstip) en bij 460 nm voor retinol of holo-RBP toegevoegd (b = achtergrond) respectievelijk. </li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We delen hier een geoptimaliseerde RBP productieprotocol omdat RBP productie en zuivering procedures zijn cruciaal voor het genereren van correct gevouwen RBP. Gezien de mogelijkheid van verkeerd gevouwen RBP soorten en de aanwezigheid van sporen van bacteriële eiwitten zelfs HPLC gezuiverde bacteriën geproduceerde RBP, is het nuttig om natieve RBP gebruik van serum tot een conclusie met betrekking tot RBP bevestigen. Urine RBP, dat commercieel verkrijgbaar is, is een complex mengsel van vele soorten waaronder RBP apo-R...

Vitamine A is een organisch molecuul dat essentieel is voor de menselijke overleving en de goede werking van bijna alle menselijke organen. Vitamine A-derivaten (retinoïden) deel te nemen aan diverse biochemische en cellulaire evenementen, waaronder de detectie van licht voor visie 1,2 en de regulatie van genexpressie en eiwit translatie tijdens de embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels 3-6. Hoewel retinol heeft de mogelijkheid om systemisch verspreiden, evolutie bedacht plasma retinol-bindend eiwit, een specifieke dragereiwit voor vitamine A transport in het bloed hoge efficiëntie en specificiteit te bereiken en toxiciteit van willekeurige diffusie 7-10 vermijden. Een hoge affiniteit receptor die bindt aan RBP en neemt vitamine A hypothese is in de jaren 1970 11-13. Ondanks bewijs verzameld in drie decennia op het bestaan ​​van de RBP receptor 14-31 werd de hypothese receptor besproken vele jaren door de existence van een onjuiste definitie van holo-RBP. De correcte definitie van holo-RBP is dat de hoge affiniteit 1:1 complex tussen retinol en RBP. Herhaalde extractie van holo-RBP organisch oplosmiddel moet apo-RBP produceren. Deze definitie wordt gebruikt door bijna alle laboratoria bestuderen RBP 7,9,32-35 of de RBP-receptor 14-31,36-42. De onjuiste bepaling van holo-RBP die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor weerleggen de acute mengsel van vrije retinol met apo-RBP. Aangezien de functie van de receptor RBP in vitamine A opname van holo-RBP is retinol bevrijden van holo-RBP de RBP receptor zou geen rol spelen in retinol opname als retinol vrij om te beginnen (zoals voorgesteld door de onjuiste bepaling van holo -RBP). De recente identificatie van RBP receptor als multitransmembrane domein eiwit STRA636 en zijn functie in vitamine A opname van holo-RBP 36-43 sterk pleit tegen de hypothese dat niet RBPhebben een receptor aan vitamine A. Gedetailleerde analyse bleek dat STRA6 9 transmembraandomeinen de N-terminus extracellulair gelegen en C-terminus gelegen intracellulair 40 moet leveren. Gelegen tussen transmembraan 6 en 7 is een essentieel RBP bindend domein 39. STRA6 is gekoppeld aan zowel LRAT en CRBP-I in vitamine A opname van holo-RBP, maar noch LRAT noch CRBP-I is absoluut noodzakelijk voor een betere STRA6 activiteit 41. STRA6&#39;s vermogen om retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP is de sleutel tot de vitamine A-opname-activiteit 41. Door te vertrouwen op STRA6 zijn vrij retinol, vitamine A bezorging RBP transporteren vitamine A doelcellen in perifere weefsels met hoge specificiteit en efficiëntie. De kritische belang van holo-RBP definitie en bereiding wordt geïllustreerd door niet alleen de historische discussie over het bestaan ​​van de RBP receptor, maar ook door drie verbonden recente artikelen op basis van holo-RBP definities diflende van het origineel en correcte definitie 44-46. De eerste papier de holo-RBP definitie die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor de receptor bestuderen RBP 44 afkeuren. De tweede en derde papers kwam met een derde definitie holo-RBP dat het nog minder waarschijnlijk retinol worden bestudeerd om een goede complex met RBP 45,46 vormen. Deze studies bereid door mengen van drie H-retinol/RBP holo-RBP (zelfs apo-RBP) met 3 H-retinol. Aangezien deze test niet hebben 3 H-retinol/RBP gevormd en verwijderde niet buitensporige vrije 3H-retinol 45,46 is geen test voor 3H-retinol opname van 3 H-retinol/RBP, maar is een vrije 3H-retinol diffusie assay. Eerder is aangetoond dat STRA6 geen cellulaire opname van vrije retinol verbeteren door LRAT 38 of CRBP-I 41. Vrijwel alle retinol is gebonden aan RBP in het bloed en er geen detecteerbare free retinol. Een van de belangrijkste functie van de RBP-receptor is retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP tijdens retinol opname van holo-RBP 41. Als de retinol kunstmatig model of in vrije vorm te beginnen 45,46 wordt het RBP receptor niet nodig. De sterk verschillende resultaten van de vrije diffusie retinol assay ten opzichte van assays gebaseerd op kunnen bereid holo-RBP illustreren dat correcte voorbehandeling van RBP is cruciaal voor de functionele assays. RBP kan worden gezuiverd uit humaan serum 41, maar is complex en de opbrengst is laag. Een alternatieve benadering is om RBP produceren in E. coli. Omdat E. coli niet de mogelijkheid kunnen zoogdieren uitgescheiden eiwitten vouwen met meer dan een paar disulfidebindingen zoals RBP, is het essentieel om refold RBP en correct gevouwen eiwit te zuiveren. Verkeerd gevouwen eiwitten niet alleen gedragen zich anders uit gecorrigeerde gevouwen RBP in verschillende assays,maar ook tot eiwitaggregatie tijdens opslag. Om dezelfde reden wordt apo-RBP alleen geproduceerd uit hoogwaardig holo-RBP. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van hoge kwaliteit te produceren RBP 100% geladen met retinol door bacteriële expressie, hervouwing, en HPLC zuivering. HPLC zuivering verwijdert niet alleen verkeerd gevouwen RBP, maar ook belangrijke bacteriële besmetting die kan leiden tot ernstige artefacten als RBP wordt gebruikt in signaaltransductie assays. We beschrijven ook twee gevoelige real-time monitoring technieken om retinol vervoer bestuderen door STRA6. Beide technieken zijn afhankelijk van hoge kwaliteit RBP. Vanwege de beperkte ruimte, de klassieke technieken van radioactieve retinoïde-based en HPLC-gebaseerde vitamine A opname testen worden hier niet beschreven.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> guanidine hydrochloride </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cystine </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cysteïne </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Visser </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Visser </td><td> 7,786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicilline </td><td> Visser </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Visser </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptane </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Caseïne </td><td> Doorboren </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 plaat </td><td> Visser </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton spuit Gasdichte # 1710 </td><td> Visser </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses van retinol vervoer door de membraan receptor van plasma retinol bindend eiwit

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamine A is essentieel voor het gezichtsvermogen en de groei / differentiatie van bijna alle menselijke organen. Plasma retinol-bindend eiwit (RBP) is het principe en specifieke drager van vitamine A in het bloed. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek te produceren en te zuiveren holo-RBP en twee real-time monitoring technieken om het vervoer van vitamine A door de hoge-affiniteit RBP receptor STRA6 bestuderen. De eerste techniek is het mogelijk om een ​​grote hoeveelheid hoge kwaliteit holo-RBP (100% geladen met retinol) voor vitamine A transport assays. Hoge kwaliteit RBP is essentieel voor functionele testen, omdat verkeerd gevouwen RBP releases vitamine A gemakkelijk en bacteriële besmetting in RBP voorbereiding kan leiden tot artefacten. Real-time monitoring technieken zoals elektrofysiologie zijn kritische bijdragen geleverd tot de studies van membraan transport. De RBP-receptor-gemedieerde retinol vervoer niet is geanalyseerd in real time tot voor kort. De tweede techniek is de hier beschreven real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol release of laden. De derde techniek is real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om cellulaire retinol-bindend eiwit I (CRBP-I). Deze technieken zorgen voor een hoge gevoeligheid en resolutie in het onthullen van RBP receptor vitamine A opname mechanisme.

We stellen hier representatieve resultaten voor holo-RBP productie en zuivering door HPLC (figuur 1), real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol afgifte van holo-RBP en retinol lading in apo-RBP (Figuur 2) en real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om EGFP-CRBP-I (Figuur 3). Zonder hervouwing, RBP geproduceerd in bacteriën bijna volledig door de aanwezigheid van veel onjuiste disulfide bindingen verk...

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek om hoogwaardige vitamine A / RBP complex en twee real-time monitoring technieken om studeren vitamine A het vervoer door STRA6, de RBP-receptor te produceren.

Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Dit protocol toont de productie van hoogwaardig plasma retinol binding eiwit dat wordt gebruikt om de activiteiten van het retinol binding eiwit receptor in real time te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een grote hoeveelheid retinol binding eiwit uit bacteriën te kweken en te zuiveren. Het gezuiverde retinol binding eiwit wordt volledig gedenatureerd en langzaam opnieuw gevouwen in aanwezigheid van zijn ligand retinol.Vervolgens wordt het correct opnieuw gevouwen retinol binding eiwit gezuiverd met behulp van HPLC om onjuist gevouwen eiwitten en bacteriële verontreinigingen te verwijderen. Zodra hoogwaardig retinol binding eiwit is verkregen, kan het worden gebruikt om de activiteiten van zijn membraanreceptor te bestuderen bij het katalyseren van retinol vrijgave, retinol lading of retinol transport naar cellulair retinol binding eiwit één. In real time.Vandaag zal ik ons verbeterde protocol demonstreren om retinal binding eiwit producerende bacteriën te hervormen en te zuiveren. Deze techniek kan hoogwaardig retinal binding eiwit produceren, wat essentieel is voor functionele assays. Ik zal de nieuw ontwikkelde technieken demonstreren om de receptor voor retinal binding e

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Hier wordt een normale-fase, high-performance vloeistofchromatografiemethode beschreven om kritische retinoïden te detecteren en te kwantificeren die betrokken zijn bij het vergemakkelijken van de visuele functie in zowel oog- als systemisch weefsel, in de context van de systemische vitamine A-toevoer om de essentiële lichtgevoelige rodopsinechromofoor 11-cis-retinal te genereren.

Kwantitatieve analyse van vitamine A-metabolieten in oculaire en niet-oculaire weefsels van muizen met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie

Hier beschrijven we twee kwantitatieve methoden voor het bestuderen van de eiwit-ligand interacties van vitamine A-membraanreceptoren en fotoreceptoropsine met hun respectievelijke fysiologische liganden.

Methodologie voor het bestuderen van interacties van vitamine A-membraanreceptoren en opsine-eiwit met hun liganden bij het genereren van het retinylideen-eiwit

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Dit protocol beschrijft een snelle techniek om de translocatie van GLUT4 kwantificeren van het cytoplasma naar de plasmamembraan van de cellen door flowcytometrie.

Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Biochemische Reconstitutie van Steroid Receptor • Hsp90 eiwitcomplexen en reactivering van Ligand binding

Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

We tonen FRET tussen geconjugeerde polymeer polydiacetylene (PDA) en fluorofoor aan het oppervlak van liposomen PDA voor de detectie van biomoleculen. PDA liposomen bevatte receptor moleculen op hun oppervlak voor biomoleculen te worden gebruikt als probes. Ligand-receptor interacties leiden tot veranderingen in de FRET efficiency tussen de fluorofoor en PDA die de basis van de meetmechanismes.

Real-time monitoring van ligand-receptor interacties met Fluorescence Resonance Energy Transfer

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Leer de productie van hoogwaardig plasma retinol bindend eiwit voor real-time analyse van STRA6-receptoractiviteit. Dit protocol optimaliseert expressie, refolding en HPLC-zuivering voor functionele assays.

Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit

Meer video's verkennen