Evaluatie van Respiratory System Mechanics in Muizen met behulp van de Gedwongen Oscillatie techniek
15 mei 2013
Het huidige protocol bevat een gedetailleerde stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om metingen van de ademhalingswegen mechanica, alsmede de beoordeling van de luchtwegen voor geïnhaleerde methacholine in muizen met behulp van de geforceerde oscillatie techniek (flexiVent voeren procedures; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).
Het algemene doel van deze procedure is om geforceerde oscillatiemetingen van respiratoire mechanica bij muizen te demonstreren met behulp van de flex event, een commercieel computergestuurde zuigerventilator. Dit wordt gedaan door de beoordeling van luchtwegresponsiviteit op geïnhaleerd methylcholine. De eerste stap is om de vereiste reagentia, de apparatuur en het onderwerp voor te bereiden.
Vervolgens wordt het onderwerp aangesloten op de ventilator voor mechanische ventilatie en metingen van respiratoire mechanica. Met behulp van een vooraf gedefinieerd script wordt een verzameling zeer gecontroleerde geautomatiseerde metingen gemaakt bij baseline en na methylcholine uitdaging. Analyse van de resultaten kan luchtweghyperresponsiviteit tonen, zoals gemerkt door de grotere maximale reacties van weerstand en elastine bij chloor blootgestelde muizen vergeleken met controle onderwerpen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het een nauwkeurige tool biedt om longfunctie op een uitgebreide, gedetailleerde en translationele manier te meten. Dit wordt bereikt door de analyse van druk- en volumesignalen verkregen in reactie op vooraf gedefinieerde oscillerende luchtstroomgolven toegepast op de luchtwegopening van het onderwerp. Bovendien kunnen veel factoren die de fysiologische respons beïnvloeden, worden gecontroleerd en gestandaardiseerd.
Gebruik deze methode, Schakel het Flex event FX-systeem in en start de software. Het huidige protocol is van toepassing op een van de twee flex event-generaties die worden ondersteund door flexi. Draag zeven software bij de eerste experimenteer sessie of op elk moment vóór deze Open de studiedefinitie en planningsmodule om de studiestructuur vooraf te definiëren.
Klik op de knop voor het maken van een nieuwe studie en volg de wizard om een studie te maken. Beschrijf het protocol en definieer de experimentele groepen en onderwerpen die worden bestudeerd. Start een experimenteer sessie door de experimenteer sessiemodule te openen en de opstartsequentie te volgen.
Voor studie- en sjabloonselectie. Wijs een onderwerp toe aan de meetlocatie en bevestig het gewicht. Ga verder met de kalibratie van het systeem door de stappen in de bedieningssoftware te volgen.
Er komt een prompt om de te gebruiken canule aan de Y-slang voor kalibratie te bevestigen. Ga door met de kalibratie van de canule door de stappen in de kalibratiewizard te volgen en controleer of de verkregen kalibratiewaarden binnen het opgegeven bereik liggen. Indien nodig, herhaal het kalibratieproces tenzij klaar, annuleer de prompts om ventilatie en gegevensopname te starten.
Deze kunnen op een later moment worden gestart. Anesthesiseer het onderwerp met geschikte doses anesthesiemiddelen. Controleer of het onderwerp een chirurgisch niveau van anesthesie heeft bereikt.
Het onderwerp mag geen reactie vertonen op een teenprik en de ademhaling moet regelmatig en niet benauwd zijn. Plaats het dier rugligging met een warmtebron om de juiste lichaamstemperatuur te behouden. Een 60 watt lamp geplaatst op 45 centimeter van de muis is voldoende.
Reinig vervolgens het keelgebied met alcohol om de luchtpijp bloot te leggen. Maak een insnijding en scheid voorzichtig de submaxillaire klier en de spierlaag die deze bedekt. Til de luchtpijp voorzichtig op met behulp van een paar microtang.
Breng vervolgens een hechtdraad eronder aan. Snijd tussen de twee kraakbeenringen die het dichtst bij de larynx liggen. Dit maakt een kleine insnijding in de luchtpijp zonder deze te snijden.
Breng de gekalibreerde canule in de insnijding en breng deze voorzichtig door vijf tracheale ringen. In dit voorbeeld is een 1,2 centimeter metalen 18 gauge canule in gebruik. Het is van cruciaal belang om de canule met behulp van de hechtdraad vast te zetten.
De bevestiging moet een luchtdichte afdichting rond de canule vormen. Breng het canuleerde dier dicht bij de ventilator. Start de mechanische ventilatie door een vooraf gedefinieerd of een aangepast ventilatieprofiel te selecteren in de ventilatie docker.
Verbind nu het dier met de ventilator via de Y-slang. Lijn het dier zorgvuldig uit met de ventilator en zorg ervoor dat de tracheale canule op hetzelfde niveau als de ventilator staat. Dit voorkomt een mogelijke canule, occlusie of tracheale twist in de software.
Voer een diepe inflatieperturbatie uit door op de naam van de perturbatie te dubbelklikken om de canule-inbreng en -bevestiging te verifiëren. Tenzij er een lek is, zal het systeem een druk van 30 centimeter water houden gedurende een periode van drie seconden zonder overmatige volumeverplaatsing. De geregistreerde volume- en druksporen moeten soepel zijn zonder tekenen van offset of vervorming.
Anders kan er op dit punt een canule, obstructie of verplaatsing zijn. Vitale signaaltransducers voor hartslag en lichaamstemperatuurbewaking kunnen indien nodig worden aangesloten. Gegevensopname van deze signalen kan op elk moment worden gestart, hetzij handmatig of automatisch via een script.
Metingen of opdrachten voor het activeren van de vernevelaar, gebeurtenismerken en dergelijke kunnen worden geautomatiseerd met behulp van vooraf gedefinieerde of aangepaste scripts voor een zeer gecontroleerd en herhaalbaar experimenteel proces. Zes families van perturbaties die aanleiding geven tot een aantal parameters kunnen worden gebruikt om de mechanica van het ademhalingssysteem van het onderwerp bij baseline en na een bepaalde uitdaging te beschrijven. Wanneer u klaar bent om metingen te starten, is het belangrijk om eerst de diepe inflatieperturbatie uit te voeren om gesloten longgebieden te werven en de longvolumegeschiedenis te standaardiseren.
Verifieer vervolgens de afwezigheid van spontane inspiratiepogingen door een testmeting uit te voeren. Observeer de druksignalen in de geselecteerde datasetweergave. Met stapgewijze PV-curves.
Drukplateaus moeten goed gedefinieerd zijn zonder neerwaartse uitwijkingen. Een neerwaartse zwaai in de druk zou een inspiratiepoging van het dier aangeven. Start nu het script voor de beoordeling van luchtwegresponsiviteit op geïnhaleerd methylcholine door op de titel te dubbelklikken.
In dit voorbeeld maakt het script een reeks baselinemetingen in drievoud. Vervolgens is er een prompt om de vernevelaar met zoutoplossing te laden. Of in dit voorbeeld, een oplossing van methylcholine laad
Overzicht
Dit protocol beschrijft de procedures voor het meten van de mechanica van het respiratoire systeem en het beoordelen van de responsiviteit van de luchtwegen op geïnhaleerde methacholine bij muizen met behulp van de geforceerde oscillatietechniek (flexiVent). Deze methode maakt nauwkeurige en gecontroleerde metingen van de longfunctie mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Respiratoire fysiologie
- Diermodellen
- Meettechnieken
Achtergrond
- De techniek van geforceerde oscillatie biedt een niet-invasieve methode om de longfunctie te beoordelen.
- Methacholine wordt gebruikt om hyperreactiviteit van de luchtwegen te evalueren.
- Het flexiVent-systeem maakt een nauwkeurige controle van ventilatieparameters mogelijk.
- Standaardisatie van fysiologische reacties is cruciaal voor de reproduceerbaarheid.
Doel van de studie
- Om de metingen van geforceerde oscillatie van de respiratoire mechanica te demonstreren.
- Om de responsiviteit van de luchtwegen in een gecontroleerde experimentele opstelling te beoordelen.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in de respiratoire fysiologie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van reagentia en apparatuur voor het experiment.
- Mechanische ventilatie van het proefdier met behulp van het flexiVent-systeem.
- Geautomatiseerde metingen van de respiratoire mechanica bij baseline en na methacholine-provocatie.
- Data-analyse om de reactiviteit van de luchtwegen en de longfunctie te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van luchtweghyperreactiviteit bij behandelde muizen.
- Nauwkeurige metingen van de weerstand en elastantie in respons op methacholine.
- Gestandaardiseerde protocollen verbeteren de reproduceerbaarheid van de resultaten.
- Demonstratie van de voordelen van de flexiVent ten opzichte van traditionele methoden.
Conclusies
- De geforceerde oscillatietechniek is effectief voor het beoordelen van de respiratoire mechanica.
- Dit protocol biedt een uitgebreide aanpak voor onderzoekers.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie voor verdere inzichten in de respiratoire fysiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De techniek van geforceerde oscillatie (FOT) biedt een translationeel instrument voor het beoordelen van de longfunctie in preklinische modellen, waardoor mechanistische risicoreductie van respiratoire targets mogelijk wordt. Door kwantitatieve, reproduceerbare metingen van de mechanica van het ademhalingsstelsel te leveren, ondersteunt FOT de targetvalidatie en het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase. Deze benadering helpt bij het karakteriseren van ziektemodellen en het screenen van verbindingen op hyperreactiviteit van de luchtwegen, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van respiratoire therapieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door veranderingen in de luchtwegweerstand en elastantie te kwantificeren als reactie op een methacholine-provocatietest.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde, geautomatiseerde metingen die de variabiliteit verminderen en reproduceerbare beoordelingen van de target-engagement ondersteunen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert biologische risicoreductie door nauwkeurige fenotypering van de longmechanica in ziektemodellen, wat helpt bij de triage van de portfolio.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, dosis-responsgegevens over de luchtwegfunctie, wat betrouwbare screening van verbindingen op bronchodilatatoire of bronchoconstrictieve effecten mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays via vooraf gedefinieerde ventilatieprofielen en geautomatiseerde perturbatiescripts, waardoor consistentie tussen experimenten wordt gewaarborgd.
- Schaalbaarheid: Het flexiVent-systeem maakt high-throughput, reproduceerbare metingen mogelijk, wat het hergebruik van het platform in workflows voor respiratoir onderzoek faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door klinisch relevante metrieken voor de longfunctie te bieden die menselijke pulmonale beoordelingen weerspiegelen.
- Mechanistische risicovermindering: Verdeelt de longrespons in luchtweg- en weefselcompartimenten, wat helpt bij het identificeren van de getroffen longregio's en het werkingsmechanisme.
- Karakterisering van ziektemodellen: Maakt vergelijking mogelijk tussen naïeve modellen en modellen met oxidatieve stress (bijv. chloorexponeerde muizen) om de pathofysiologische relevantie te valideren.
Integratie van Pipeline & Workflow
FOT is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische effectiviteitstests, in het bijzonder voor respiratoire indicaties waarbij longmechanica een belangrijke biomarker vormen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door veranderingen in resistentie en elastantie te meten na farmacologische of genetische perturbaties.
- Screening: Biedt assay-gereedheid via gestandaardiseerde, geautomatiseerde read-outs van de longfunctie die een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maken.
- Analytics: Levert kwantitatieve resultaten, waaronder resistentie, elastantie, weefstompingscoëfficiënt en determinatiecoëfficiënt, wat vergelijkende analyses tussen verschillende condities faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door translationele biomarkers van de longfunctie aan te bieden die in vivo responsen voorspellen.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor meerdere projecten die luchtwegziekten, fibrose of door toxische stoffen geïnduceerd longletsel bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij beoordelingen van de longfunctie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door systeemkalibratie, gestandaardiseerde ventilatie en geautomatiseerde gegevensverwerving.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door objectieve, kwantitatieve eindpunten voor hyperreactiviteit van de luchtwegen te bieden.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van longfunctieprofielen, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de respiratoire fysiologie, anesthesie en chirurgische technieken voor tracheale canulatie bij muizen.
- Afhankelijk van instrumentatie zoals het flexiVent-systeem, nebulisatoren en transducers voor het monitoren van druk, volume en vitale functies.
- Maakt cross-team standaardisatie van ventilatieprofielen, challenge-protocollen en data-analysepipelines noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het toepassen van de techniek op verschillende muizenstammen, ziektemodellen of blootstellingsparadigma's.
- Omvat praktische beperkingen zoals de noodzaak van nauwkeurige plaatsing van de canule, lekvrije afdichtingen en een gecontroleerde anesthesiediepte om storende ventilatiepogingen te voorkomen.
