Name: Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer hoe u stabiele humane cellijnen genereert met tetracycline-induceerbare shRNA- of cDNA-expressie. Deze methode maakt betrouwbare genmanipulatie mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken alle leden van ons laboratorium voor nuttige discussies. Wij danken Joanna Lisztwan en Christina Gewinner voor kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de BBSRC subsidie ​​BB/I021248/1 en de Wellcome Trust subsidie ​​090090/Z/09/ZAH is een Wellcome Trust Research Career Development fellow aan de UCL Kanker Instituut.

1. Klonering van pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol><li> Zoals geïllustreerd in figuur 3, voert een gedeeltelijk digest van pcDNA6/TR plasmide (V1025-20, Invitrogen) met de restrictie-enzymen Xba I en Nco I bij de TetR gen en de promoter van de blasticidine resistentie (BlastR) gen te verwijderen. Isoleer de 4,6 kb vectorfragment. </li><li> De polyadenyleringssequentie uit het TetR gen te introduceren door PCR een Xhol plaats onmiddellijk na het stopcodon van het cDNA met behoud TetR de Xba I plaats bij het ​​5&#39;-uiteinde van het cDNA. Subkloon het resulterende fragment in pMigR1 17 met restrictie-enzymen XbaI en XhoI het genereren van de pMigR1_TetR plasmide. </li><li> Digereren van het pMigR1_TetR vector met de restrictie-enzymen Xba I en Nco I bij de TetR_IRES fragment vrij. Isoleer de 1,25 kb insert fragment. </li><li> Ligeren van het 4,6 kb pcDNA6/TR en de 1,25 kb TetR_IRES fragmenten. Transform het ligatieproduct in competente E.coli en identificeert de gewenste pcDNA6_TetR_IRES_blast construct gebruikmaking van standaard moleculaire biologische technieken. </li></ol> 2. Generatie van cellijnen stabiel tot expressie TetR <ol><li> Op dag 1, Seed 1x10 6 cellen per 10 cm weefselkweekplaat met een standaard groeimedium (bijvoorbeeld DMEM aangevuld met 10% FCS). Seed twee platen, een voor transfectie met pcDNA6_TetR_IRES_blast en de andere als een negatieve controle voor selectie blasticidine. Zorg ervoor dat u de laagst mogelijke doorgang en de aanbevolen groei medium te gebruiken. </li><li> Op dag 2 transfecteren een plaat met 2 pg pcDNA6_TetR_IRES_blast met Fugene 6 (E2691, Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Niet transfecteren de tweede plaat. </li><li> Op dag 3, worden standaard groeimedium bevattende 5 ug / ml blasticidine aan beide platen. Houd er rekening mee dat de optimale selectie concentratie kan variëren voor een bepaalde cellijn en macht need van te voren worden bepaald. </li><li> Op dag 4 worden de cellen gesplitst op 1/5, 1/25, 1/50 en 1/100 met 10-cm platen en standaard groeimedium bevattende 5 mg / ml blasticidine. Zorg ervoor dat u een behoorlijk label platen die getransfecteerde of getransfecteerde cellen. Bereid twee platen per verdunning stap. </li><li> Dagelijkse controle cellen, zodat alle cellen op het getransfecteerde platen stierven binnen de eerste week. Verander selectie media om de 2-3 dagen. </li><li> Na 1-2 weken moet blasticidine-resistente kolonies beginnen te verschijnen. Selecteer platen die 5 tot 50 kolonies opdat enkele kolonies kunnen worden opgehaald. </li><li> Wanneer de kolonies hebben een diameter van ongeveer 5 mm (of groter) bereikt, isoleren ten minste 12 onafhankelijke klonen met klonen cilinders enkele kolonies halen. Breng elke kloon in een aparte putje van een 24-well weefselkweekplaat. Wanneer confluent, splitsen cellen uit elk putje in een enkel putje van een 6-well weefselkweekplaat. </li><li> Doorgaan naar cultuur cldie in de selectie media. Wanneer confluent, split cellen uit elk putje in twee afzonderlijke putjes van een 6-well weefselkweekplaat. </li><li> Voor elke kloon te testen, bevriezen een putje van confluente cellen en oogsten cellen in het andere goed voor het testen door immunoblotting. </li><li> Detecteren TetR door Western blotting met de muis monoklonaal anti-TET02 antilichaam (Mobitec GmbH). Herinneren aan een lysaat van de ouderlijke cellijn als een negatieve controle omvat. </li><li> Selecteer 3 klonen met de hoogste TetR expressie en uit te breiden elk klonale cultuur. Freeze voorraden van elke kloon veelbelovend zo spoedig mogelijk. Tenslotte, bekijk de moleculaire en celbiologische parameters van belang door vergelijking van de oudercel lijnen met de TetR-tot expressie brengende klonen. Selecteer de &#39;beste&#39; kloon met de hoogste TetR uitdrukking die niet wordt weergegeven eventuele wijzigingen in de moleculaire en cel-biologische parameters van belang. </li></ol> 3. Pilot Testen van Pter en pT-Rex DEST30 Vectoren Expressing shRNA of cDNA&#39;s, Respectievelijk <ol><li> Genereren Pter plasmide met shRNA inserts beschreven 12. Construct pT-Rex DEST30 vector (12,301-016, Invitrogen) met het cDNA van belang met Gateway-technologie (Invitrogen). Bij cDNA expressie zal toevoeging van een label aan het cDNA later vergemakkelijken detectie van exogeen tot expressie gebrachte eiwit. </li><li> Tijdelijk transfecteren de ouderlijke doelcel lijn met Pter of pT-Rex DEST30 plasmiden (die ofwel shRNAs of cDNA&#39;s van belang) met behulp van de transfectie reagens van keuze. Voor het testen van shRNA expressieplasmiden zorgen voor hoge transfectie-efficiëntie kan worden bereikt. </li><li> Oogst cellen en proces getransfecteerd voor immunoblotting met de juiste antilichamen, in de verwachting tot een uitputting of overexpressie van uw gen van belang op te sporen. </li></ol> 4. Genereren van stabiele cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) Expressie van shRNAs of cDNA gebruiken Pter of Pt-Rex DEST30 Vectors </p&gt; <ol><li> Op dag 1, zaad 1x10 6 cellen van de &#39;beste&#39; TetR-expressie kloon per 10-cm plaat met behulp van uw standaard groeimedium aangevuld met gecertificeerde Tetracycline-vrij serum (bijvoorbeeld FBS van Invitrogen, 16000-014). Zaad een plaat voor transfectie met Pter (of Pt-Rex DEST30), en een plaat als negatieve controle voor dubbele selectie. Zorg ervoor dat u de laagst mogelijke doorgang te gebruiken. </li><li> Op dag 2 transfecteren een plaat met 2 pg Pter (of Pt-Rex DEST30) met Fugene 6. Niet transfecteren de tweede plaat. </li><li> Op dag 3, worden standaard groeimedium bevattende 5 ug / ml blasticidine en 500 ug / ml zeocine (of 1 mg / ml G418). </li><li> Op dag 4 worden de cellen gesplitst op 1/5, 1/25, 1/50 en 1/100 met 10-cm platen en standaard groeimedium bevattende 5 ug / ml blasticidine en 500 ug / ml zeocine (of 1 mg / ml G418). Bereid twee platen per verdunning stap. </li><li> Controleer dagelijks de cellen, en zorg ervoor dat in de eerste week alle cellen op de niet-getransfecteerde platen zijn gestorven.Wijzig de standaard groeimedium dat blasticidine en zeocine (of G418) om de 3-4 dagen. </li><li> Na 2-3 weken, blasticidine / zeocine (of blasticidin/G418) dubbel-resistente kolonies moeten beginnen te verschijnen. Selecteer platen die 5 tot 50 kolonies aan enkele kolonies te plukken. </li><li> Wanneer de kolonies hebben een diameter van ongeveer 5 mm (of groter) bereikt is, kunt klonen cilinders om enkele kolonies te plukken. Isolaat ten minste 24 afzonderlijke klonen. Breng elke kloon in een aparte putje van een 24-well weefselkweekplaat. </li><li> Cultuur klonen in medium dat onderhoud concentraties blasticidine (5 ug / ml) en zeocine (250 ug / ml) [of G418 (0,5 mg / ml)]. Wanneer confluent, splitsen cellen uit elk putje in een enkel putje van een 6-well weefselkweekplaat. </li><li> Voor elke kloon te testen, een split confluente putje van een 6-well plaat in drie afzonderlijke putjes van een 6-well plaat. Wanneer confluent, bevriezen cellen van het ene goed. Gebruik de resterende twee putten voor het testen van de tetracyclinee-induceerbare expressie. Voeg tetracycline bij een concentratie van 1 ug / ml aan een putje, terwijl de tweede put tetracycline vrij. </li><li> Na 24 tot 96 uur incubatie met Tetracycline, oogst cellen en werkwijze voor immunoblotting met geschikte antilichamen. Kortere incubatietijden tetracycline aanbevolen bij screening voor de inductie van cDNA expressie terwijl meer tetracycline behandelingen nodig om shRNA-gemedieerde afbraak van endogene eiwitten te bepalen. </li><li> Selecteer ten minste twee klonen met de gewenste depletie / overexpressie en vergroten elke cultuur. Freeze voorraden van elke kloon veelbelovend zo spoedig mogelijk. Bij de teelt van Tet-on-klonen voor experimenten altijd voor zorgen dat de media aangevuld met tetracycline-vrij serum en de respectieve selectie antibiotica bij onderhoud concentraties te gebruiken. </li></ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNAs+%28shRNAs%29+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Wij geloven dat Tet-on systemen sterk de analyse van genfunctie maken, met name in celsystemen die moeilijk te manipuleren en / of wanneer de gemanipuleerde gen essentieel voor celoverleving. Bovendien de mogelijkheid om genexpressie te controleren door zeer specifieke Tet-on systemen biedt de mogelijkheid om genfuncties studeren verschillende fasen (bijvoorbeeld tijdens de celcyclus of goed gedefinieerde differentiatie). Werkwijze hier gepresenteerde onderzoekers in staat om de gewenste stabiele genereren Tet-on cellij...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Getest Tet-vrij </td></tr><tr><td> Blasticidine </td><td> Invivogen </td><td> ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocine </td><td> Invivogen </td><td> ant-zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA laboratoria </td><td> P31-011 </td><td> 100 mg / ml in media </td></tr><tr><td> anti-TET02 </td><td> Mobitec GmbH </td><td> TET02 </td><td> Gebruik van 1/1000 tot 1/2000 voor WB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> pT-Rex DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma </td><td> 87128 </td><td> 2 mg / ml in ethanol </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td> 2 mg / ml in water </td></tr><tr><td> Klonen cilinders </td><td> Bellco Glass Inc </td><td> 2090 tot 00.808 </td><td> herbruikbare </td></tr></tbody></table>

genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (tet-on) shrna of cdna expression

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Een belangrijke benadering op het gebied van zoogdiercel biologie is de manipulatie van de expressie van genen van belang in geselecteerde cellijnen, teneinde te onthullen een of meer van de functie van het gen (s) met behulp van transiënte / stabiele overexpressie of knockdown van het gen van belang. Helaas, voor diverse celbiologische onderzoeken deze aanpak is niet geschikt wanneer manipulaties van genexpressie resultaat in cel groei / proliferatie gebreken of ongewenste celdifferentiatie. Daarom hebben onderzoekers aangepast de tetracycline repressor eiwit (TetR), uit de E. coli tetracycline resistentie operon 1, om zeer efficiënte en strakke regelgeving genereren cDNA expressie in zoogdiercellen 2,3. Kortom, TetR aangepast om ofwel (1) blok initiatie van transcriptie door binding aan het Tet-operator (TO) in de promoter regio na toevoeging van tetracycline (Tet-off genoemd systeem) of (2) binden aan de TO thij afwezigheid van tetracycline (Tet-on genoemd systeem) (figuur 1). Aangezien het ongemak dat het Tet-off systeem de continue aanwezigheid van tetracycline (met een halfwaardetijd van ongeveer 24 uur in weefselkweek celkweekmedium) moeten Tet-on systeem is uitgebreider geoptimaliseerd, zodat de ontwikkeling van zeer strakke en efficiënte vectorsystemen voor cDNA expressie zoals hier gebruikt. Kort na de instelling van RNA interferentie (RNAi) voor gen knockdown in zoogdiercellen 4, vectoren die korte haarspeld RNA (shRNAs) beschreven die functie, vergelijkbaar met siRNA 5-11. Echter, deze shRNA gemedieerde knockdown benaderingen hebben dezelfde beperking als conventionele knockout strategieën, aangezien stabiel uitputting niet uitvoerbaar is targets gen zijn essentieel voor cellulaire overleving. Om deze beperking te overwinnen, van de Wetering et al. 12. Wijzigde de shRNA expressievector pSUPER 5 </sup&gt; door toevoeging van een TO in het promoter gebied, waardoor ze om stabiele cellijnen met tetracycline-induceerbare uitputting van hun doelgenen van belang genereren. Hier beschrijven we een methode om efficiënt genereren stabiele humaan Tet-on cellijnen die betrouwbaar rijden of induceerbare overexpressie of uitputting van het gen van belang. Met deze methode, hebben we met succes gegenereerd Tet-on cellijnen die significant de analyse van de MST / hMOB / NDR cascade vergemakkelijkt centrosoom 13,14 en 15,16 signalering van apoptose. In dit rapport beschrijven we onze vectoren van keuze naast beschrijven twee opeenvolgende stappen van manipulatie die noodzakelijk zijn om efficiënt genereren menselijke Tet-on cellijnen (figuur 2). Bovendien naast waarin een protocol voor het genereren van menselijke Tet-on cellijnen bespreken we kritische aspecten van de technische procedures en karakterisering van Tet-on cellen.

Een voorbeeld voor de initiële karakterisering van RPE-1 cellijnen die stabiel TetR is weergegeven in figuur 4. Merk op dat alle klonen RPE-1 expressie verschillende niveaus van TetR (vergelijk lanen 2 en 5), terwijl de ouderlijke cellijn (dat als negatieve controle) drukt niet de exogene TetR eiwit (Figuur 4, baan 1). Deze variatie in TetR uitdrukking onder RPE-1 Tet-on celklonen verwacht, omdat de expressie van de TetR expressie plasmiden is sterk afhankelijk van het plasmide integrat...

Een snelle en eenvoudige manier om humane cellijnen met induceerbare en omkeerbare cDNA overexpressie of shRNA-gemedieerde knock-down van het gen van belang genereren. Deze methode kunnen onderzoekers betrouwbaar en zeer reproduceerbaar manipuleren cellijnen die moeilijk te veranderen door transiënte transfectie methoden of conventionele knockdown / knockout strategieën.

Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline-induceerbare expressie van s-h-r-n-a of cdna. Transfect eerst de doelcellen met het tatar-expressieplasmid en selecteer op blastercide-resistentie. Selecteer vervolgens individuele kolonies en screen op cellen die het Tet-repressorproteïne stabiel tot expressie brengen.Transfect vervolgens de best teta-exprimerende kloon met plasmiden die zijn ontworpen om de expressie van het doelgen te moduleren onder controle van het Tet-responselement-cultuur. Selecteer vervolgens enkelvoudige kolonies uit de getransfecteerde cellen onder dubbele selectie en screen deze op de gewenste Teton-klonen via western blotting. Uiteindelijk kunnen de resulterende Teton-klonen worden gebruikt om de impact van specifieke targets op geselecteerde biologische parameters te onderzoeken.De procedure zal worden gedemonstreerd door postdoc Marty Gomez Martinez in het laboratorium. Genereer een vector die de expressie van de Tet-repressor en het Blain-resistentiegen aanstuurt vanaf dezelfde CMV-promotor. Zaai in twee weefkweekplaten van 10 centimeter één keer centraal zes cellen in standaard groeimedium: één plaat voor transfectie met een tatar-expressieplasmid en de andere als negatieve controle voor Blain-selectie. Transfect de volgende dag één plaat met 2 µg TTA-expressieplasmid met behulp van FU gene six.Volg de instructies van de fabrikant en incubeer de cultuur vervolgens gedurende de nacht naast beide platen. Voeg na 24 uur standaard groeimedium toe met de optimale concentratie blastocidine voor de gebruikte experimentele cellijn, oogst de cellen en label vervolgens 10 centimeter platen voor seriële verdunning; ga daarna over tot het uitplaten van duplicaten van de seriële verdunning met gebruik van standaard groeimedium met vijf microgram per milliliter blastocidine, waarbij u ervoor zorgt dat de platen met de niet-getransfecteerde of de getransfecteerde cellen correct worden gelabeld. Monitor de cellen en stel specifiek vast dat alle cellen op de niet-getransfecteerde platen binnen de eerste week zijn gestorven.Vervang het selectiemedium elke twee tot drie dagen na één tot twee weken, zodra de blaster-resistente kolonies verschijnen. Selecteer platen die tussen de vijf en 50 kolonies bevatten om te garanderen dat individuele kolonies kunnen worden opgepikt wanneer deze een diameter van ongeveer vijf millimeter hebben bereikt. Isoleer ten minste 12 onafhankelijke klonen door individuele kolonies op te pikken met behulp van klooncilinders.Transfereer elke kloon naar een aparte put van een 24-wellplaat en kweek de cellen tot confluentie. Oogst de cellen van elke kolonie en transfereer deze naar individuele putten van een zes-well weefselkweekplaat. Ga door met het kweken van de klonen in selectiemedium zodra de culturen confluent zijn.Verdeel de cellen van elke put over twee individuele putten van een zes-puts weefselkweekplaat. Vries voor elke te testen kloon één put met confluente cellen in. Oogst de cellen uit de tweede put voor de evaluatie van de tatar-proteïne-expressie.Voer een western blot uit op de klonen met gebruik van een lysaat van de ouderlijke cellijn als negatieve controle om het tatar-eiwit te detecteren. Gebruik het muis monoklonale anti Tet zero two-antilichaam. Ga verder met het expanderen van de drie klonen met de hoogste testar-expressie.Bevries zo snel mogelijk stocks van elke veelbelovende kloon. De clonale cellen zijn nu klaar voor het onderzoek van de moleculaire en cellulaire parameters van uw interesse. Selecteer, door de ouderlijke cellijnen te vergelijken met de tatar-expresserende klonen, de beste kloon met de hoogste tatar-expressie die geen wijzigingen vertoont in de relevante moleculaire en celbiologische parameters.Genereer PTER-plasmiden met de gewenste HRNA-inserts. Constructeer daarnaast een PT REX desk 30-vector die het gewenste CDNA bevat met behulp van gateway-technologie. Transfecteer de ouderlijke doelcellijn transiënt met PTER- of P T-Rex S 30-plasmiden.Gebruik de transfectiereagentia naar keuze. Oogst vervolgens de getransfecteerde cellen en evalueer de expressie van het doelgen via immunoblots. Zaai op dag één twee platen van de kloon met de beste expressie in standaard groeimedium aangevuld met gecertificeerd tetracycline-vrij serumcultuur overnacht.Transfect de volgende dag slechts één plaat met twee microgram A-S-H-R-N-A of CDNA-expressieplasmide met behulp van FU gene six. Voeg op dag drie standaard groeimedium toe dat ofwel vijf microgram per milliliter blasticine en 500 microgram per milliliter eosin bevat, of blasticine en G 418. Splits vervolgens op dag vier de cellen om dubbele platen van verdunningen te maken met behulp van standaard groeimedium voor dubbele selectie.Controleer de cellen dagelijks op celsterfte als reactie op de antibioticabehandeling en ververs het medium elke drie tot vier dagen. Na twee tot drie weken, wanneer er blاستer aside in zein of blاستer aside in G four 18 dubbelresistente kolonies beginnen te verschijnen.Selecteer de platen die vijf tot 50 kolonies bevatten om individuele kolonies te isoleren en te kweken totdat de kolonies een diameter van ongeveer vijf millimeter of groter hebben bereikt. Gebruik klooncilinders om individuele kolonies te plukken en over te brengen naar afzonderlijke wells van een 24-wells weefselkweekplaat. Kweek de klonen in medium dat onderhoudsconcentraties bevat van 5 µg/mL blasticidine en 50 µg/mL hygromycine.Eosin of blaster soin en G four 18. Wanneer confluent, splits de cellen uit elke put in één enkele put van een zeswellige weefkweekplaat. Wanneer confluent, splits de cellen in drie putten van een zeswellige plaat om ze tot 100% confluentie te kweken.Bevries de cellen uit één well om de induceerbare expressie te testen; voeg één microgram per milliliter tetracycline toe aan één well en laat de tweede well met cellen onbehandeld. Incubeer gedurende 24 tot 96 uur zonder tetracycline, waarbij de kortere tijdsintervallen worden gebruikt voor het screenen van de inductie van CD NA-expressie en de langere tijdsintervallen voor het bepalen van de S-H-R-N-A-gemedieerde uitputting van endogene eiwitten. Oogst vervolgens de cellen en bereid deze voor op immunobloting met gebruik van de geschikte antilichamen.Selecteer ten minste twee klonen met de gewenste depletie of overexpressie en breid elke cultuur uit. Vergeet niet om zo snel mogelijk vriesvoorraden van elke veelbelovende kloon aan te leggen. Deze initiële karakterisering van een menselijke retinaal epitheliale cellijn voor stabiele expressie van tatar laat zien dat alle RPE one-klonen variërende niveaus van tatar tot expressie brengen.Zoals verwacht tot expressie brengt de ouderlijke RPE one cellijn het exogene tatar-eiwit niet. De variatie in Tet R-expressie tussen de RPE one Teton cellclonen weerspiegelt de integratieplaatsen van het plasmide. Dit experiment karakteriseert stabiele RPE one Teton cellclonen die RNA's tot expressie brengen gericht tegen de MST three kinase; drie cellclonen werden gekozen voor verdere analyse.Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u stabiele menselijke cellijnen kunt genereren met een ongereguleerde expressie van het onderzochte RNA of cDNA van uw interesse.

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.

Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR's) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Dit protocol fungeert als een regeling voor de oprichting van een functioneel Tet-ON systeem in cellijnen van kanker en het latere gebruik ervan, in het bijzonder voor de studie van de rol van tumor cel afkomstige eiwitten in de aanwerving van monocyten/macrofagen aan de communicatie van de tumor.

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Hier presenteren we een tool die kan worden gebruikt om de posttranscriptional modulatie van een transcript in primaire alveolar epitheelcellen te bestuderen met behulp van een induceerbaar expressiesysteem gekoppeld aan een pipet elektroporatietechniek.

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.

Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie

Leer hoe u stabiele humane cellijnen genereert met tetracycline-induceerbare shRNA- of cDNA-expressie. Deze methode maakt betrouwbare genmanipulatie mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression

Meer video's verkennen