Name: Optogenetic Activering van zebravis Somatosensorische Neuronen met chef-tdTomato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer optogenetische activering van enkele somatosensorische neuronen in larven van Danio rerio met blauwe laserpulsen. Deze methode maakt gedragsstudies op individueel celniveau mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Fumi Kubo, Tod Thiele en HerwigBaier (UCSF / Max Planck Instituut) om advies over het gedrag van experimenten en DPSS laser ingesteld; Heesoo Kim en Chiara Cerri uit de MBL Neurobiologie cursus om te helpen bij Chef-tdTomato experimenten; PetronellaKettunen (Universiteit van Göteborg ) voor de eerste samenwerking op het optogenetic experimenten; bouwen en Roger Tsien (UCSD) voor de chef-tdTomato; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca en John Milligan (UCLA) voor technisch advies. Dit werk werd ondersteund door een NRSA (5F31NS064817) gunning aan AMSP en een subsidie ​​van de NSF (RIG: 0819010) naar AS.

Bereid de volgende van tevoren. 1. Bereid Optic Cable <ol><li> Maak een geheugen voor de opslag van de optische kabel door het smelten van de taps toelopende hals van een glazen Pasteur pipet over een bunsenbrander met een ~ 150 ° hoek te maken. </li><li> Met behulp van een kniptang of een scheermesje, snijd voorzichtig de optische kabel in twee stukken. Elk stuk moet het ene uiteinde een FC / PC-adapter en een open einde. Bewaar een stuk als reserve kabel. </li><li> Strip de optische kabel naar de bekleding door verwijderen van de vezel en mantel versterking vezels (Figuur 1A) van 5,0 cm afgesneden uiteinde van de kabel. </li><li> Steek glasvezelkabel in de voorbereide Pasteur pipet. Zorg ervoor dat kabels kunnen gemakkelijk in-en uit te gaan van de pipetpunt. </li><li> Met optische kabel uitsteken van de punt van Pasteur pipet voorzichtig geknipt en vezel bekleding te verwijderen uit de hele glasvezel, ~ 2 mm van afgesneden uiteinde. </li><li> Met behulp van een diamant pen / glassnijder, de glasvezel nick en breken off het einde van een zuivere snede / grond aan het einde van de vezel (Figuur 1B) maken. </li><li> Trek optische kabel in Pasteur pipet voor opslag. Herhaal stap (1,6) als punt van optische vezel wordt afgebroken of breekt ongelijk. </li><li> Positie glasvezelkabel in Pasteur pipet met een micromanipulator (Figuur 1C). </li></ol> Procedures 2-8 beschrijven een werkwijze voor het injecteren van transgenen in embryo algemeen voor vele zebravis experimenten. Variaties op deze methode, zoals die beschreven in andere Jupiter&#39;s 6, 7, 8, 9, 22 zijn even effectief. 2. Trek injectienaalden <ol><li> Met behulp van een naald trekker, trek borosilicaatglas buis in twee injectienaalden met een geleidelijk taps toelopende tip. Puller instellingen variëren. (Op een Sutter Instruments naald trekker gebruiken we instellingen: P = 500, warmte = 720, Pull = 50, Velocity = 70 en Time = 150). Elke naald trekker is anders, dus optimaliseren trekker instellingen empirically. Voor meer taps toelopende naalden, verhoging van de warmte-en / of trekken. Voor minder taps toelopende naalden, verhogen Tijd en / of afname Pull. </li><li> Bewaar naalden in een beveiligde container (dat wil zeggen een petrischaal met opgerolde tape, zelfklevende kant naar buiten). </li></ol> 3. Giet Spuitgietmatrijzen <ol><li> Smelt 0,5 g agarose in 30 ml embryo / blauw water, totdat agarose volledig is opgelost. </li><li> Giet in onderste helft van een petrischaal. </li><li> Plaats rechthoekige vorm met montage putten (figuur 2) in agarose, zorg dat de blaasvorming te beperken rond de putten. </li><li> Laat agarose te stollen. </li><li> Verwijder schimmel en vul petrischaal met blauw / embryo water. </li><li> Rechtop bewaren, met schoon water, bij kamertemperatuur voor dezelfde dag gebruik of bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ol> 4. Maak Plasmide DNA Mix voor injecties <ol><li> Plasmide DNA verdund tot een concentratie van 50 ng / ul met 1:10 fenolrood in ddH 2 O. Voorvoorbeeld: <table border="1"><tbody><tr><td> 1,0 ml </td><td> plasmide DNA (250 ng / ml) </td></tr><tr><td> 0,5 ml </td><td> fenolrood </td></tr><tr><td> 3,5 ml </td><td> ddH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> DNA mix kan worden bewaard bij kamertemperatuur bij gebruik onmiddellijk of bewaard bij 4 ° C gedurende meerdere dagen. </li></ol> 5. Stel Mating paren Dit dient te gebeuren de avond voordat u van plan om injecties te doen. <ol><li> Vul fokkerij tanks met het systeem water en plaats mannelijke en vrouwelijke vissen samen. Als injecties niet zo snel worden uitgevoerd als lichten aan te steken in de faciliteit, aparte mannelijke en vrouwelijke vis met een scheidingswand. </li></ol> 6. Bereid je voor op Injecties (Kan worden gedaan tijdens het wachten voor embryo&#39;s) <ol><li> Zet druk injector rig. Zorg ervoor dat het systeem is ingesteld op puls. Begin met de pulsduur ingesteld op 1. </li><li> Zet de luchtklep enStel de druk injector tot ~ 20 psi. </li><li> Met behulp van een dissectie scope op het hoogste vergroting, breek punt van de naald met een pincet of een poker om een ~ 2 micrometer opening (Figuur 3, Movie 1) te creëren. </li><li> Vul naalden met DNA mix van: 1. Het plaatsen van de naald, tip zijde naar boven in de DNA-mix en laat de naald te vullen door capillaire werking of 2. Met behulp van een long-reach-tip tot 1-2 pi van het DNA pipetteer meng direct in de naald. </li><li> Plaats gevuld naald op een veilige plaats totdat klaar om te injecteren. </li></ol> 7. Verzamel embryo&#39;s <ol><li> Na installatie lichten zijn ingeschakeld, verwijdert u verdelers (indien van toepassing). Verzamel embryo&#39;s met een filter / kleine zeef en breng ze naar een petrischaal met fris blauw / embryo water. </li></ol> 8. Injecteer Embryo&#39;s op de 1-2 cellig stadium <ol><li> Overdracht geoogst embryo&#39;s spuitgietmatrijzen met behulp van een plastic pipet. </li><li> Met behulp van een dissectiemicroscoop, duw embryo&#39;s inputten met een pincet of een stomp poker (Figuur 4, Movie 2). </li><li> Plaats geladen naald in een micromanipulator en positie over embryo&#39;s. </li><li> Kalibreer injectievolume door het aanpassen van de pulsduur in 1-stappen van totdat u het gewenste volume (~ 1 nl). Dit kan worden gekalibreerd met een micrometer, zoals beschreven in een eerdere Jupiter&#39;s 8, 22, maar dit experiment precisie niet noodzakelijk, omdat een groot aantal injectievolumes resulteert in adequate expressie. </li><li> Injecteer ~ 1 nl DNA mix direct in de cel en herhaal voor alle embryo&#39;s. DNA kan ook worden geïnjecteerd in de dooier, maar dit schijnt minder efficiënt (figuur 5, Movie 3). </li><li> Verwijder geïnjecteerde embryo&#39;s van mal met behulp van een zachte stroom van blauw / embryo water. </li><li> Store geïnjecteerde embryo&#39;s op 28,5 ° C in het donker. </li><li> Periodiek verwijderen van onbevruchte, beschadigde of dode embryo&#39;s. </li><li> Behandel embryo with PTU tussen 18-24 hpf aan pigmentatie te voorkomen. </li></ol> 9. Scherm voor Transgene Expressie <ol><li> Handmatig dechorionate 24 tot 48 hpf embryo&#39;s met behulp van een tang. </li><li> Verdoven larven met 0,02% tricaine. </li><li> Met behulp van een fluorescerende dissectiemicroscoop, identificeren larven met RB of trigeminus neuron expressie en breng deze in een nieuw gerecht met verse PTU blauw / embryo water. Embryo&#39;s met dunne expressie in gemakkelijk te identificeren cellen optimaal, maar individuele neuronen worden gericht op activering met een glasvezelkabel zodat allerlei expressie dichtheid aanvaardbaar. </li><li> Bewaren embryo&#39;s bij 28,5 ° C in het donker totdat de gewenste experimenteel stadium. </li></ol> 10. Monteer Larven voor Gedrag Experimenten <ol><li> Maak 1,5% laag smeltpunt agarose in ddH 2 O en op te slaan in een 42 ° C warmte blok om te voorkomen dat stollen. </li><li> Met behulp van een glazen Pasteur pipet, overdracht een van de vooraf gescreend larven in een bade van 1,5% laag smeltpunt agarose met zo weinig blauw / embryo water mogelijk te maken. </li><li> Breng larven in een druppel agarose op een kleine petrischaal. </li><li> Onder een dissectiemicroscoop, positie larve dorsaal op. </li><li> Wanneer agarose is gestold, weggesneden de agarose met een dunne scheermesje (# 11 scalpel), waardoor een wig van agar rondom de hele larve. </li><li> Maak twee diagonale sneden aan beide zijden van de dooier; let op dat nick de larve. </li><li> Vul de omgeving van de agarose met embryo / blauw water. </li><li> Trek agarose van de stam en de staart van de larve (Figuur 6). </li></ol> 11. Bereid High-speed Camera and Imaging software <ol><li> Monteer high-speed camera op het ontleden van omvang. </li><li> Sluit de camera aan de computer. </li><li> Zet de computer. </li><li> Zet high-speed camera. </li><li> Open video / imaging software (We maken gebruik van AOS imaging software en zal de procedures beschreven voor het gebruik ervan hier, maar andere beeldvormendesoftware is even aanvaardbaar). </li><li> Pas de camera-instellingen dienovereenkomstig (dwz 1.000 frames per seconde (fps), 50% trekker buffer of andere voorkeursinstellingen op). </li><li> Start de opname. </li></ol> 12. Activeer Single Neuronen Met behulp van een 473 nm laser <ol><li> Bevestig stimulator, laser-en optische kabel. </li><li> Zet stimulator. </li><li> Stimulator ingesteld maximaal 5 volt en een pulsduur van 5 msec. </li><li> Schakel laser volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Gebruik een dissectiemicroscoop aan het uiteinde van de optische kabel bij cellichaam van een neuron met chef-tdTomato expressie (Figuur 6) positioneren. </li><li> Lever puls van blauw licht op zintuiglijke neuron te activeren. </li><li> Record gedrag met behulp van een high-speed camera in te stellen op 500 of 1.000 frames per sec. </li><li> Herhaal experiment naar wens, wacht 1 minuut tussen elke activering om gewenning te vermijden. (We minimaal drie reacties houden voor elk neuron). </li><li> Naarversie larven, los te wrikken uit elkaar agarose met een pincet, zorg ervoor dat u het dier verwonden. Dit dier kan worden toegestaan ​​verder te ontwikkelen en de procedure kan worden herhaald op latere stadium van de ontwikkeling van het gedrag karakteriseren. De embryo kan weer worden aangebracht voor hoge resolutie confocale beeldvorming van de geactiveerde cel gedrag correleren met celstructuur, zoals hieronder beschreven. </li><li> Overdracht larve tot cultuur plaat met verse blauwe / embryo water. We gebruiken een 24-well plaat bijhouden van individuele larven. </li></ol> 13. Afbeelding Neuron (s) met een confocale microscoop <ol><li> Verdoven larven met 0,02% tricaine. </li><li> Mount larven-, rug-kant naar boven, in 1,2% laag smeltpunt agarose of in een dorsale mal. </li><li> Afbeelding Chef-tdTomato neuronen met een 543 nm laser en geschikt filter en objectief. We maken gebruik van een 20x doelstelling. </li><li> Verwijder larven uit agarose en goed terug te gaan naar iemand met blauw / embryo water. </li><li> Bewaren bij 28,5 ° C in het donker voor de further analyse. </li></ol>

<ol><li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li>
<li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+behavior+elicited+by+single%2C+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li>
<li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li>
<li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689(2011).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217(2009).</li>
<li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722(2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394(2009).</li>
<li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li>
<li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol.+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li>
<li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financieel belang hebben.

We hebben beschreven een aanpak voor optogenetic activering van een RB neuronen in levende zebravis. Onze methode maakt gebruik van voorbijgaande transgenese een fluorescent gelabeld channelrhodopsin variant, chef-tdTomato 13, uit te drukken in specifieke somatosensorische neuronen. Deze benadering kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik in andere larvale zebravis celpopulaties. Met deze aanpak hebben we consequent gedragsreacties opgewekt 34-48 hpf larven uiten chef-tdTomato....

De ontwikkeling van optogenetic methoden voor het bevorderen of remmen van neuronale prikkelbaarheid met bepaalde golflengten is het mogelijk de functie van verschillende populaties van neuronen in neurale circuits controle gedrag 1, 19, 21 bestuderen. Deze techniek wordt vaak gebruikt om groepen van neuronen activeren, maar kan ook worden gebruikt om individuele neuronen activeren. Zebravis larven bijzonder vatbaar voor deze methoden omdat zij translucent, het zenuwstelsel ontwikkelt zich snel en het creëren van transgene dieren is snel en routine. Moet echter aanzienlijke technische obstakels worden overwonnen om betrouwbaar bereiken enkel neuron activatie. Om een ​​procedure voor optogenetic activering van enkele zebravis neuronen te optimaliseren, hebben we ons gericht op somatosensorische neuronen. Zebravis larven detecteren verschillende somatosensorische stimuli met twee populaties van neuronen: trigeminale neuronen, die het hoofd innerveren en ROHON-Beard (RB) neuronen, die de rest van het lichaam innerveren. Elke trigeminus en RB neuron projecteert een perifere axon die takken op grote schaal in de huid op prikkels en een centrale axon die verbinding maakt met downstream neurale circuits op te sporen. Dieren reageren op zo vroeg 21 uur na de bevruchting (HPF) aan te raken, wat aangeeft dat coherente somatosensorische circuits zijn 5 gevormd, 18. Tijdens de larvale ontwikkeling tenminste een driehoeks-en RB neuronen synaps op de Mauthner cel klassieke escape reacties activeren, maar geaccumuleerd bewijs suggereert dat er meerdere klassen van somatosensorische neuronen met verschillende patronen van verbindingen die opwekken variaties op de vluchtgedrag 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. De motivatie voor het ontwikkelen van deze werkwijze was het gedrag functie van verschillende klassen van somatosensorische neuronen karakteriseren, maar deze benadering kan in principe worden gebruikt om de functie van vrijwel elk neuron of populatie van neuronen in lar bestuderenval zebravis. Douglass et al.. Eerder beschreven een werkwijze voor het activeren Channelrhodopsin-2-expressie somatosensorische neuronen met blauw licht opwekken vluchtgedrag 3. Hun aanpak gebruikt een versterker element van de isl1 gen tot expressie van ChR2-EYFP rijden somatosensorische neuronen. Dit transgen werd echter gemeld relatief zwakke fluorescentie weergegeven, waarbij co-injectie van het reporter te UAS :: GFP, zodat visualisatie van cellen die ChR2-EYFP. Deze benadering werd gebruikt om het gedrag van responsen op te wekken tussen de 24 tot 48 hpf, maar kon nooit een reactie uitlokken Afgelopen 72 hpf. Terwijl deze methode werkt voor het bestuderen neurale circuits in zeer vroege larvale stadia (24-48 HPF) is onvoldoende voor het karakteriseren neurale circuits en gedragsreacties in oudere larven, wanneer meer diverse gedragsreacties duidelijk zijn en neurale circuits rijper. We zochten naarverbetering van de gevoeligheid van deze techniek om de functie van subpopulaties van neuronen larvale RB karakteriseren. Om expressie verbeteren we een somatosensorische-specifieke enhancer (CREST3) 20 tot expressie van LexA-VP16 en een gedeelte van LexA operatorsequenties (4xLexAop) 11 rijden naar de expressie van een fluorescent gelabeld licht geactiveerde kanaal amplificeren. Deze configuratie versterkte expressie van het kanaal, waardoor de noodzaak voor co-expressie van een tweede verslaggever en waardoor we de relatieve overvloed van het kanaal direct te bepalen in elk neuron. Met de LexA / LexAop sequentie hadden een bijkomende voordeel dat wij het transgen te introduceren in zebravis reporter lijnen die de Gal4/UAS systeem. Tijdelijke expressie van deze transgene resulteerde in variërende niveaus van expressie, maar was gewoonlijk sterk genoeg om zowel het cellichaam en axonale projecties van individuele neuronen te visualiseren gedurende meerdere dagen. Om handschoe optimaliserenheid aan het licht dat we het gebruikte licht geactiveerde kanaal chef-kok, een channelrhodopsin variant bestaat uit een hersenschim van channelopsin-1 (Chop1) en channelopsin-2 (Chop2) met een crossover site op helix-lus EF 13. Dit kanaal wordt geactiveerd op dezelfde golflengte als ChR2, maar vereist lagere lichtintensiteit voor activering, waardoor het gevoeliger dan andere veelgebruikte kanalen, waaronder ChR2. De chef-kok eiwit werd gefuseerd met het rode fluorescerende eiwit, tdTomato, waardoor we voor eiwitexpressie scherm zonder het activeren van het kanaal. Als lichtbron, gebruikten we een diode gepompte solid-state (DPSS) laser gekoppeld met een glasvezelkabel aan een nauwkeurige, krachtige puls van blauw licht leveren aan een specifiek gebied van de larven. Dit liet ons toe laserlicht gericht op individuele neuronen, waardoor de noodzaak voor het vinden van zeldzame transgene dieren die het kanaal in een neuron. Met behulp van deze aanpak zijn we in staat waren om een ​​RB neuronen te activeren, gedrags-respons op te nemens met een hoge snelheid video camera en beeld de geactiveerde neuronen hoge resolutie met confocale microscopie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materieel </td></tr><tr><td> Glas Pasteur pipet </td><td> Visser </td><td> 1367820B </td><td> of gelijkwaardig (10-15 mm diameter) </td></tr><tr><td> 200 urn glasvezel </td><td> Thorlabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Koord van het Flard, Lengte: 3 m, Einde A: FC / PC, End B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> 50 urn glasvezel </td><td> Thorlabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Koord van het Flard, Lengte: 3 m, Einde A: FC / PC, End B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Verstelbare Stripping Tool </td><td> Thorlabs </td><td> AFS900 </td><td> of Drie-Hole Stripping Tool (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamond Wedge schrijver </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipet Puller </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> P-97 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Borosilicaatglas buis met gloeidraad </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Spuitgietmatrijs </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Figuur 5 </td></tr><tr><td> 1,5 ml centrifugebuizen </td><td> Een </td><td> Een </td><td></td></tr><tr><td> Petrischaal (100x15 mm) </td><td> Een </td><td> Een </td><td></td></tr><tr><td> Petrischaal (60x15 mm) </td><td> Een </td><td> Een </td><td></td></tr><tr><td> Druk injector </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Micromanipulator en metalen standaard </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Wegwerp plastic pipetten </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Poker (Pin houder en Insect pin) </td><td> Fine Science Tools, Inc </td><td> 26.018-17 en 26.000-70 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Tang </td><td> Fine Science Tools, Inc </td><td> 11.255-20 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Microloader pipettips </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28,5 ° C incubator </td><td> een </td><td> een </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C warmte blok </td><td> Een </td><td> Een </td><td></td></tr><tr><td> Niet-steriele scalpel mesjes # 11 </td><td> Fijn Scientific Tools, Inc </td><td> 10.011-00 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Ontleden shet hoofd te bieden </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Fluorescerende ontleden scope met standaard filter </td><td> Een </td><td> een </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 of 710 </td><td> of gelijkwaardig met lasers voor GFP en RFP, en 10x, 20x en 40x objectieven </td></tr><tr><td> High speed camera </td><td> AOS Technologies, Inc </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> 473 nm draagbare laser </td><td> Crystal lasers </td><td> CL-473-050 </td><td> of hogere macht, met TTL optie </td></tr><tr><td> S48 Stimulator </td><td> Astro-Med, Inc Gras Instrument divisie </td><td> S48K </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> FC / PC naar FC / PC paring mouw </td><td> Thorlabs </td><td> ADAFC1 </td><td> Mei need voor optische kabelverbinding </td></tr><tr><td> Laser Safety Glasses </td><td> Thorlabs </td><td> LG10 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> 24 kweekplaten </td><td> Genesee </td><td> 25 tot 102 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Single depressie dia&#39;s </td><td> Visser </td><td> S175201 </td><td> Of gelijkwaardig </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Instant oceaan </td><td> Aquatische ecosystemen </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Methyleenblauw </td><td> Visser </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolrood </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> of gelijkwaardige </td></tr><tr><td> Low melt agarose </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; of gelijkwaardig </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> blauw / embryo water </td><td></td><td></td><td> 10 L 2 O ddH 0,6 g Instant Ocean 6 druppels methyleenblauw </td></tr><tr><td> fenolrood </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml in 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml 2 O ddH lossen bij 70 ° C, vaak schudden aliquot en bewaar bij -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml blauw / vis water </td></tr><tr><td> Tricaine stockoplossing </td><td></td><td></td><td> 400 mg tricaine 97,9 ddH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml 1 M Tris, pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; pH instellen op 7,0 ~ store in 4 ° C of -20 ° C voor lange termijn opslag </td></tr></tbody></table>

optogenetic activering van zebravis somatosensorische neuronen met chef-tdtomato

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Larvale zebravis zijn in opkomst als een model voor het beschrijven van de ontwikkeling en functie van eenvoudige neurale circuits. Vanwege hun externe bevruchting, snelle ontwikkeling en doorschijnendheid zijn zebravis bijzonder geschikt voor optogenetic benaderingen neurale circuitfunctie onderzoeken. In deze benadering worden lichtgevoelige ionenkanalen uitgedrukt in specifieke neuronen, waardoor de experimentator te activeren of te remmen op en zal derhalve evalueren hun bijdrage aan specifiek gedrag. Het toepassen van deze methoden in larvale zebravis is conceptueel eenvoudig, maar vereist de optimalisatie van de technische details. Hier tonen een procedure voor het tot expressie channelrhodopsin een variant in larvale zebravis somatosensorische neuronen, foto-activerende afzonderlijke cellen en het registreren van de resulterende gedrag. Door enkele wijzigingen eerder vastgestelde werkwijzen, kan deze benadering worden gebruikt om gedragsreacties ontlokken enkele neuronen geactiveerd uptot minstens 4 dagen na de bevruchting (DPF). Concreet hebben we een transgen met behulp van een somatosensorische neuron versterker, CREST3, om de uitdrukking van de gelabelde channelrhodopsin variant, chef-tdTomato rijden. Injecteren van deze transgen in 1-cel embryo&#39;s resulteert in mozaïek expressie in somatosensorische neuronen, die kunnen worden afgebeeld met confocale microscopie. Illuminating geïdentificeerd cellen in deze dieren met licht van een 473 nm laser DPSS, geleid door een glasvezelkabel, ontlokt gedrag dat kan worden opgenomen met een high-speed video camera en geanalyseerd kwantitatief. Deze techniek kan worden aangepast aan studie gedrag opgewekt door activeren van een zebravis neuron. De combinatie van deze aanpak met genetische of farmacologische storingen zal een krachtige manier om circuit vorming en functie te onderzoeken zijn.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Optische kabel set-up. (A) Lagen van een glasvezelkabel. (B) Stripped glasvezelkabel in een Pasteur pipet. (C) Glasvezelkabel in Pasteur pipet gepositioneerd met behulp van een micromanipulator. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Spuitgietmatrijs sjabloon. </...

Optogenetic technieken het mogelijk gemaakt om de bijdrage van specifieke neuronen te bestuderen. We beschrijven een werkwijze voor het activeren larvale zebravis enkele somatosensorische neuronen die een channelrhodopsin variant (CHEF) met een diode-gepompte vaste stof (DPSS) laser en registreren van gedrag opgewekt met een hoge snelheid video camera.

Optogenetic Activering van zebravis Somatosensorische Neuronen met chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Het algemene doel van deze procedure is het activeren van enkele somatosensorische neuronen bij zebravislarven. Dit wordt bereikt door eerst een optisch kabel voor te bereiden en deze aan te sluiten op een A-D-P-S-S blauwe laser. De tweede stap is het injecteren van het transgeen in embryo's van één tot twee cellen.Vervolgens zoek je vet embryo's uit die C-H-E-F-T-D tomaat in somatosensorische neuronen uitdrukken en monteer ze inus. De laatste stap is het leveren van een korte puls blauw licht voor activering van een enkele neuron en het opnemen van het resulterende gedrag. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die gebruik maken van kanaalwortel Optie twee is dat deze aanpak kan worden gebruikt om gedragsreacties op te roepen van enkele neuronen die tot minstens vier dagen na ziekenhuisopname geactiveerd zijn.Hoewel deze methode wordt gebruikt om inzicht te geven in de functie van specifieke somatosensorische neuronen bij zebravislarven. Deze aanpak kan ook worden aangepast om gedragingen te bestuderen die worden veroorzaakt door elke populatie zebravisneuronen, zoals innervate neuronen of motorneuronen. Deze genetische aanpak kan worden gebruikt

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

De temporele en ruimtelijke resolutie van de genetische manipulaties bepaalt het spectrum van biologische fenomenen die ze kunnen verstoren. Hier gebruiken we tijdelijk en ruimtelijk...

Targeting bulbus olfactorius Neuronen gebruik van Gecombineerd In Vivo Elektroporatie en Gal4-Based Enhancer Trap zebravis Lines

Deze video beschrijft optogenetische technieken door genetisch gemodificeerde somatosensorische neuronen te activeren en een opgewekte gedragsrespons op te nemen met een high-speed videocamera.

Zebravis optogenetica: het activeren van genetisch gemodificeerd somatosensorisch neuron om larvale gedragsreacties te bestuderen

In this video, we describe a phase separation assay, wherein intracellular proteins comprising intrinsically disordered regions fused to a photosensitive oligomerization domain are induced via blue-light exposure to self-associate into membrane-less liquid-like condensates.

Protein Phase Separation Assay: An Optogenetic Method for Mutant RNA-Binding Protein Phase Separation in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Hier schetsen we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om weefselspecifieke genregulatie te bereiken in de regenererende staartvin van een volwassen zebravis.

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel met uiteenlopende toepassingen. Dit protocol demonstreert hoe licht-induceerbare genexpressie in zebravisembryo's kan worden bereikt met behulp van het blauw licht-responsieve TAEL / C120-systeem.

Lichtgeïnduceerde GFP-expressie in zebravisembryo's met behulp van het optogenetische TAEL/C120-systeem

We beschrijven een protocol om faseovergang van TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) te induceren door licht in de spinale motorneuronen met zebravissen als model.

Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven

Optogenetische manipulatie van signaalroutes kan een krachtige strategie zijn om te onderzoeken hoe signalering wordt gedecodeerd bij ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van licht-zuurstof-spanningsgevoelige domeingebaseerde Nodale en botmorfogene proteïne (BMP) signaleringsactivatoren in het vroege zebravisembryo.

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

Leer optogenetische activering van enkele somatosensorische neuronen in larven van Danio rerio met blauwe laserpulsen. Deze methode maakt gedragsstudies op individueel celniveau mogelijk.

Optogenetic Activering van zebravis Somatosensorische Neuronen met chef-tdTomato

Meer video's verkennen