Optogenetic Activering van zebravis Somatosensorische Neuronen met chef-tdTomato

Het algemene doel van deze procedure is het activeren van enkele somatosensorische neuronen bij zebravislarven. Dit wordt bereikt door eerst een optisch kabel voor te bereiden en deze aan te sluiten op een A-D-P-S-S blauwe laser. De tweede stap is het injecteren van het transgeen in embryo's van één tot twee cellen.

Vervolgens zoek je vet embryo's uit die C-H-E-F-T-D tomaat in somatosensorische neuronen uitdrukken en monteer ze inus. De laatste stap is het leveren van een korte puls blauw licht voor activering van een enkele neuron en het opnemen van het resulterende gedrag. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die gebruik maken van kanaalwortel Optie twee is dat deze aanpak kan worden gebruikt om gedragsreacties op te roepen van enkele neuronen die tot minstens vier dagen na ziekenhuisopname geactiveerd zijn.

Hoewel deze methode wordt gebruikt om inzicht te geven in de functie van specifieke somatosensorische neuronen bij zebravislarven. Deze aanpak kan ook worden aangepast om gedragingen te bestuderen die worden veroorzaakt door elke populatie zebravisneuronen, zoals innervate neuronen of motorneuronen. Deze genetische aanpak kan worden gebruikt om specifieke neuronen in vivo te activeren, functionele ontwikkeling te karakteriseren, de effecten van mutaties of fenomenologische blokkade van specifieke eiwitten op gedrag te beoordelen en neuraal netwerken die tot verschillende gedragsreacties leiden in kaart te brengen.

Om met deze procedure te beginnen, creëer je een opslageenheid voor de optische kabel door de taps toelopende hals van een glas te smelten. Een pastapipet over een bunts en brander om een hoek van 150 graden te maken. Vervolgens snijdt u met behulp van een draadsnijder of scheermes de optische kabel voorzichtig in twee stukken.

Elk stuk moet een blootliggende uiteind en een uiteinde met een FC PC-adapter hebben. Strip vervolgens de optische kabel tot aan de mantel door de glasverhoger, versterkende vezels en coating te verwijderen vanaf 5,0 centimeter vanaf het gesneden uiteinde van de kabel. Plaats vervolgens de optische kabel in de voorbereide pastapipet.

Zorg ervoor dat de kabel gemakkelijk in en uit de punt van de pipet kan bewegen met behulp van een diamantschijf of een pincet met een fijne punt. Snip het glasvezel en breek het uiteinde af om een schone snede aan het uiteinde van het vezel te maken. Trek vervolgens de optische kabel terug in de pastapipet.

Vervolgens positioneer je de optische kabel in de pastapipet met behulp van een micromanipulator onder de microscoop. COATE 24 tot 48 HPF embryo's handmatig met behulp van een pincet. Anesthetiseer vervolgens de larven met behulp van 0,02% trica met behulp van een fluorescent dissectiemicroscoop. Identificeer de larven met Ron Beard neuron of trigeminale neuron expressie. Embryo's met schaarse expressie in gemakkelijk te identificeren cellen zijn optimaal, maar individuele neuronen zullen worden aangewezen voor activering met een glasvezelkabel, dus een breed scala aan expressiedichtheid is acceptabel. Breng de larven over naar een nieuwe schaal met vers PTU blauw embryowater.

Bewaar de embryo's bij 28,5 graden Celsius in het donker tot de gewenste experimentele fase. Maak in deze sectie 1,5% lage maltase en dubbel gedistilleerd water en bewaar in een warmteblok van 42 graden Celsius om te voorkomen dat het stolt. Gebruik een glazen pastapipet om een van de vooraf gescreende larven over te brengen in een buis met 1,5% lage smelt agarose met zo min mogelijk blauw embryowater.

Breng vervolgens de larve in een druppel agarose aan op een kleine petrischaal. Positioneer de lava onder een dissectiemicroscoop met de dorsale zijde omhoog wanneer de aros gestold is. Gebruik een dunne scheermes om aros van beide zijden van de lava weg te snijden.

Vul het gebied rond de aros met embryo blauw water. Maak vervolgens twee diagonale sneden aan beide zijden van de dooier, zorg ervoor dat je de lava niet snijdt. Trek vervolgens de agrow weg van de romp en de staart van de lava.

Monteer nu de hoge snelheidscamera op de dissectiescoop en sluit de camera aan op de computer. Zet vervolgens de computer en de hoge snelheidscamera aan. Open de video-imagingsoftware en pas de camera-instellingen aan.

Verbind vervolgens de optische kabel, de laser en de stimulator met elkaar. Zet vervolgens de stimulator aan en stel deze in op maximaal vijf volt en een pulsduur van vijf milliseconden. Zet vervolgens de laser aan.

Gebruik vervolgens de fluorescente dissectiemicroscoop om de punt van de optische kabel in de buurt van een neuroncellichaam met C-H-E-F-T-D tomaat expressie te positioneren. Lever een puls van blauw licht om de sensorische neuron te activeren. Neem vervolgens de reacties op met behulp van een hoge snelheidscamera.

Stel op 500 of 1000 frames per seconde in en herhaal het experiment met minimaal een minuut tussen activeringen om habituatie te voorkomen, om de lava vrij te geven vóór deel, de Aris met een pincet, en wees voorzichtig om het dier niet te beschadigen. Breng het vervolgens over in vers blauw embryowater. De dieren kunnen verder worden ontwikkeld en de procedure kan op oudere stadia worden herhaald.

Het embryo kan ook opnieuw worden gemonteerd voor hoogwaardige confocale beeldvorming van de geactiveerde cel om het gedrag te correleren met de cellulaire structuur. De zebravislava die hier is gediagrammatiek is gedeeltelijk gemonteerd in 1,5% lage smelt Aris, voorgesteld door de stippellijnen rond zijn rostrale deel. Een trigeminale neuron en een Rohan beard neuron zijn afgebeeld in rode mondholte cellen zijn omlijnd door de stippellijnen in de illustratie.

Hier is een film die laat zien dat de activering van een enkele Rohan beard neuron dat C-H-E-F-T-D tomaat uitdrukt in een ongeveer 35 HPF lava een gedragsreactie oproept. Deze film toont de activering van C-H-E-F-T-D tomaat uitdrukkende Rohan beard neuronen in een 60 HPF lava, en deze film toont de activering van C-H-E-F-T-D tomaat expressie Rohan beard neuronen in een vier DPF lava. Eenmaal beheerst. Deze genische aanpak kan in minder dan een uur worden uitgevoerd.

Na het